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方法文章

使用细胞外通量分析仪测量小鼠精子获能过程中糖酵解和氧化磷酸化的变化

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DOI：

10.3791/60815

⸱

2020年1月22日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Weill Cornell Medical College

本文内容

摘要

我们描述了如何应用细胞外通量分析仪来实时监测小鼠精子获能过程中糖酵解和氧化磷酸化的变化。

摘要

哺乳动物精子在雌性生殖道中经历一个称为获能的过程，从而获得受精能力。与获能相关的过程需要能量。目前仍存在关于为精子前向运动、获能、超活化以及顶体反应提供能量的ATP来源的持续争论。本文描述了利用细胞外通量分析仪作为研究小鼠精子获能过程中能量代谢变化的工具。该方法利用对H+和O2敏感的荧光探针，可实时监测未获能精子与正在获能精子的糖酵解和氧化磷酸化变化。通过在不同能量底物和/或药理学激活剂和/或抑制剂存在下进行该检测，可深入了解不同代谢通路的贡献，以及信号级联与代谢在精子获能过程中的相互关系。

引言

质谱技术的应用彻底改变了代谢研究。靶向代谢谱分析和代谢物示踪技术能够精确监测能量代谢的变化。然而，成功开展代谢组学研究需要 extensive training、经验丰富的技术人员以及昂贵且高灵敏度的质谱仪，而这些条件并非所有实验室都能具备。近年来，使用细胞外通量分析仪（如 Seahorse XFe96）作为替代方法来测量多种细胞类型中能量代谢的变化已变得越来越流行1,2,3,4,5。

精子是高度特化的运动细胞，其功能是将父源基因组递送至卵母细胞。射精后离开雄性生殖道的精子仍处于功能不成熟状态，无法使卵母细胞受精，因为它们不能穿透卵母细胞的外被结构。精子在通过雌性生殖道的过程中经历一种称为获能的成熟过程，从而获得受精能力6,7。新鲜射出的精子或从附睾尾部分离得到的精子，可在含有 Ca2+、碳酸氢盐（HCO3-）或细胞通透性cAMP类似物（如二丁酰-cAMP）、胆固醇受体（如牛血清白蛋白，BSA）以及能量来源（如葡萄糖）的定义明确的获能培养基中通过体外孵育实现获能。在获能过程中，精子将其运动模式转变为不对称的鞭毛摆动，表现为一种称为超激活的游动方式8,9，并获得发生顶体反应的能力7，即释放蛋白水解酶以降解卵母细胞的外被结构。这些过程需要能量支持，与体细胞类似，精子通过糖酵解以及线粒体三羧酸循环（TCA循环）和氧化磷酸化（oxphos）生成ATP及其他高能化合物10。尽管已有大量研究表明，糖酵解足以且必需支持精子获能过程11,12,13,14，但氧化磷酸化在此过程中的贡献尚不明确。与其他细胞类型中糖酵解与TCA循环在空间上偶联不同，精子具有高度区室化的结构，被认为将这两种代谢途径分别限制在鞭毛的不同区域：中段集中了线粒体相关机制，而糖酵解的关键酶则主要局限于主段15,16。这种区室化结构引发了一个持续存在的争议：主段通过糖酵解产生的丙酮酸是否能够支持中段线粒体的氧化磷酸化；以及中段通过氧化磷酸化生成的ATP是否能够沿鞭毛足够快速地扩散，以满足主段远端区域的能量需求17,18,19。同时也有研究支持氧化磷酸化在精子获能中发挥重要作用。不仅因为氧化磷酸化比糖酵解在能量产生上更具优势（每分子底物产生的ATP是糖酵解的16倍），而且在雄性间配偶竞争程度更高的哺乳动物物种中，中段体积和线粒体含量与生殖适应性呈直接正相关20。要回答这些问题，需要建立能够评估糖酵解与氧化磷酸化在精子获能过程中相对贡献的方法。

Tourmente 等人采用24孔细胞外通量分析仪，比较了亲缘关系相近但精子运动性能参数存在显著差异的小鼠物种的能量代谢情况21。我们并未报告未获能精子的基础ECAR和OCR值，而是采用其方法，利用96孔细胞外通量分析仪实时监测小鼠精子获能过程中能量代谢的变化。我们建立了一种方法，可通过测量氧气（O₂）通量，同时在多达十二种不同实验条件下，对具有摆动鞭毛的精子的糖酵解和氧化磷酸化（oxphos）进行实时同步监测。2）和质子（H+) (图1A）。由于糖酵解过程中丙酮酸分解为乳酸以及CO₂的产生2 通过三羧酸循环，非获能和获能精子均会排出H⁺+ 进入检测培养基，由细胞外通量分析仪通过 H+-敏感的荧光染料固定在传感器盒的探针尖端。同时，O2 通过氧化磷酸化消耗的氧气通过O2-对同一探针尖端固定的敏感荧光团（图1B）。有效检测所释放的 H+ 并消耗 O2 需要一种经改良的精子缓冲液，其缓冲能力较低，且不含碳酸氢盐或酚红。因此，为了在无碳酸氢盐的条件下诱导精子获能，我们采用了细胞通透性cAMP类似物，并联合广谱PDE抑制剂IBMX进行处理。22三个额外的独立进样口可加入药理性激活剂和/或抑制剂，便于实时检测因实验干预引起的细胞呼吸和糖酵解速率的变化。

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方案

从8至16周龄的CD-1雄性小鼠中收集精子。动物实验已获得威尔康奈尔医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 检测前一天

  1. 传感器盒的制备与细胞外通量分析仪校准液的配制
    1. 为水合传感器微孔板，从 XFe96 细胞外通量检测试剂盒中取出传感器微孔板，倒置放置于工具板旁。
    2. 用25 mL双蒸水填充溶液储液罐2使用多通道移液器，加入 200 µL 的 H2O，加入至工具板的每个孔中。将传感器盒放回工具板，并在37 °C非CO₂培养箱中过夜孵育2 培养箱
      注意：滤筒需至少水合 4 h。
    3. 将25 mL细胞外通量分析仪校准液分装至50 mL锥形管中，于37 °C非CO₂培养箱中孵育过夜2 培养箱
  2. ConA包被微孔板的制备
    1. 将2.5 mg刀豆蛋白A（ConA）溶于5 mL双蒸水中2O 以配制 0.5 mg/mL (w/v) 的储备液。
    2. 使用多通道移液器，将50 µL的0.5 mg/mL刀豆球蛋白A（Con A）溶液加入细胞外通量分析仪用96孔板的每个孔中。保持盖子打开，于室温下静置过夜晾干。
      注意：可同时包被多块酶标板，并在4 °C下保存长达四周，待使用时取出。
  3. 精子缓冲液的制备
    1. 配制250 mL细胞外通量分析仪TYH缓冲液 低 HEPES 含 138 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.7 mM CaCl2，1.2 mM KH2PO4，1.2 mM MgSO₄4，5.6 mM 葡萄糖和 1 mM HEPES。将缓冲液加热至 37 °C，并调节 pH 至 7.4。

2. 检测当天

  1. 传感器微孔板校准前准备
    1. 将工具板中的 H2O 替换为每孔 200 µL XF 校准液，并在无 CO2 环境下 37 °C 培养箱中孵育至少 1 小时。
      注：可使用经无菌滤膜过滤的 PBS 缓冲液（pH 7.4）替代校准液。
    2. 将 50 mL TYH 缓冲液加热至 37 °C。
  2. 为细胞外通量分析仪生成波形模板
    1. 开启细胞外通量分析仪，待其温度稳定至 37 °C。
    2. 打开 Wave 软件，通过打开空白模板创建新模板（见补充文件 1，波形模板）。
    3. 打开分组定义选项卡。将检测培养基定义为 TYH（pH 7.4），细胞类型定义为小鼠精子，注射策略和预处理项留空。为每种检测条件创建不同分组；本示例中共有 6 个不同分组（TYH、TYH + db-cAMP/IBMX、2-DG、2-DG + db-cAMP/IBMX、Ant/Rot、Ant/Rot + db-cAMP/IBMX）；其中二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）和 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）用于诱导精子获能，2-脱氧葡萄糖（2-DG）作为糖酵解抑制剂，抗霉素 A（antA）和鱼藤酮（rot）分别作为电子传递链复合体 III 和复合体 I 的抑制剂。
      注：为减少孔间差异，每种条件应至少平行测定 7–8 个孔。
    4. 打开板图选项卡，通过将各分组分配至特定孔位来定义板图。
      注：四个角落的孔（A1、A12、H1、H12）将加入 TYH 缓冲液（不含精子），后续用于背景信号扣除。
    5. 打开方案选项卡，添加 4 个不同的测量周期，选择相应进样端口并编辑测量参数（图 2，表 1）。勾选注射后测量，但不要勾选平衡。
    6. 保存检测模板，填写项目摘要，并设定结果文件的保存路径。
  3. 准备加载至传感器微孔板中的化合物
    1. 通过将 9.8 mg 化合物溶解于 TYH 缓冲液中，配制 2 mL 50 mM db-cAMP 溶液，并加入 IBMX 至终浓度为 5 mM。
      注：IBMX 在 TYH 缓冲液中稀释后易发生沉淀。可通过涡旋混合，并将 TYH/db-cAMP/IBMX 溶液置于 37 °C 金属浴中孵育 5 分钟以溶解沉淀。
    2. 通过将 82.1 mg 化合物溶解于 TYH 缓冲液中，配制 1 mL 500 mM 2-DG 溶液。
    3. 用 TYH 缓冲液稀释抗霉素 A 和鱼藤酮，配制 1 mL 5 µM AntA/Rot 混合溶液。
      注：化合物在注入细胞外通量分析仪微孔板后会被稀释 10 倍；因此，务必确保进样溶液的浓度为最终工作浓度的 10 倍。
  4. 小鼠精子的分离
    1. 使用异氟烷麻醉 3 只年龄在 8 至 16 周之间的雄性小鼠，在确认脚趾夹捏无反应后通过颈椎脱位处死小鼠，取出尾部附睾和输精管。
    2. 将每条附睾尾部放入 24 孔板的一个孔中，加入 500 µL 预热的 TYH 缓冲液，用镊子将其固定在孔底，并用精细剪刀进行 5–7 次小切口以打开组织。
    3. 立即将该 24 孔板放入无 CO2 环境下 37 °C 培养箱中，孵育 15 分钟以使精子自然释放。
  5. 传感器微孔板的加样
    1. 细胞外通量检测试剂盒中提供了两个加样引导装置，分别用于端口 A 和 D，以及端口 B 和 C。进行特定端口加样时，取下传感器微孔板盖，将相应端口加样引导装置上的字母与微孔板左上角对齐。加样过程中，用非操作手的手指固定加样引导装置，将移液器吸头垂直插入引导装置的孔中。
    2. 端口 A：使用多通道移液器，向每一列均加入 20 µL TYH 缓冲液。
    3. 端口 B：向第 1–4 列加入 22 µL TYH 缓冲液，向第 5–8 列加入 22 µL 500 mM 2-DG 溶液，向第 9–12 列加入 25 µL 5 µM AntA/Rot 溶液。
    4. 端口 C：向所有奇数列加入 25 µL TYH 缓冲液，向所有偶数列加入 25 µL 10 mM db-cAMP / 500 µM IBMX 溶液。
    5. 将装有校准板的传感器微孔板放入细胞外通量分析仪中并启动检测。校准过程需 10–15 分钟。
  6. 精子检测板的准备
    1. 将 45 mg BSA 溶解于 15 mL TYH 缓冲液中（终浓度为 3 mg/mL w/v），分装为三份，每份 3 mL BSA/TYH 溶液，分别置于 5 mL 离心管中。
    2. 将两个精子释放孔中的液体合并至一个 1.5 mL 离心管中，使用血细胞计数板计数精子，并将精子浓度调整为 2 × 107 个精子/mL。
      注：移取精子时应使用剪去尖端的移液器吸头，以避免损伤细胞。
    3. 以 700 × g 离心 3 分钟，弃上清，加入 1 mL TYH 缓冲液。重复一次离心步骤，弃上清，将每份精子悬液转移至含有 3 mL BSA/TYH 溶液的 5 mL 离心管中。
    4. 在刀豆蛋白 A（ConA）包被的检测板的四个角落孔（A1、A12、H1、H12）中各加入 180 µL TYH 缓冲液。在其余各孔中加入 180 µL 精子悬液（每孔含 1.2 × 106 个精子）。
    5. 将精子检测板以 250 × g 离心 1 分钟，将板旋转 180°，再以 250 × g 离心 1 分钟（最低刹车速率设为 1）。
    6. 从细胞外通量分析仪中取出校准板，换上精子检测板，继续进行检测。
  7. 数据提取与分析
    1. 检测完成后，取出微孔板，打开结果文件，点击导出选项卡，将完成的运行数据导出为 GraphPad Prism 文件（补充文件 2：用于生成图 3的原始示例数据）。
    2. 通过点击新建选项卡，然后点击复制家族…选项卡，复制 ECAR 和 OCR 数据文件（图 3A）。
    3. 删除前 7 行数据（图 3B）。
    4. 通过基线扣除第一行数据，对 cAMP/IBMX 注射前的数据点进行归一化处理。点击分析选项卡，再点击去除基线与列计算选项卡。勾选选定行：第一行，计算方式：比值：数值/基线，以及子列：忽略子列，然后点击确定（图 3C）。

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结果

该方法利用细胞外通量分析仪监测小鼠精子获能过程中糖酵解和氧化磷酸化（oxphos）速率的实时变化。图4展示了一项典型实验，其中精子在仅以葡萄糖作为能量底物，并添加2-DG以及抗霉素和鱼藤酮作为药理学调节剂的条件下进行获能。细胞外通量分析仪中TYH缓冲液所含的能量底物及药理学调节剂可根据实验目的自由选择。在BSA/TYH中未获能的小鼠精子通过其头部附着于ConA包被的瞬时微室底部。本示例中，所有检测孔平均测得的基础ECAR和OCR值分别为12.76 ± 2.75 mpH/min和23.64 ± 2.78 pmol/min。

用TYH缓冲液进行模拟注射后，分别注射2-DG和抗霉素/鱼藤酮（ant/rot）以抑制糖酵解和氧化磷酸化，随后通过注射db-cAMP/IBMX诱导精子获能。

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讨论

在缺乏某些代谢底物或关键代谢酶的情况下，精子获能能力的丧失揭示了能量代谢是支持成功受精的关键因素。细胞活化过程中的代谢转换在其他细胞类型中是一个已被广泛认可的概念，然而，我们才刚刚开始理解精子如何在获能过程中调整其代谢以满足日益增加的能量需求。利用细胞外通量分析仪，我们开发了一种易于应用的工具，用于实时监测精子获能过程中糖酵解和氧化磷酸化的动态变化。通过固定在传感器探针上的荧光探针检测细胞外H+和O2的变化，该方法具有最小的侵入性，且四个独立控制的注射端口可在获能过程之前或期间的特定时间点加入药理学抑制剂或激活剂，实现灵活操控。本方案仅提供了一个小鼠精子获能实验的示例。为了简化结果的解读，我们选择展示一个仅以葡萄糖作为唯一能源的代表性实验。实验条件可根据研究目的灵活调整，最多可同时平行检测12种不同条件（例如，葡萄糖与葡萄糖加丙酮酸盐的比较）。此外，四个独立的注射端口允许在获能前或获能过程中的任意指定时间点加入药理学激活剂和/或抑制剂，这使得细胞外通量分析仪有望被用作一种半高通量筛选设备。与小鼠精子类似，在人类或牛等其他物种中，精子在获能期间如何改变其代谢仍不清楚。该方案易于调整，因此我们建议...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者希望感谢洛克菲勒高通量与光谱资源中心的 Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu 提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
2-脱氧-D-葡萄糖Sigma-AldrichD83752-DG
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤Sigma-AldrichI7018IBMX；用DMSO配制500 mM的储存液（111.1 mg/ml），分装保存
抗霉素ASigma-AldrichA8674AntA；用DMSO配制5 mM的储存液（2.7 mg/ml），分装成小份保存
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA1470BSA
氯化钙Sigma-AldrichC1016CaCl2
花生凝集素Concanacalin ASigma-AldrichL7381ConA
葡萄糖Sigma-AldrichG7528
HepesSigma-AldrichH0887
等感觉Henry Schein 动物健康1169567761异氟烷
硫酸镁Sigma-AldrichM2643MgSO4
N6,2'-O-二丁酰腺苷-3',5'-单磷酸钠盐Sigma-AldrichD0627db-cAMP
氯化钾Sigma-AldrichP9333KCl
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP5655KH2PO4
鱼藤酮Cayman Chemical Company13995Rot；用DMSO配制5 mM的储存液（2 mg/ml），分装成小份保存
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761NaHCO₃-
氯化钠Sigma-AldrichS9888NaCl
<强>仪器与材料
12通道移液器 10-100 μLEppendorfES-12-100
12通道移液器 50-300 μLvwr613-5257
37 °C，非CO2 培养箱vwr1545
5 mL 离心管Eppendorf30119380
50 mL 圆锥形离心管vwr76211-286
使用板适配器离心赛默飞世尔科技IEC FL40R
解剖工具包World Precision InstrumentsMOUSEKIT
配备40倍物镜的倒置相差显微镜尼康
八通道溶液储液槽，25 ml，分隔式Thomas Scientific1159X93
八通道溶液储液槽，25 mL，分隔式托马斯科学公司1159X95
Seahorse XFe96 分析仪安捷伦
Seahorse XFe96 FluxPak安捷伦102416-100也可作为XFe96 FluxPak mini（102601-100）出售，内含6个而非18个 cartridge。

参考文献

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