通过气管切开术进行通气并结合动脉内血压监测的小鼠脑死亡诱导

摘要

我们提出一种用于诱导小鼠脑死亡的模型，以评估脑死亡的病理生理学效应在实体器官移植背景下对器官及其后续移植物的影响。

摘要

尽管活体捐献和循环死亡后捐献为器官移植提供了替代来源，但脑死亡（BD）后捐献仍是实体器官移植的主要供体来源。然而，脑功能的不可逆丧失已知会引发多种病理生理变化，包括血流动力学及激素水平的改变，最终导致全身性炎症反应。目前能够对这些效应进行体内系统研究的模型十分有限。本文介绍一种小鼠脑死亡诱导模型，有助于深入研究脑死亡对同种异体移植物质量的严重影响。在通过颈总动脉建立动脉内血压监测，并经气管造口实现可靠通气后，利用球囊导管逐步升高颅内压以诱导脑死亡。脑死亡诱导4小时后，可获取器官用于分析或进一步的移植操作。该策略可在小鼠模型中对供体脑死亡进行系统性分析，从而加深对实体器官移植中脑死亡相关效应的理解，并可能为优化器官预处理方案提供新途径。

引言

目前，移植是治疗终末期器官衰竭的唯一治愈性手段。迄今为止，脑死亡（BD）患者一直是器官捐献的主要来源，尽管活体捐献和循环死亡后捐献也是有价值的替代方式¹。BD 的定义包括不可逆的昏迷（病因明确）、脑干反射消失以及呼吸停止²。然而，BD 供体器官在长期移植物存活率方面表现较差，这种差异独立于人类白细胞抗原（HLA）配型不匹配和冷缺血时间³。与此同时，针对这一抗原非依赖性风险因素的深入研究已揭示出由 BD 引发的三大主要病理生理改变：血流动力学、内分泌和炎症反应方面的变化⁴。

迄今为止，啮齿类动物的实验性脑死亡模型主要使用大鼠进行。为了更深入地了解脑死亡后对实体器官的免疫学影响，我们旨在建立一种小鼠脑死亡模型，因为目前只有小鼠模型能够对遗传或免疫因素进行系统性研究。在此背景下，小鼠体系提供了更为丰富的分析工具。

此处所述的脑死亡（BD）诱导原理基于通过将球囊导管插入颅骨下方并充气，从而增加颅内压。升高的颅内压通过阻断大脑、小脑和脑干的灌注，模拟了脑死亡的生理机制^5,6。为确保外周器官得到充分灌注，手术过程中必须进行血压监测。用于此目的的导管同时可用于输注生理盐水，通过液体替代来稳定血压。由于脑死亡伴随自主呼吸停止，必须保证充分通气。使用电热毯维持生理核心体温。

总之，该模型将有助于深入研究BD诱导的损伤对白细胞迁移⁷、补体激活⁸、缺血再灌注损伤⁹及其他因素的影响。

方案

动物实验遵循由美国国家医学研究协会制定的《实验室动物护理原则》以及由美国国家科学院编制、美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 86-23，1985 年修订版）。所有实验均获得奥地利教育、科学和文化部（BMWF-66.011/0071-II/3b/2012）批准。

1. 动脉插管

1. 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪¹⁰ 以及根据当地实践使用的镇痛剂（例如布托啡诺）对小鼠进行麻醉。用镊子夹捏后肢以确认麻醉深度是否合适。
   注意：本研究使用8−12周龄的雄性C57BL/6N小鼠（体重20−25 g）。作者曾尝试同龄雄性BALB/c小鼠但未成功，尚未测试其他品系（见讨论部分）。
2. 使用电动剃刀去除感兴趣区域（头部、颈部）的毛发。确保无松散毛发残留，以防伤口污染。随后用70%乙醇/氯己定/聚维酮碘对术区进行消毒，并将小鼠仰卧位固定，头部朝向术者。
3. 使用解剖剪在颈部正中做一切口。
4. 解剖下颌下腺和颈部肌肉组织并将其分离，以暴露颈总动脉。主要使用镊子进行钝性分离。
5. 在右侧颈总动脉下方放置三根8-0丝线结扎线。
6. 在近端结扎线上放置夹子，并对动脉施加张力，以阻断血流。
7. 结扎最远端的结扎线。
8. 通过切口颅侧预先制作的皮肤小孔插入动脉导管。若导管管腔过大，可挤压并变形以减少血液反流。使用三根结扎线将导管固定。
9. 将导管缝合固定于皮肤，以防移位。可通过缝线（例如5-0单股不可吸收缝线）将导管与预置皮肤小孔周围的皮肤连接固定。

2. 气管切开术

1. 使用镊子钝性分离气管前肌群。
2. 在气管下方放置两根8-0丝线结扎线。
3. 使用显微剪尽可能靠近近端进行气管切开，以避免单侧通气。在两个气管软骨环之间沿水平方向剪开。
4. 插入通气管，并用两根预先准备好的结扎线固定。
   注意：气管近端无需结扎。
5. 使用连续缝合方式缝合皮肤（例如，6-0单股非吸收缝线）。
6. 以每分钟150次的频率、200 µL的潮气量对小鼠进行通气。

3. 脑死亡诱导

1. 将小鼠置于俯卧位。
2. 使用手术剪和镊子夹住皮肤，去除颅骨上的皮肤。
3. 在左侧顶叶皮层上方旁中线处钻一个直径为1 mm的孔，钻孔时在穿透内层致密骨板和硬脑膜前停止操作。
4. 使用钝头镊子穿透颅骨最后的组织桥接部分，并去除锐利边缘。
5. 插入球囊导管，确保其完全位于颅腔内。确保球囊已预先充满生理盐水，并排尽所有空气。
6. 借助注射泵，在10−15分钟内以约0.1 mL/min的速度开始充胀（总体积为0.8−1.2 mL）。
   注意：小鼠将出现肌阵挛、瞳孔散大、进一步的癫痫样活动以及临终样喘息。
7. 当小鼠尾巴变得僵硬并竖起时，判定其脑死亡。
   注意：脑死亡通过特征性的初期血压峰值（库欣反射）、脑干反射消失以及自主呼吸停止来确认。实验过程中应避免常规进行呼吸暂停测试，因为小鼠可能因缺氧而出现循环不稳定。
8. 停止球囊导管的充胀。
9. 在小鼠身上覆盖加热毯，以防止低体温。

4. 脑死亡期间

1. 定期监测并记录血压。排除出现持续低血压阶段的小鼠（平均动脉压 [MAP] < 50 mmHg 持续 >30 分钟）。
2. 每 30 分钟输注 0.1 mL 生理盐水，以稳定小鼠的血压。
   注：本研究中每只小鼠共给予 0.8 mL 生理盐水。
3. 脑死亡持续 4 小时后，采集小鼠器官/组织。若实验结束时小鼠心脏已停止跳动，则将该小鼠排除出实验。

5. 假手术操作

1. 执行步骤 1.1−3.3。
   注意：不要切开内层密质骨。不要插入或扩张球囊导管。
2. 密切观察小鼠，持续监测其状态。使用镊子反复夹捏后肢，以确认麻醉深度。若小鼠出现苏醒迹象（根据我们的经验，通常发生在麻醉后约 2−3 小时），应皮下追加麻醉剂（剂量约为初始剂量的 1/2）。
3. 静脉输注的生理盐水量应与脑死亡（BD）小鼠相同。
   注意：假手术小鼠在停止通气后将恢复自主呼吸，而脑死亡（BD）小鼠则不会。建立模型时应进行呼吸暂停测试，但在实验过程中应避免该操作，以防止不必要的生理应激。

结果

小鼠BD模型已成功实施100余次，成功率超过90%。此外，干预后的心脏和肾脏器官移植也已安全开展。⁷.

BD 会引发多种病理生理变化，可利用此模型进一步研究。如图1所示，血压首先出现一过性高血压峰值，随后进入持续的低血压阶段。为避免低血压带来的有害生理影响，将长时间血压不足的小鼠（平均动脉压 < 50 mmHg 持续超过 30 分钟）予以排除。

另一个被广泛证实的观察结果是，脑死亡（BD）的诱导会导致免疫系统的激活。在脑死亡持续4小时后，器官特异性免疫标志物在mRNA水平出现上调图2以及观察到免疫细胞的迁移⁷.

...

讨论

脑死亡（BD）是多器官捐献者移植物质量的一个风险因素，其涉及多种病理生理变化，这些变化只能通过体内模型进行充分评估。血流动力学变化、细胞因子风暴、激素水平改变及其对器官移植物质量和存活率的最终影响，无法在体外进行分析⁴。大多数基础移植研究以及免疫学研究都依赖于复杂的诊断工具，而这些工具目前仅在小鼠模型中广泛可用。小鼠模型已在与脑死亡相关的研究中带来了一系列新见解^7,8,9。

尽管在20世纪，BD研究的首批模型已在狒狒、狗和猪中建立^11,12，但直到1996年才首次报道了大鼠模型¹³。又经过了14年，维也纳研究团队于2010年首次发表了BD的小鼠模型^6<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动脉导管（BD Neoflon 26G）	BD	391349
血压换能器（APT300）	Harvard Apparatus Inc.	73-3862
Fogarty 动脉取栓导管 N° 3	Edwards Lifesciences Corporation	120403F
镊子	FST	11271-30
带柔性探头的恒温毯系统	Harvard Apparatus Inc.	55-7020
Ketansol	Graeub	6680110
显微剪刀	FST	15018-10
持针器	FST	12060-02
Prolene 5-0	Ethicon	8698H
Pump 11 Elite 单通道输注泵	Harvard Apparatus Inc.	70-4500
剪刀	FST	14075-11
体视显微镜	Olympus	SZX7
透气胶带（Transpore Tape）	3M	1527-1
护理垫	Molinea.A	274301
小鼠呼吸机（MiniVent Model 845）	Harvard Apparatus Inc.	73-0043
Xylasol	Graeub	7630109