我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。
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本文内容
摘要
摘要
对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行多光谱荧光成像，能够在单个组织样本中检测多种标志物，从而提供有关抗原共表达及标志物空间分布的信息。然而，适用于福尔马林固定组织的合适抗体的缺乏，可能限制可检测标志物的种类。此外，染色方法耗时较长。本文介绍一种在冷冻组织上快速进行多光谱荧光成像的方法。该方法包括所用的荧光染料组合、小鼠和人类冷冻组织染色的详细步骤，以及扫描、图像采集和分析流程。染色分析采用一种 commercially available 半自动多光谱荧光成像系统。通过该方法，可在单个冷冻组织切片中实现多达六种不同标志物的染色与检测。机器学习分析软件可对细胞进行表型鉴定，用于定量分析。本文所述的冷冻组织检测方法，适用于那些在FFPE组织中无法检测或缺乏适用抗体的标志物。
引言
显微成像技术的最新进展极大地提升了我们对生物过程和疾病状态的认识与理解。通过显色免疫组织化学（IHC）在组织中原位检测蛋白质已在病理学中常规开展。然而，利用显色IHC染色同时检测多种标志物仍具有挑战性1 并且，利用多重免疫荧光（mIF）染色技术的新方法正在被开发，该技术可在单个组织样本上标记多种生物标志物。检测多种生物标志物具有重要意义，因为组织结构、细胞的空间分布以及抗原共表达等相关信息均可在单个组织样本中同时获得2多光谱荧光成像技术的应用使得多种生物标志物的检测成为可能。在该技术中，通过使用特定的光学元件，可将每种荧光染料的荧光光谱分离或区分。 "未混合"，从而实现多标志物检测且无任何光谱串扰3多光谱荧光成像正成为细胞生物学、临床前药物开发、临床病理学和肿瘤免疫谱分析中的关键技术方法4,5,6重要的是，免疫细胞（特别是CD8 T细胞）的空间分布可作为现有肿瘤患者的预后因素。7.
已开发出多种多重荧光染色方法，这些方法可同时或依次进行。在同时染色法中，所有抗体以混合物形式在单一步骤中加....
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方案
小鼠脾脏和HLF16小鼠肿瘤组织23 来自我们实验室。人扁桃体组织购自商业供应商。详细信息见下文 材料表.
1. 组织包埋
- 将新鲜组织包埋于OCT（最佳切割温度）溶液中，并使用干冰或液氮迅速冷冻。
- 在-80 °C下保存组织。
2. 冷冻切片
- 在恒冷切片机中以 -25 °C 的温度切 8 μm 的切片。
注意：可根据需要调整最佳切片厚度，以获得更清晰的图像。 - 将切片置于带电荷的玻片上。
- 室温（RT）下空气干燥切片 1 小时，随后用组织学级别的冰冻丙酮固定 10 分钟。
注意：丙酮可使水溶性蛋白质凝固并提取脂质，但对含碳水化合物的成分无显著影响。相比之下，甲醛可较好保存大多数脂质，对碳水化合物的影响较小24。固定剂的选择需根据待检测标志物的性质而定。 - 将玻片储存于 -20 °C 环境中。
3. 抗体和荧光染料的选择
注意：
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结果
在冷冻脾组织切片上检测单染标记物
由于半自动成像系统采用的是液晶可调滤光片（LCTF）系统，可实现更宽波长范围的检测25，并且本实验未进行任何信号放大步骤，因此我们首先在显微镜上对每种标记物所用的直接标记一抗的检测条件进行了优化。如图1所示，每个单染标记物以伪红色呈现。本实验中使用的Alexa Fluor标记抗体已由生产商验证适用于免疫荧光和流式细胞术。然而，Per-CP-Cy5.5荧光染料仅被验证适用于流式细胞术。我们仍能在单染切片中成功检测到该荧光信号，这表明经流式细胞术验证的抗体也适用于多光谱成像，同时提供了利用两种不同技术（即流式细胞术与多光谱成像）相互验证实验结果的优势。随后，我们进一步对冷冻组织进行了多光谱成像分析。
小鼠冷冻脾组织的多色荧光检测
为了验证多重染色方法和光谱成像技术，我们采用了富含免疫细胞的小鼠冷冻脾组织。 图2
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讨论
冷冻组织已广泛用于多重免疫荧光成像，以传统方式检测三至四种标志物31 使用直接法和间接法在组织上进行检测32在直接法中，抗体与荧光染料或量子点相连33 用于标记组织，而在间接法中，先使用未标记的一抗对组织进行标记，随后使用荧光素偶联的二抗与一抗特异性结合。前文讨论的一些近期同步多重染色方法也可用于冷冻组织，以检测四种以上的标志物。但随着检测标志物数量的增加，试剂成本和染色所需时间也随之显著增加。另一种用于冷冻组织的多重技术是多表位配体共轭作图法（multi-epitope-ligand-cartography, MELC）。34该技术涉及使用荧光染料偶联抗体对样本进行染色、成像以及荧光染料的光漂白。该技术的一个主要局限在于，仅能对组织的一个视野或区域实现多重检测。若要对其他视野或区域进行多重检测，则需手动重复该技术，耗时较长；或依赖自动化设备，成本较高。一个研究团队35 能够利用直接、间接和TSA染色.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
影像学和分析指导由伊利诺伊大学芝加哥分校的研究资源中心——研究组织学与组织成像核心提供，该核心的建立得到了研究副校长办公室的支持。本工作获得了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）RO1CA191317 项目对 CLP 的资助、美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS）SBDRC 项目（1P30AR075049-01）对 A. Paller 博士的资助，以及西北大学罗伯特·H·卢里综合癌症中心对免疫治疗评估核心的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮（组织学级） | Fisher Scientific | A16F-1GAL | 组织固定 |
| Alexa Fluor 488 抗小鼠 CD3 | BioLegend | 100212 | 克隆株 - 17A2；直接标记的一抗 |
| Alexa Fluor 488 eBioscience 抗人 CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | 克隆株 - L26；直接标记的一抗 |
| Alexa Fluor 555 小鼠抗 Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | 直接标记的一抗 |
| Alexa Fluor 594 抗人 CD3 | BioLegend | 300446 | 克隆株 - UCHT1；直接标记的一抗 |
| Alexa Fluor 594 抗小鼠 CD8a | BioLegend | 100758 | 克隆株 - 53-6.7；直接标记的一抗 |
| Alexa Fluor 647 抗人 CD8a | BioLegend | 372906 | 克隆株 - C8/144B；直接标记的一抗 |
| Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | 克隆株 - C068C2；直接标记的一抗 |
| Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD4 抗体 | BioLegend | 100426 | 克隆株 - GK1.5；直接标记的一抗 |
| C57BL/6 小鼠 | Charles River Laboratories | 27 | 用于多光谱成像训练的小鼠冷冻组织 |
| 柯普林瓶（Coplin Jar） | Sigma Aldrich | S6016-6EA | 切片复水和洗涤 |
| DAPI 溶液 | BD Biosciences | 564907 | 核酸染色剂 |
| 钻石白玻璃带电载玻片 | DOT Scientific | DW7590W | 组织切片粘附 |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液 1x（不含 Ca 和 Mg） | Fisher Scientific | MT21031CV | 洗涤和稀释液 |
| Gold Seal 盖玻片 | ThermoFisher Scientific | 3306 | 保护染色组织 |
| 人正常扁桃体 OCT 冷冻组织块 | AMSBio | AMS6023 | 用于多光谱染色的人类冷冻组织 |
| 人血清 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | 人组织的封闭液和稀释液 |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | 机器学习软件 |
| PerCP/Cyanine5.5 抗人 CD4 | BioLegend | 300529 | 克隆株 - RPA-T4；直接标记的一抗 |
| PerCP-Cy 5.5 大鼠抗 CD11b | BD Biosciences | 550993 | 克隆株 - M1/70；直接标记的一抗 |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | 全切片扫描软件 |
| ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂 | ThermoFisher Scientific | P36965 | 封片介质 |
| 研究型冷冻切片机 | Leica Biosystems | CM3050 S | 组织切片 |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | 小鼠组织封闭 |
| Tissue-Tek O.C.T. 溶液 | Sakura Finetek | 4583 | 组织包埋 |
| Vectra 3.0 自动化定量病理成像系统，6 片位 | Akoya Biosciences | CLS142568 | 半自动多光谱成像系统 |
| Vectra 软件 | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | 显微镜操作软件 |
参考文献
- van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C.
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重印与许可
