鉴于G蛋白偶联受体（GPCRs）是极具潜力的药物靶点，因此GPCR配体筛选对于发现先导化合物以及开展孤儿受体去孤儿化研究至关重要。为此，我们介绍了PRESTO-Tango，这是一个开源资源平台，利用基于TEV的报告基因检测方法，可同时对近300种GPCR上β-阻遏蛋白2（β-arrestin2）的瞬时招募进行分析。
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本文内容
摘要
摘要
作为最大且功能最多样化的基因超家族，G蛋白偶联受体（GPCRs）介导多种细胞信号通路，是制药行业最具前景的靶点之一。因此，设计、实施和优化GPCR配体筛选实验至关重要，因为这些实验是药物发现以及调控GPCR药理学效应和结果的远程控制工具。过去，依赖G蛋白的检测方法主导了这一研究领域，主要通过检测配体诱导的事件并定量第二信使的生成来实现。然而，随着功能选择性概念的提出，以及人们对多种不依赖G蛋白的信号通路及其相关局限性的认识不断加深，科研界正积极推动开发替代性的GPCR配体筛选方法。为此，我们介绍了一种此类资源的应用——PRESTO-Tango平台，这是一种基于荧光素酶报告基因的系统，能够并行且同时对整个人类GPCR组（GPCR-ome）进行分析，这一目标在过去被认为在技术和经济上均难以实现。该平台基于不依赖G蛋白的β-arrestin2招募检测方法，由于β-arrestin2在GPCR介导的转运和信号传导中具有普遍性，PRESTO-Tango成为研究约300种非嗅觉人类GPCR（包括约100种孤儿受体）的合适工具。PRESTO-Tango具有高灵敏度和强稳健性，适用于使用化合物库进行初筛的高通量筛选，可用于发现已知药物的新GPCR靶点，或为孤儿受体寻找新的配体。
引言
G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大且最多样化的一类跨膜蛋白，作为细胞与其环境之间通信的界面1。GPCRs的多功能性体现在其能够识别多种多样的配体——从神经递质到核苷酸、多肽到光子，以及其他许多类型——同时还体现在其调控多种下游信号级联反应的能力上，这些信号通路参与了细胞生长、迁移、分化、凋亡、细胞放电等过程2,3。鉴于其广泛存在并参与多种生理过程，该受体家族在治疗上具有极其重要的意义，目前超过三分之一的处方药物均以GPCRs为靶点，这一事实充分说明了其重要性4。然而，现有的治疗药物仅作用于该超家族中的一小部分（估计约10%），许多GPCRs的药理学特性仍不明确。此外，超过100种GPCRs仍属于孤儿受体，因其尚未被匹配到内源性配体5。因此，GPCR配体筛选在去孤儿化和药物开发中至关重要，它为先导化合物的发现与优化，乃至进入临床试验阶段，铺平了道路。
G蛋白偶联受体（GPCR）配体筛选的传统方法通常分为两类：依赖G蛋白的功能性检测和不依赖G蛋白的功能性检测6。GPCR信号转导由异源三聚体G蛋白（Gαβγ）调控，其激活机制是Gα亚基上结合的GDP被GTP取代
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方案
1. 初筛：细胞培养与铺板
- 使用电子多通道移液器或试剂分配器，在白色或黑色384孔光学底板中每孔加入20 μL浓度为25 μg/mL的聚-L-赖氨酸（PLL）储备液，以制备PLL包被的培养板。室温孵育0.5–2 h。
注意：若使用黑色384孔板，其背景信号将低于白色板。建议使用黑色板以减少相邻孔之间的发光串扰。 - 为保存包被板并洗去多余的PLL，将PLL溶液在水槽上方轻甩去除，于纸巾上轻拍干燥，然后使用电子多通道移液器或试剂分配器每孔加入40 μL稀释后的1×抗生素-抗真菌素溶液。将PLL包被板储存在4 °C，直至准备进行铺板。
- 将HTLA细胞（由Dr. Richard Axel惠赠）——一种稳定表达β-arrestin2-TEV和tTA驱动的荧光素酶的人胚肾细胞系（HEK293T）——在含5%胎牛血清、5%小牛血清、2.5 μg/mL嘌呤霉素、50 μg/mL潮霉素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中培养。
- 将HTLA细胞在150 mm培养皿中培养，每周传代两次，传代稀释比例为1:10，最佳传代次数为5–25次。根据初筛实验的规模，确保在384孔板铺板当天有足够的150 mm培养皿达到汇合状态。
注意：HTLA细胞传代次数超过25次可能导致活力下降，从而产生次优结果。 - 为初筛实验....
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结果
采用本文所述的PRESTO-Tango方案，使用嗜铬颗粒（CG）提取物对168种非嗅觉G蛋白偶联受体（GPCR）靶点进行了筛选，其中大多数为孤儿受体。该提取物的谱型分析基于Barnea等人18设计的原理，通过检测所选受体上β-阻联蛋白2（β-arrestin2）的募集情况来完成（图1）。将感兴趣的GPCR质粒cDNA从PRESTO-Tango GPCR试剂盒中取出，并按所需布局组装至两个96孔板中。总共转染了四块接种HTLA细胞的384孔板，因为每个96孔DNA板的两半分别扩展为一个完整的384孔板，从而使每个受体在两个象限中被转染（共八个384孔板）。其中两个象限之一用CG提取物进行刺激；换言之，交替的C–D、G–H、K–L和O–P行代表（+）刺激条件（图2）。在初筛检测的168个GPCR中，仅有两个受体可被视为潜在的活性靶点，分别为多巴胺受体D3（DRD3）和视蛋白5（OPN5）。DRD3产生的log2倍变化值显著，达4.70，而OPN5的响应略低，为2.39，两者均.......
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讨论
构象动态变化的G蛋白偶联受体（GPCR）是信号转导的关键分子。这些七次跨膜受体的配体结合口袋具有特定的理化性质，加之其重要的生理功能，凸显了开发GPCR配体筛选工具的必要性。如上所述，PRESTO-Tango检测方法具有快速、灵敏且操作简便的优点，适用于药物研发。该检测不仅能测量激动剂诱导的受体激活，还可用于量化拮抗剂和别构调节剂的活性19。鉴于功能选择性这一概念——即不同结构的药物分子可在同一受体上引发不同的信号级联反应——通过G蛋白依赖性检测评估G蛋白通路的激活，并与PRESTO-Tango检测中的β-阻遏蛋白招募结果进行比较，有助于设计出副作用更少的先导化合物。值得注意的是，由于该方法不依赖于G蛋白偶联的检测，因此能够识别那些在传统G蛋白依赖性检测中无法发现的孤儿GPCR的偶联伙伴。
为确保 PRESTO-Tango 筛选的一致性和稳健性，必须谨慎对待实验方案的每一步骤，因为该平台的特性会放大任何引入的干扰因素。当然，所有高通量筛选（HTS）实验中通用的一些基本措施也需加以考虑，例如使用同一批次/配方的试剂，以确保在整个实验过程.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作由加拿大卫生研究院（CIHR 资助号 #MOP142219）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 384孔光学底板，聚苯乙烯聚合物基底，细胞培养处理，黑色，带盖，无菌 | NUNC | 12-566 | |
| 384孔光学底板，聚苯乙烯聚合物基底，细胞培养处理，白色，带盖，无菌 | NUNC | 12-566-1 | |
| 384孔圆底，聚丙烯材质，未处理，蓝色，非无菌，不带盖 | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Wisent | 450-115-EL | |
| D-荧光素钠盐 | GoldBio | LUCNA | |
| 含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer，12通道，可调式，15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer，12通道，可调式，5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2x3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| 青霉素-链霉素 | Wisent | 450-201-EL | |
| 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR试剂盒 | Addgene | Kit #1000000068 |
参考文献
- Liapakis, G., et al. The G-protein coupled receptor family: actors with many faces. Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology.
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重印与许可
