本方案介绍了一种可制备富血小板血浆（PRP）的装置，用于在100%自体成纤维细胞培养系统中促进细胞的体外扩增。
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本文内容
摘要
摘要
目前，自体成纤维细胞在皮肤修复中的临床应用受到广泛关注。大多数情况下，需要在体外培养皮肤细胞。然而，使用异种或同种异体培养基进行细胞培养存在一些缺点（例如，传染性病原体传播的风险或细胞扩增速度较慢）。本文建立了一种自体培养系统，利用患者自身的富血小板血浆（PRP）在体外扩增人皮肤成纤维细胞。在患者接受腹部成形术的同时，分离其真皮成纤维细胞。使用添加胎牛血清（FBS）或PRP的培养基对细胞培养过程进行为期最长7天的观察。评估PRP制备物中的血细胞含量、细胞增殖能力以及成纤维细胞的分化情况。本方案描述了使用专用医疗器械制备标准化、未激活状态PRP的方法。该制备过程仅需一种医疗器械（CuteCell-PRP）和离心机。在具备充分医疗操作条件的情况下，该装置构成一个一步式、无热原、无菌的封闭系统，仅需一次温和离心（1,500 × g，5分钟）。离心后，血液成分分层，富血小板血浆可被轻松收集。该装置可快速、稳定且标准化地制备PRP，适用于作为体外人细胞扩增的培养补充剂。所获得的PRP中血小板浓度较全血提高1.5倍，同时优先去除了红细胞和白细胞。结果表明，与FBS相比，PRP对细胞增殖具有显著促进作用（达7.7倍），且成纤维细胞在PRP处理后被有效激活。
引言
再生医学旨在修复或替换因年龄、疾病或创伤而受损的组织和器官，并纠正先天性缺陷。在自体治疗中，从患者体内取出细胞或组织，经扩增或修饰后，再重新引入供体体内。这种治疗方法在皮肤科领域具有广阔的应用前景1。在自体成纤维细胞治疗中，培养患者的成纤维细胞并重新注射，以治疗皱纹、褶皱或痤疮瘢痕。由于成纤维细胞是真皮中的主要功能细胞，注射自体成纤维细胞在面部年轻化方面可能比其他疗法更具优势2。
在皮肤中，成纤维细胞负责合成和分泌细胞外蛋白（如胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸和糖胺聚糖）。它们还释放生长因子，以调节正常皮肤稳态和伤口愈合过程中的细胞功能、细胞迁移以及细胞-基质/细胞-细胞相互作用3。真皮成纤维细胞已被提出作为皮肤伤口愈合4、组织再生5或在美容和整形外科手术中作为真皮填充剂的一种潜在临床细胞疗法6。一些研究甚至表明，在再生医学背景下，成纤维细胞可能比间充质干细胞更实用且更有效的细胞治疗选择7。
为了获得足够数量的成纤维细胞用于临床应用，通常必须进行细胞扩增。体外细胞培养需要在基础培养基中添加生长因....
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方案
本研究方案遵循《赫尔辛基宣言》的原则，所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。皮肤样本取自在瑞士日内瓦大学医院（日内瓦，瑞士）整形、重建与美容外科接受腹部成形术的健康女性。该研究程序符合《赫尔辛基宣言》的原则，并已获得当地机构伦理委员会的批准（方案编号 #3126）。
1. PRP 的制备
注意：CuteCell-PRP 采血管（材料表）专为在封闭系统中从小体积患者血液快速制备富血小板血浆（PRP）而设计。
- 全血采集
注意：根据医疗机构的采血规程，使用与PRP管直接连接的蝶形针从手臂的外周静脉采集自体血。如果患者处于麻醉状态，可通过静脉留置针直接抽取血液。- 打开PRP管的泡罩包装。进行静脉穿刺，并用全血填充所需数量的PRP管。管内的负压将自动采集所需的血量（约10 mL）。
- 轻柔地将管子上下颠倒数次，使血液与抗凝剂充分混合。
- 在生物安全柜（II级）内，使用1 mL注射器吸取100 µL全血，用于后续血细胞计数。
- 离心
注意：启动离心机前，确保其已正确配平。- 采集完血液后，如有需要，可另取一个配平管（单独提供），加入与PRP管中血液等量的水作为平衡对照。将装有血液的管子与配平管对称放置于离心机中，....
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结果
这项专利技术是一种简单、快速且可重复的医疗器械，用于制备标准化的富血小板血浆（PRP）。该系统为一步法全封闭系统，仅需将静脉全血在1,500 × g 条件下离心5分钟（得益于分离胶技术），即可完成PRP的制备。离心后获得的PRP已去除位于分离胶下方的红细胞和白细胞。经过数次颠倒混匀，位于分离胶上方的血小板重新悬浮于血浆中，此时PRP即可使用（图1）。
为评估制备过程中血细胞成分的可重复性，使用血液分析仪对10名不同患者的全血和富血小板血浆（PRP）样本进行了分析。经过设备处理后，大部分红细胞（RBCs）和白细胞（WBCs）被去除。与全血中的生理浓度相比，血小板平均浓度增加了1.5倍（图2）。
在自体培养体系中，将患者分离的成纤维细胞在不同浓度血小板富集血浆（PRP）（1−50%）条件下进行培养，并与经典培养基条件（10% FBS）进行比较。在不更换培养基的情况下培养7天后，20% PRP预处.......
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讨论
与用于创面细胞治疗的其他填充材料相比，使用自体成纤维细胞作为天然替代物的优势包括良好的生物相容性、极少的副作用，以及取材和使用的便捷性。然而，在将这些治疗方法应用于日常临床实践之前，必须进行适当的临床前研究，以明确其生长特性，并评估分离得到的成纤维细胞在移植前后生物学功能和安全性。因此，在完成分离操作后，必须迅速进行细胞的体外扩增，以限制细胞分裂次数。培养条件必须严格控制，以确保最终自体生物制品的安全性和有效性。
在已发表的临床前研究中，通常选择第3至第4代的细胞进行注射，因为这些代次的细胞在细胞数量、增殖活性和分泌活性方面最为适宜15。大多数临床前研究均使用以胎牛血清（FBS）作为营养物质和生长因子来源的培养基16。然而，这种异种来源的生长添加剂存在引发感染和免疫反应的潜在风险。由于全球范围内牛群中曾出现牛海绵状脑病（BSE），监管机构对在细胞培养中使用FBS作为补充物存在较大担忧，主要原因是其可能将异种物质引入细胞治疗培养体系10。
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披露
本项目由 Regen Lab SA 资助。Sarah Berndt 担任 Regen Lab 的细胞治疗项目负责人，并受雇于 Regen Lab SA。Antoine Turzi 是 RegenLab 的首席执行官。
致谢
感谢 Grégory Schneiter 先生在流式细胞术数据分析方面的技术支持；感谢 Muriel Cuendet 教授（日内瓦大学药学院生药学实验室）允许使用 Attune 流式细胞仪和 Cytation 3 高通量显微镜；感谢 Brigitte Pittet 教授提供的科学建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔黑色透明平底板 | BD Falcon | 353219 | 每箱 32 块 |
| Cell trace Violet 染料 | Thermo Fischer Scientific | C34557 | 180 次检测 |
| CuteCell PRP | Regen Lab SA | CC-PRP-3T | 每包 3 支管 |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 mg |
| DMEM | Gibco | 52400-025 | 500 mL |
| FBS | Gibco | 10270106 | 500 mL |
| 谷氨酰胺 200 mM | Gibco | 25030024 | 100 mL |
| 血液学计数仪 | Sysmex | KK-21N | |
| 肝素 5000U Liquemine | Drossapharm AG | 0.5 mL | |
| HEPES 缓冲液 1M | Gibco | 15630-056 | 100 mL |
| Liberase DH | Roche | 5401054001 | 每包 2 × 5 mg |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140-035 | 100 mL |
| 丙酮酸钠 1 mg/mL | Gibco | 11360-039 | 100 mL |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | 100 mL |
| 鬼笔环肽 Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A12379 | 300 次使用 |
| RPMI | Gibco | 31966-021 | 500 mL |
| 胰蛋白酶 1x 0.25% | Gibco | 25050-014 | 100 mL |
| 胰蛋白酶-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | 100 mL |
参考文献
- Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. Autologous therapies in dermatology. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).
- Martin, I., et al. The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.<....
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重印与许可
