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方法文章

自体富血小板血浆的制备及其在体外人成纤维细胞扩增中的促进作用

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DOI：

10.3791/60816

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2021年2月24日

 ,  , 
1Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Geneva University Hospitals, Faculty of Medicine, Geneva University, 2Regen Lab SA

本文内容

摘要

本方案介绍了一种可制备富血小板血浆（PRP）的装置，用于在100%自体成纤维细胞培养系统中促进细胞的体外扩增。

摘要

目前，自体成纤维细胞在皮肤修复中的临床应用受到广泛关注。大多数情况下，需要在体外培养皮肤细胞。然而，使用异种或同种异体培养基进行细胞培养存在一些缺点（例如，传染性病原体传播的风险或细胞扩增速度较慢）。本文建立了一种自体培养系统，利用患者自身的富血小板血浆（PRP）在体外扩增人皮肤成纤维细胞。在患者接受腹部成形术的同时，分离其真皮成纤维细胞。使用添加胎牛血清（FBS）或PRP的培养基对细胞培养过程进行为期最长7天的观察。评估PRP制备物中的血细胞含量、细胞增殖能力以及成纤维细胞的分化情况。本方案描述了使用专用医疗器械制备标准化、未激活状态PRP的方法。该制备过程仅需一种医疗器械（CuteCell-PRP）和离心机。在具备充分医疗操作条件的情况下，该装置构成一个一步式、无热原、无菌的封闭系统，仅需一次温和离心（1,500 × g，5分钟）。离心后，血液成分分层，富血小板血浆可被轻松收集。该装置可快速、稳定且标准化地制备PRP，适用于作为体外人细胞扩增的培养补充剂。所获得的PRP中血小板浓度较全血提高1.5倍，同时优先去除了红细胞和白细胞。结果表明，与FBS相比，PRP对细胞增殖具有显著促进作用（达7.7倍），且成纤维细胞在PRP处理后被有效激活。

引言

再生医学旨在修复或替换因年龄、疾病或创伤而受损的组织和器官，并纠正先天性缺陷。在自体治疗中，从患者体内取出细胞或组织，经扩增或修饰后，再重新引入供体体内。这种治疗方法在皮肤科领域具有广阔的应用前景1。在自体成纤维细胞治疗中，培养患者的成纤维细胞并重新注射，以治疗皱纹、褶皱或痤疮瘢痕。由于成纤维细胞是真皮中的主要功能细胞，注射自体成纤维细胞在面部年轻化方面可能比其他疗法更具优势2。

在皮肤中，成纤维细胞负责合成和分泌细胞外蛋白（如胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸和糖胺聚糖）。它们还释放生长因子，以调节正常皮肤稳态和伤口愈合过程中的细胞功能、细胞迁移以及细胞-基质/细胞-细胞相互作用3。真皮成纤维细胞已被提出作为皮肤伤口愈合4、组织再生5或在美容和整形外科手术中作为真皮填充剂的一种潜在临床细胞疗法6。一些研究甚至表明，在再生医学背景下，成纤维细胞可能比间充质干细胞更实用且更有效的细胞治疗选择7。

为了获得足够数量的成纤维细胞用于临床应用，通常必须进行细胞扩增。体外细胞培养需要在基础培养基中添加生长因子、蛋白质和酶，以支持细胞的黏附和增殖。胎牛血清（FBS）是细胞培养基中常用的添加剂，因为胎儿血液与成人血液相比：1）含有更丰富的生长因子；2）抗体含量较低8。随着细胞治疗的发展，人们对在培养基中添加FBS的传统细胞培养条件的安全性产生了担忧。此外，目前已有趋势使用替代物取代FBS9。多种FBS替代品已显示出良好的应用前景10。

此处选择的血小板富集血浆（PRP）替代方案为CuteCell-PRP，我们已开发出一种用于制备标准化PRP的医疗器械。该设备的预期用途是在GMP条件下，制备自体PRP，作为自体细胞体外扩增时的培养基补充物。

PRP 被定义为血小板在血浆中的浓缩悬液。由于存在多种制备方案，这些方案在 1）所需血液量、2）所用设备类型以及 3）离心程序方面各不相同，因此最终获得的血小板浓度从略高于到超过血液基础值 10 倍不等。此外，PRP 制剂中红细胞和白细胞的污染程度也各不相同。因此，“PRP”这一术语被用于描述在生物学组成和潜在治疗效果上差异显著的一类产品。

在大多数研究中，通过使用不同浓度的富血小板血浆（PRP）并加以激活（通过凝血酶或钙离子）来替代胎牛血清（FBS）。这种人工激活会引发血小板生长因子的迅速且显著释放，持续时间从15分钟至24小时11。因此，人们认为在细胞培养应用中，血小板的激活是不利的，因为此类应用需要生长因子通过血小板逐渐脱颗粒实现缓慢释放。

PRP 治疗涉及制备浓缩血小板血浆中的自体血小板12。最佳血小板浓度尚不明确，且市面上有多种商用设备可用于制备 PRP13。由于不同研究之间缺乏一致性，导致该领域缺乏标准化，进而使得注射剂量与时机成为一个“黑箱”问题。本方案描述了一种使用专用 PRP 设备获取自体 PRP 的操作流程，用于在完全自体的体外培养模型中扩增皮肤成纤维细胞。

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方案

本研究方案遵循《赫尔辛基宣言》的原则，所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。皮肤样本取自在瑞士日内瓦大学医院（日内瓦，瑞士）整形、重建与美容外科接受腹部成形术的健康女性。该研究程序符合《赫尔辛基宣言》的原则，并已获得当地机构伦理委员会的批准（方案编号 #3126）。

1. PRP 的制备

注意：CuteCell-PRP 采血管（材料表）专为在封闭系统中从小体积患者血液快速制备富血小板血浆（PRP）而设计。

  1. 全血采集
    注意：根据医疗机构的采血规程，使用与PRP管直接连接的蝶形针从手臂的外周静脉采集自体血。如果患者处于麻醉状态，可通过静脉留置针直接抽取血液。
    1. 打开PRP管的泡罩包装。进行静脉穿刺，并用全血填充所需数量的PRP管。管内的负压将自动采集所需的血量（约10 mL）。
    2. 轻柔地将管子上下颠倒数次，使血液与抗凝剂充分混合。
    3. 在生物安全柜（II级）内，使用1 mL注射器吸取100 µL全血，用于后续血细胞计数。
  2. 离心
    注意：启动离心机前，确保其已正确配平。
    1. 采集完血液后，如有需要，可另取一个配平管（单独提供），加入与PRP管中血液等量的水作为平衡对照。将装有血液的管子与配平管对称放置于离心机中，确保机器处于平衡状态。
    2. 以1,500 × g 离心5分钟。
      注意：根据离心机制造商的说明设置相应的转速（rpm）。离心后，血液将分层：红细胞和白细胞被截留在凝胶下方，血小板则沉积在凝胶表面（图1）。
  3. 轻柔地将PRP管倒置20次，使血小板沉积物重新悬浮于血浆上清液中。
    注意：确保血小板已完全从凝胶上脱离。血浆应由澄清透明变为浑浊。若存在血小板聚集体，应随血浆一同收集。
  4. 为收集PRP，使用连接10 mL注射器的转移装置从管中吸取血浆溶液。
    注意：每根PRP管可获得约5 mL PRP。所得PRP溶液现已可用于最终培养基的配制。该溶液可在安全柜内室温（RT）保存，直至后续进行血液分析仪检测及使用。
  5. 使用PRP前，需使用全自动血液分析仪（材料表）测定血小板浓度、平均血小板体积以及红细胞和白细胞数量。操作时，小心吸取100 µL溶液并转移至1.5 mL离心管中。
    注意：PRP作为自体培养添加剂使用时，终浓度为5–20%（v/v）。不同细胞系所需的最佳PRP浓度需单独确定。为防止纤维蛋白凝块形成，最终培养基中应添加2 U/mL肝素。

2. 自体成纤维细胞的分离及在含胎牛血清或富血小板血浆补充剂的培养基中的培养

  1. 在50 mL聚丙烯管中，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻振荡清洗皮肤样本。
  2. 如果皮肤样本相对较大（>10 cm2），将样本放置于150 cm2组织培养皿的盖子上（表皮面朝下）。使用镊子和剪刀去除皮下脂肪组织。为防止组织干燥，每隔几分钟用PBS冲洗一次。
    注意：较小的样本使用较小的组织培养皿。
  3. 脂肪组织修剪完成后，用无菌手术刀将组织切成约0.5 cm × 1.5 cm的条状。
  4. 向无菌15 mL离心管中加入5 mL胶原酶-分散酶混合液（材料表；14 Wünsch单位/mL）。
  5. 将切好的组织转移至该离心管中，确保组织块完全浸没在溶液中。盖紧管盖。
  6. 将离心管置于37 °C培养箱中，以轨道振荡方式孵育150分钟。孵育结束后，将含有组织的离心管转移至生物安全柜中。
  7. 在生物安全柜内，将无菌100 mm培养皿的盖子倒置放置。将消化后的组织溶液转移至100 mm培养皿底部，避免飞溅。若离心管中仍有残留组织块，使用无菌1 mL移液器或无菌镊子将其转移至100 mm培养皿底部。
  8. 将表皮条朝上，使用两对镊子分离完整的表皮层与真皮层。用一对镊子夹住组织条的真皮部分，另一对镊子夹住表皮边缘。将真皮与表皮从两端轻轻剥离，使分离后的组织片保留在同一盖子上。尽量快速完成此操作，并对每一块组织重复该步骤。
  9. 将真皮组织片转移至另一含有PBS的100 mm培养皿中。
  10. 使用实验室镊子，将真皮组织片放入含有3 mL 0.3%胰蛋白酶/PBS的15 mL聚丙烯管中。在37 °C水浴中孵育10–20分钟，每隔2–3分钟轻轻倒置混匀数次。
  11. 为终止酶反应，加入3–5 mL冰冷新鲜完全培养基（含10% FBS的Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]或RPMI）。剧烈涡旋混匀数次。将成纤维细胞悬液通过85 μm尼龙滤网（置于50 mL离心管顶部）过滤，以去除真皮碎片。
  12. 在4 °C条件下，以150 × g离心10分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于100–1,000 μL完全培养基中。
  13. 取细胞悬液与台盼蓝（稀释倍数为2倍）混合，填充血细胞计数室，计数总细胞数和活细胞数。
    注意：细胞活力取决于酶消化条件。为提高细胞回收率和活力，可将皮肤样本切成更小的片段。
  14. 在25 cm2组织培养瓶中，加入5 mL完全FBS培养基（DMEM，含10%经56 °C加热灭活60分钟的FBS，1% 1 M HEPES缓冲液，1% 100×非必需氨基酸混合液，1% 100× L-谷氨酰胺，1% 100×青霉素/链霉素，1% 100×丙酮酸钠），接种3–10 × 104个细胞。在37 °C培养箱中孵育。
    注意：活的成纤维细胞将在24小时内贴壁，并在2–3天内开始呈现纺锤形。
  15. 第2天，吸除含有非贴壁细胞的培养基，更换新鲜培养基。
    注意：由于培养基中的死细胞会影响活的成纤维细胞生长，必须去除非贴壁的死细胞。
  16. 每3–4天更换一次培养基，直至细胞达到70–80%融合度。
  17. 收获成纤维细胞时，先用PBS洗涤，然后在37 °C培养箱中用胰蛋白酶/EDTA溶液孵育3分钟。
  18. 为终止反应，加入3–5 mL预热的完全培养基（含10% FBS的DMEM或RPMI）。取部分细胞悬液，用血细胞计数板计数。以200 × g离心5分钟，吸除上清液。
  19. 在培养箱中，以37 °C培养成纤维细胞于PRP培养基（DMEM，20% PRP，1% 1 M HEPES缓冲液，1% 100×非必需氨基酸混合液，1% 100× L-谷氨酰胺，1% 100×青霉素/链霉素，1% 100×丙酮酸钠，2 U/mL肝素）中。
    注意：推荐的最低细胞密度为4,000个活细胞/cm2。
  20. 为评估PRP对成纤维细胞增殖的影响，将第2代成纤维细胞以每孔8 × 103个细胞的密度接种于24孔板中，分别在含不同PRP浓度（1%、5%、10%、20%、30%、40%和50%）并添加2 U/mL肝素的PRP培养基，或经典培养条件（10% FBS）下培养。培养7天后，向细胞中加入活细胞染料（细胞增殖紫染料），通过流式细胞术评估增殖情况。
  21. 为研究细胞骨架重排，将细胞以1 × 105个细胞/mL的浓度接种于96孔黑/透明平底板中，使用补充0.5% FBS的完全FBS生长DMEM（见步骤2.14）培养24小时。随后用10% FBS或不同浓度PRP（1%、5%、10%、20%、30%、40%和50%）处理细胞，持续7天。 
    1. 用4%多聚甲醛固定成纤维细胞10分钟，室温下用0.1% Triton X-100透化5分钟。用50 mL浓度为5 U/mL的鬼笔环肽染色，PBS洗涤两次，再用50 mL浓度为1 mg/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记5分钟。 使用Cytation 3细胞成像多功能读板仪（BioTek）观察鬼笔环肽染色结果。

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结果

这项专利技术是一种简单、快速且可重复的医疗器械，用于制备标准化的富血小板血浆（PRP）。该系统为一步法全封闭系统，仅需将静脉全血在1,500 × g 条件下离心5分钟（得益于分离胶技术），即可完成PRP的制备。离心后获得的PRP已去除位于分离胶下方的红细胞和白细胞。经过数次颠倒混匀，位于分离胶上方的血小板重新悬浮于血浆中，此时PRP即可使用（图1）。

为评估制备过程中血细胞成分的可重复性，使用血液分析仪对10名不同患者的全血和富血小板血浆（PRP）样本进行了分析。经过设备处理后，大部分红细胞（RBCs）和白细胞（WBCs）被去除。与全血中的生理浓度相比，血小板平均浓度增加了1.5倍（图2）。

在自体培养体系中，将患者分离的成纤维细胞在不同浓度血小板富集血浆（PRP）（1−50%）条件下进行培养，并与经典培养基条件（10% FBS）进行比较。在不更换培养基的情况下培养7天后，20% PRP预处...

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讨论

与用于创面细胞治疗的其他填充材料相比，使用自体成纤维细胞作为天然替代物的优势包括良好的生物相容性、极少的副作用，以及取材和使用的便捷性。然而，在将这些治疗方法应用于日常临床实践之前，必须进行适当的临床前研究，以明确其生长特性，并评估分离得到的成纤维细胞在移植前后生物学功能和安全性。因此，在完成分离操作后，必须迅速进行细胞的体外扩增，以限制细胞分裂次数。培养条件必须严格控制，以确保最终自体生物制品的安全性和有效性。

在已发表的临床前研究中，通常选择第3至第4代的细胞进行注射，因为这些代次的细胞在细胞数量、增殖活性和分泌活性方面最为适宜15。大多数临床前研究均使用以胎牛血清（FBS）作为营养物质和生长因子来源的培养基16。然而，这种异种来源的生长添加剂存在引发感染和免疫反应的潜在风险。由于全球范围内牛群中曾出现牛海绵状脑病（BSE），监管机构对在细胞培养中使用FBS作为补充物存在较大担忧，主要原因是其可能将异种物质引入细胞治疗培养体系10。

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披露

本项目由 Regen Lab SA 资助。Sarah Berndt 担任 Regen Lab 的细胞治疗项目负责人，并受雇于 Regen Lab SA。Antoine Turzi 是 RegenLab 的首席执行官。

致谢

感谢 Grégory Schneiter 先生在流式细胞术数据分析方面的技术支持；感谢 Muriel Cuendet 教授（日内瓦大学药学院生药学实验室）允许使用 Attune 流式细胞仪和 Cytation 3 高通量显微镜；感谢 Brigitte Pittet 教授提供的科学建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔黑色透明平底板BD Falcon353219每箱 32 块
Cell trace Violet 染料Thermo Fischer ScientificC34557180 次检测
CuteCell PRPRegen Lab SACC-PRP-3T每包 3 支管
DAPISigmaD95421 mg
DMEMGibco52400-025500 mL
FBSGibco10270106500 mL
谷氨酰胺 200 mMGibco25030024100 mL
血液学计数仪SysmexKK-21N
肝素 5000U LiquemineDrossapharm AG0.5 mL
HEPES 缓冲液 1MGibco15630-056100 mL
Liberase DHRoche5401054001每包 2 × 5 mg
MEM NEAA 100xGibco11140-035100 mL
丙酮酸钠 1 mg/mLGibco11360-039100 mL
青霉素-链霉素Gibco15140122100 mL
鬼笔环肽 Alexa Fluor 488Molecular ProbesA12379300 次使用
RPMIGibco31966-021500 mL
胰蛋白酶 1x 0.25%Gibco25050-014100 mL
胰蛋白酶-EDTA 0.25%Gibco25200056100 mL

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