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方法文章

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

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DOI：

10.3791/60806

⸱

2020年3月30日

 ,  ,  , 
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

本文内容

摘要

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。

摘要

对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行多光谱荧光成像，能够在单个组织样本中检测多种标志物，从而提供有关抗原共表达及标志物空间分布的信息。然而，适用于福尔马林固定组织的合适抗体的缺乏，可能限制可检测标志物的种类。此外，染色方法耗时较长。本文介绍一种在冷冻组织上快速进行多光谱荧光成像的方法。该方法包括所用的荧光染料组合、小鼠和人类冷冻组织染色的详细步骤，以及扫描、图像采集和分析流程。染色分析采用一种 commercially available 半自动多光谱荧光成像系统。通过该方法，可在单个冷冻组织切片中实现多达六种不同标志物的染色与检测。机器学习分析软件可对细胞进行表型鉴定，用于定量分析。本文所述的冷冻组织检测方法，适用于那些在FFPE组织中无法检测或缺乏适用抗体的标志物。

引言

显微成像技术的最新进展极大地提升了我们对生物过程和疾病状态的认识与理解。通过显色免疫组织化学（IHC）在组织中原位检测蛋白质已在病理学中常规开展。然而，利用显色IHC染色同时检测多种标志物仍具有挑战性1 并且，利用多重免疫荧光（mIF）染色技术的新方法正在被开发，该技术可在单个组织样本上标记多种生物标志物。检测多种生物标志物具有重要意义，因为组织结构、细胞的空间分布以及抗原共表达等相关信息均可在单个组织样本中同时获得2多光谱荧光成像技术的应用使得多种生物标志物的检测成为可能。在该技术中，通过使用特定的光学元件，可将每种荧光染料的荧光光谱分离或区分。 "未混合"，从而实现多标志物检测且无任何光谱串扰3多光谱荧光成像正成为细胞生物学、临床前药物开发、临床病理学和肿瘤免疫谱分析中的关键技术方法4,5,6重要的是，免疫细胞（特别是CD8 T细胞）的空间分布可作为现有肿瘤患者的预后因素。7.

已开发出多种多重荧光染色方法，这些方法可同时或依次进行。在同时染色法中，所有抗体以混合物形式在单一步骤中加入，用于标记组织。UltraPlex 技术采用一组与半抗原偶联的一抗混合物，随后加入一组与荧光染料偶联的抗半抗原二抗混合物。InSituPlex 技术8则使用一组与独特DNA序列偶联的一抗混合物，同时加入组织样本中，随后进行扩增步骤，最后加入与一抗上各独特DNA序列互补的荧光染料标记探针。这两种技术均可实现四种标记物的检测，并可额外结合4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色。另外两种同时进行的多重染色方法基于二次离子质谱技术9。Hyperion 成像系统采用成像质谱流式细胞技术10，可检测多达37种标记物。该技术使用金属偶联抗体混合物对组织进行染色，通过激光消融组织特定区域，并将产生的粒子转移至质谱流式仪中检测金属离子。另一种类似技术为 IONPath，其采用多重离子束成像技术11，使用经过改造的质谱仪及氧离子源代替激光来消融金属偶联抗体。尽管上述所有同时多重染色方法均能实现多种标记物的检测，但将DNA、半抗原或金属与抗体偶联所需的成本、因消融导致的组织损耗，以及解混过程中所需的大量图像处理工作不容忽视。此外，目前可用的试剂盒和染色方案仅限于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，而开发自定义检测面板还需额外的时间和费用。

与同时多重染色法不同，顺序多重染色法包括使用针对一种标志物的抗体对组织进行标记，随后去除抗体，再重复此过程以标记多个标志物12。酪胺信号放大（TSA）是目前最常用的顺序多重染色方法。另外两种多重检测技术则结合了同时染色与顺序染色的方法。CODEX 平台13采用一组与独特DNA寡核苷酸序列偶联的抗体混合物，通过索引化的聚合步骤将荧光染料标记到DNA上，成像后去除标记，再重复该过程，可检测多达50种标志物。MultiOmyx多重染色技术14则通过使用包含三至四种荧光染料偶联抗体的混合物进行染色，成像后淬灭荧光信号，并重复该循环，在单张组织切片上可检测多达60种标志物。与同时多重染色法类似，尽管可检测的标志物范围广泛，但染色、图像采集、处理和分析所需的时间较长。去标记/淬灭步骤通常涉及对组织样本加热和/或漂白，因此顺序多重染色法通常在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织上进行，这类组织在加热或漂白条件下仍能保持结构完整性。

在临床环境中，福尔马林固定继之以石蜡包埋技术易于实施，组织块便于储存，且已有多种多重染色方案可供使用。然而，FFPE 组织的处理、包埋和脱蜡过程，以及抗原修复15（即通过该过程使抗体更易接近表位）均较为耗时。此外，FFPE 组织所经历的处理过程会导致自发荧光16，并掩盖目标表位，从而引起抗体克隆在检测 FFPE 组织中抗原时的变异性，并限制可用的抗体克隆种类17,18,19。一个典型例子是人类白细胞抗原（HLA）I 类等位基因20。相比之下，组织速冻法在固定前后无需复杂的处理步骤，避免了抗原修复的需要21,22，因而更有利于检测更广泛的目标分子。因此，在临床前和临床研究中，使用冷冻组织进行多光谱荧光成像有助于检测多种目标分子，具有重要价值。

鉴于使用FFPE组织存在上述局限性，我们探讨了是否可在冷冻组织上进行多光谱荧光成像。为回答这一问题，我们测试了一种同时进行多重染色的方法，使用一组荧光染料偶联抗体来检测多种抗原，并利用半自动化的多光谱成像系统分析染色结果。我们能够在单个组织切片中于90分钟内同时染色多达六种标志物。

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方案

小鼠脾脏和HLF16小鼠肿瘤组织23 来自我们实验室。人扁桃体组织购自商业供应商。详细信息见下文 材料表.

1. 组织包埋

  1. 将新鲜组织包埋于OCT（最佳切割温度）溶液中，并使用干冰或液氮迅速冷冻。
  2. 在-80 °C下保存组织。

2. 冷冻切片

  1. 在恒冷切片机中以 -25 °C 的温度切 8 μm 的切片。
    注意：可根据需要调整最佳切片厚度，以获得更清晰的图像。
  2. 将切片置于带电荷的玻片上。
  3. 室温（RT）下空气干燥切片 1 小时，随后用组织学级别的冰冻丙酮固定 10 分钟。
    注意：丙酮可使水溶性蛋白质凝固并提取脂质，但对含碳水化合物的成分无显著影响。相比之下，甲醛可较好保存大多数脂质，对碳水化合物的影响较小24。固定剂的选择需根据待检测标志物的性质而定。
  4. 将玻片储存于 -20 °C 环境中。

3. 抗体和荧光染料的选择

注意：在进行组织染色前，必须验证抗体克隆是否能够在丙酮固定的组织连续切片中对其目标抗原实现强效且特异性的染色。某些抗体可能需要不同的固定剂，且其与其他抗体在组合使用时的兼容性也需通过实验确定。同时，目标还包括筛选出荧光光谱重叠最小、并可利用DAPI、FITC、Cy3、Texas Red和Cy5的落射荧光滤光片进行检测的荧光染料。

  1. 使用已知表达靶抗原的组织切片，通过常规免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）检测确认染色结果。
  2. 利用半自动成像系统上可用的激发和发射滤光片组合，并在测试多种荧光素标记的一抗组合后，选择光谱重叠最小的荧光素进行实验（例如，参见表1）。

4. 染色

注意： 组织复水和玻片洗涤在考普林瓶中进行。封闭和抗体孵育步骤在湿化玻片盒中进行。

  1. 将载玻片在室温下放置 5–10 分钟，使其恢复至室温。
  2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）复水 5 分钟。
  3. 在使用抗体对组织进行染色前，执行封闭步骤。对于小鼠组织切片，在室温下使用专用封闭液（参见 材料表）封闭 10 分钟；对于人类组织切片，在室温下使用 PBS 稀释的 10% 正常混合人血清（NHS）封闭 15 分钟。
    注意：可根据后续实验步骤的需要，测试不同的封闭缓冲液，以保持切片的特定性质。
  4. 封闭后，用 PBS 洗涤载玻片 5 分钟。
  5. 进行多重染色时，将带有兼容荧光染料的抗体按预先确定的最佳稀释比例配制成混合抗体工作液。
  6. 将荧光染料标记的抗体混合液加入载玻片中。对于单标记染色，仅加入单一的荧光标记一抗。
  7. 设置一个对照未染色载玻片，除不加任何荧光标记一抗外，其余步骤均与染色组相同。
  8. 将载玻片在室温避光孵育 1 小时，然后用 PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。自此步骤后，该载玻片称为多重染色载玻片。
  9. 进行复染时，向多重染色载玻片中加入 DAPI，室温避光孵育 7 分钟，再用 PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。单染和未染色载玻片无需进行复染。
  10. 封片时，滴加一滴封片介质，轻轻将盖玻片覆盖于组织上。

5. 准备光谱库

  1. 图像采集
    1. 将光源功率设置为100%。通常情况下，由于对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行荧光检测时包含信号放大步骤，因此功率一般设为10%。
    2. 首先打开显微镜操作软件（参见材料表）。
    3. 选择编辑方案，然后选择新建方案。
    4. 输入"方案名称"，在成像模式下选择荧光 ，并输入"研究名称"。
    5. 将单染切片放置于载物台上，依次在对应的荧光通道中检查每个标记物的染色情况。在组织上选择表达该标记物最强信号的区域。
    6. 使用自动对焦和自动曝光功能调整曝光时间。
    7. 采集单染和未染切片的快照图像，并保存该方案。
      注意： 以下步骤在机器学习软件中进行（参见 材料表），利用单染和未染切片验证特异性染色，并确定抗体串扰情况。
    8. 在软件的构建光谱库选项卡中，加载每张单染切片的图像，选择相应的荧光染料，然后点击提取。软件将自动提取所选荧光染料的荧光信号。
    9. 为保存提取的颜色，点击保存至库。可创建一个新的"组"，或将提取的颜色保存至已有组中。
  2. 验证光谱库
    1. 检查每个滤光片组右侧的发射光谱曲线窗口。
      注意：若仅在可检测到荧光团的滤光片组中观察到光谱曲线，则表明提取的信号正确。若在错误的滤光片组中观察到光谱曲线，可能意味着该滤光片组中预期的主信号强度不足，或软件检测到了过高的其他信号（可能由光谱重叠引起）。此时，可首先尝试使用绘制处理区域工具，在图像中标记出表达荧光标记物和自发荧光的区域。这将训练软件识别真实信号并去除干扰信号。若此方法无效，则需重新对单染切片进行染色，测试不同抗体滴度。

6. 多光谱成像

注意：光谱库创建并验证完成后，对多重染色切片执行以下步骤。

  1. 全片扫描
    1. 按照第5.1节所述，在多重染色切片上调整焦距和曝光时间。
    2. 在扫描切片界面下，创建一个新任务，并选择上文保存的实验方案。
    3. 对多重染色切片进行全片扫描。
    4. 使用全片扫描软件打开全片扫描图像。该图像尚未进行光谱解混。
    5. 使用图章或感兴趣区域（ROI）工具，在全片扫描图像上选择多个感兴趣区域。这些ROI将使用6.1.1中设定的曝光时间进行扫描，用于后续的光谱解混与分析。
    6. 点击处理切片，以20倍放大倍数采集ROI图像
  2. 光谱解混
    1. ROI图像采集完成后，在机器学习软件中，进入手动分析选项卡，点击文件下的打开，加载多重染色图像。
    2. 在光谱库来源下拉菜单中，点击选择荧光染料。
    3. 新窗口将弹出。在此选择上文创建的光谱库或染料组。
    4. 加载未染色切片图像。点击所选光谱库上方的自发荧光（AF）标记图标，并在未染色切片上绘制一条线或区域，以识别组织中的自发荧光信号。
    5. 在编辑标记物与颜色选项卡下，为每个标记物分配名称。此步骤中可设置伪彩。
      注意：自发荧光图像的默认颜色为DarkSlateGray，应将其更改为黑色。
    6. 点击准备全部。
  3. 验证光谱解混后的图像
    注意：    完成光谱解混步骤后，系统将生成一张包含所有颜色的复合图像。
    1. 点击编辑视图的眼睛图标。在此处，可通过开启或关闭"组分显示"中的每种颜色，单独查看每个标记物的染色情况。
    2. 目视检查染色结果及细胞形态，确保标记物之间无非生物学相关的重叠信号。病理学家也可协助验证染色结果。
      注意：应通过逐个省略一种荧光染料并观察染色模式，对多重染色切片的特异性进行验证。此外，该验证过程还有助于识别因抗体串扰或信号渗漏而在相邻光谱中出现的强荧光信号。
    3. 对于模拟明场图像的病理学视图，请点击选择组分图像按钮。在此选择某一标记物，以查看其对应的模拟明场图像。

7. 通过细胞分割和表型分析多光谱图像

注意：在验证光谱解混图像后，可使用机器学习软件进行细胞分割，该软件将提供逐步操作说明。本文未进行组织分割。如果检测面板包含一种或多种组织特异性标记物，尤其是当组织形态复杂时，应进行组织分割。

  1. 在“Segment”选项下选择"细胞质"和"细胞膜"。
    注意："细胞核"为默认选择项。
  2. 从面板中选择一个标记物，并配置该标记物以检测细胞核、细胞质或细胞膜。例如，可选择DAPI检测细胞核，CD3检测细胞膜。
  3. 点击省略号按钮（“...”），在"use this signal to find"下选择相应选项。例如，DAPI对应选择“nuclei”。可从面板中选择多个标记物用于分割。
    注意：对于细胞质或细胞膜标记物，请选择"Use this signal to assist in nuclear segmentation"选项。
  4. 软件将自动检测并在图像中分别为细胞核、细胞质和细胞膜创建掩膜。
  5. 确保所有细胞均被“掩膜”以进行分割。如需调整，请切换至7.3中选定标记物的病理视图，并使用软件中的配置选项进行调节。
  6. 点击"分割全部"以完成细胞分割。
  7. 完成细胞分割后，继续进行细胞表型鉴定。在此步骤中，选择用于表型鉴定的标记物，并手动选择至少五个被所选标记物明显染色的细胞。此操作将训练软件自动识别图像中所有被该标记物染色的细胞。
  8. 生成表型图谱。分析确认被标记物染色的细胞是否被正确表型鉴定。
    注意：细胞表型鉴定可能是一个迭代过程。若软件无法正确鉴定细胞表型，说明训练不足或不准确。此时，用户需手动选择更多细胞重新训练软件，并重复此步骤，直至对训练结果满意为止。
  9. 创建一个名为"Others"的组，包含所有未被任何标记物染色的细胞。
    注意：此步骤至关重要，用于训练软件在表型鉴定中排除所有未染色细胞。

8. 导出图像和分析表格

  1. 点击 导出 按钮以查看 导出设置 面板。
  2. 在"导出目录"中，点击 浏览 以选择图像导出位置。
  3. 在"图像导出选项"中，选择 图像输出格式。
  4. 在"要导出的图像"列表中，选择需导出的图像。"复合图像"为最终的伪彩去混色图像，"病理视图"为各个模拟明场图像，而"组分图像（多图像TIFF）"是包含组分数据的多图像TIFF文件，可供第三方分析软件使用。
  5. 点击"全部导出"按钮以导出图像。
    注意：分析生成的表格也可在此步骤中选中并导出。

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结果

在冷冻脾组织切片上检测单染标记物
由于半自动成像系统采用的是液晶可调滤光片（LCTF）系统，可实现更宽波长范围的检测25，并且本实验未进行任何信号放大步骤，因此我们首先在显微镜上对每种标记物所用的直接标记一抗的检测条件进行了优化。如图1所示，每个单染标记物以伪红色呈现。本实验中使用的Alexa Fluor标记抗体已由生产商验证适用于免疫荧光和流式细胞术。然而，Per-CP-Cy5.5荧光染料仅被验证适用于流式细胞术。我们仍能在单染切片中成功检测到该荧光信号，这表明经流式细胞术验证的抗体也适用于多光谱成像，同时提供了利用两种不同技术（即流式细胞术与多光谱成像）相互验证实验结果的优势。随后，我们进一步对冷冻组织进行了多光谱成像分析。

小鼠冷冻脾组织的多色荧光检测
为了验证多重染色方法和光谱成像技术，我们采用了富含免疫细胞的小鼠冷冻脾组织。 图2

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讨论

冷冻组织已广泛用于多重免疫荧光成像，以传统方式检测三至四种标志物31 使用直接法和间接法在组织上进行检测32在直接法中，抗体与荧光染料或量子点相连33 用于标记组织，而在间接法中，先使用未标记的一抗对组织进行标记，随后使用荧光素偶联的二抗与一抗特异性结合。前文讨论的一些近期同步多重染色方法也可用于冷冻组织，以检测四种以上的标志物。但随着检测标志物数量的增加，试剂成本和染色所需时间也随之显著增加。另一种用于冷冻组织的多重技术是多表位配体共轭作图法（multi-epitope-ligand-cartography, MELC）。34该技术涉及使用荧光染料偶联抗体对样本进行染色、成像以及荧光染料的光漂白。该技术的一个主要局限在于，仅能对组织的一个视野或区域实现多重检测。若要对其他视野或区域进行多重检测，则需手动重复该技术，耗时较长；或依赖自动化设备，成本较高。一个研究团队35 能够利用直接、间接和TSA染色...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

影像学和分析指导由伊利诺伊大学芝加哥分校的研究资源中心——研究组织学与组织成像核心提供，该核心的建立得到了研究副校长办公室的支持。本工作获得了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）RO1CA191317 项目对 CLP 的资助、美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS）SBDRC 项目（1P30AR075049-01）对 A. Paller 博士的资助，以及西北大学罗伯特·H·卢里综合癌症中心对免疫治疗评估核心的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮（组织学级）Fisher ScientificA16F-1GAL组织固定
Alexa Fluor 488 抗小鼠 CD3BioLegend100212克隆株 - 17A2；直接标记的一抗
Alexa Fluor 488 eBioscience 抗人 CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82克隆株 - L26；直接标记的一抗
Alexa Fluor 555 小鼠抗 Ki-67BD Biosciences558617直接标记的一抗
Alexa Fluor 594 抗人 CD3BioLegend300446克隆株 - UCHT1；直接标记的一抗
Alexa Fluor 594 抗小鼠 CD8aBioLegend100758克隆株 - 53-6.7；直接标记的一抗
Alexa Fluor 647 抗人 CD8aBioLegend372906克隆株 - C8/144B；直接标记的一抗
Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD206 (MMR)BioLegend141711克隆株 - C068C2；直接标记的一抗
Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD4 抗体BioLegend100426克隆株 - GK1.5；直接标记的一抗
C57BL/6 小鼠Charles River Laboratories27用于多光谱成像训练的小鼠冷冻组织
柯普林瓶（Coplin Jar）Sigma AldrichS6016-6EA切片复水和洗涤
DAPI 溶液BD Biosciences564907核酸染色剂
钻石白玻璃带电载玻片DOT ScientificDW7590W组织切片粘附
杜尔贝科磷酸盐缓冲液 1x（不含 Ca 和 Mg）Fisher ScientificMT21031CV洗涤和稀释液
Gold Seal 盖玻片ThermoFisher Scientific3306保护染色组织
人正常扁桃体 OCT 冷冻组织块AMSBioAMS6023用于多光谱染色的人类冷冻组织
人血清 1xGemini Bio-Products100-512人组织的封闭液和稀释液
inFormAkoya BiosciencesVersion 2.4.1机器学习软件
PerCP/Cyanine5.5 抗人 CD4BioLegend300529克隆株 - RPA-T4；直接标记的一抗
PerCP-Cy 5.5 大鼠抗 CD11bBD Biosciences550993克隆株 - M1/70；直接标记的一抗
PhenochartAkoya BiosciencesVersion 1.0.8全切片扫描软件
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂ThermoFisher ScientificP36965封片介质
研究型冷冻切片机Leica BiosystemsCM3050 S组织切片
Superblock 1xThermoFisher Scientific37515小鼠组织封闭
Tissue-Tek O.C.T. 溶液Sakura Finetek4583组织包埋
Vectra 3.0 自动化定量病理成像系统，6 片位Akoya BiosciencesCLS142568半自动多光谱成像系统
Vectra 软件Akoya BiosciencesVersion 3.0.5显微镜操作软件

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