成年大鼠复合再生性外周神经接口（C-RPNI）的制备

摘要

以下手稿描述了一种用于开发生物性闭环神经反馈系统的新方法，该系统称为复合再生性外周神经接口（C-RPNI）。该结构能够与外周神经整合，以放大传出运动信号，同时提供传入感觉反馈。

摘要

神经假体领域的最新进展使得肢体缺失者能够重现缺失肢体原有的多种功能，这通常是通过与周围神经系统整合来实现的。然而，目前采用的方法往往伴随显著的组织损伤，从而限制了其长期使用。此外，这些装置通常缺乏有意义的感觉反馈，因为其复杂的结构会削弱使用者在使用较简单假体时所依赖的振动或其他感觉。复合式再生性周围神经接口（C-RPNI）被开发为一种稳定的生物结构，能够在放大传出运动神经信号的同时，提供同步的传入感觉反馈。C-RPNI由一段游离的真皮和肌肉移植物组成，包裹于目标混合感觉运动神经周围，其中运动神经优先进入肌肉移植物并实现再支配，而感觉神经则优先进入真皮移植物并实现再支配。在大鼠模型中，该结构已显示出可产生复合肌肉动作电位（CMAPs），将目标神经信号从微伏级放大至毫伏级，信噪比平均约为30–50。刺激该结构的真皮组分可在近端神经处引发复合感觉神经动作电位（CSNAPs）。因此，该结构在实现理想、直观假体的未来应用中展现出广阔前景。

引言

肢体截肢影响着近1/190的美国人¹，预计其发生率将从目前的160万上升到2050年的超过360万²。尽管已有超过千年的使用记录，理想的假肢至今仍未实现³。目前，已存在能够进行多关节操作的复杂假肢，具备复制原生肢体多种运动功能的潜力^4,5。然而，这些装置并不被认为是直观的，因为期望的假肢运动通常在功能上与输入控制信号相互分离。使用者通常认为这些"先进假肢"难以掌握，因此不适合日常使用^1,6。此外，目前市场上的复杂假肢无法提供任何显著程度的细微感觉反馈以实现充分控制。触觉和本体感觉对于完成日常任务至关重要，缺乏这些感觉时，诸如拿起一杯咖啡之类的简单动作都会变得困难，只能完全依赖视觉提示^7,8,9。由于这些原因，先进假肢常与显著的精神疲劳相关，常被描述为负担沉重且不令人满意^5,10,11。为解决这一问题，一些研究实验室已开发出可通过直接神经交互提供有限程度感觉反馈的假肢^12,13,14,15，但反馈通常仅限于手部和手指的小范围、分散区域^12,13，且有时被报告为疼痛或不自然¹⁵。遗憾的是，这些研究中的许多缺乏任何显著的长期随访以及神经组织学分析，以阐明局部组织效应，同时观察到接口在数周至数月内出现失效¹⁶。

对于这一人群而言，理想的假体装置应在使用者的整个生命周期内，提供高保真的运动控制以及来自个体环境的有意义的体感反馈。实现这种理想假体的关键在于开发一种稳定且可靠的接口，能够同时传递传入的体感信息和传出的运动信号。目前最有前景的人机接口是那些直接与周围神经系统相互作用的接口，神经整合型假体领域的最新进展正致力于弥合生物电信号与机械信号之间的鸿沟¹⁷。当前使用的接口包括：柔性神经电极板^14,15,18、神经外袖带电极^{13,19,20,21,22,23}、穿透组织电极^24,25,31,32以及束内电极^26,27,28。然而，这些方法在神经特异性、组织损伤、轴突变性、髓鞘减少和/或与长期植入异物反应相关的瘢痕组织形成方面均表现出局限性^16,17,18,19。最近有研究推测，导致植入电极最终失效的一个驱动因素是电子材料与天然神经组织之间杨氏模量的显著差异。脑组织每日都会经历显著的微小运动，理论认为，杨氏模量差异引起的剪切应力会导致炎症反应并最终形成永久性瘢痕^30,31,32。这种效应在四肢中往往更为显著，因为周围神经不仅受到生理性的微动影响，还受到肢体主动大范围运动的影响。由于这种持续不断的运动，可以合理推断，完全非生物的周围神经接口并不理想，而包含生物组分的接口将更为合适。

为满足对生物组分的需求，本实验室开发了一种称为再生性外周神经接口（Regenerative Peripheral Nerve Interface, RPNI）的生物神经接口，用于将残肢中外周神经的断端与假肢装置相整合。RPNI的制备包括将外周神经通过手术植入自体游离肌肉移植物中，随后该移植物实现再血管化并重新神经支配。过去十年中，本实验室不断完善这一生物神经接口，在动物和人体试验中，将其与植入式电极结合使用时，成功实现了运动信号的放大与传输，从而实现具有多个自由度的适宜假肢控制^2,34。此外，我们还独立开发了基于嵌入皮肤移植物中外周神经的皮肤感觉接口（Dermal Sensory Interface, DSI），用于实现感觉反馈^3,35。在更远端的截肢情况下，由于目标外周神经内的运动束和感觉束可通过手术分离，因此可同时使用上述两种结构。然而，在更近端的截肢中，由于运动纤维与感觉纤维相互混杂，这种分离不可行。为此，我们开发了适用于近端截肢的复合式再生性外周神经接口（Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface, C-RPNI），该接口将混合性感觉运动神经植入由游离肌肉移植物与一段皮肤移植物固定连接而成的复合结构中（图1）。外周神经表现出靶向性再神经支配的特性，因此感觉纤维将支配皮肤移植物，而运动纤维则支配肌肉移植物。该结构因而能够同时放大运动信号并提供躯体感觉反馈³⁶（图2），从而实现理想化、直观且复杂的假肢功能。

方案

所有动物实验均在密歇根大学动物使用与护理委员会批准后进行。

注意：供体大鼠在皮肤和肌肉取材手术前可自由进食和饮水。安乐死操作在深度麻醉下进行，随后通过心内注射氯化钾，并采用双侧气胸作为辅助方法。理论上，任何品系的大鼠均可用于本实验；然而，本实验室在2至4月龄、体重约200–250 g的雄性和雌性Fischer F344大鼠中获得了稳定一致的结果。供体大鼠必须与实验大鼠为同基因型。

1. 皮肤移植物的制备

1. 将供体大鼠置于诱导室中，使用含5%异氟烷的氧气溶液（流速0.8-1 L/min）进行麻醉。待大鼠麻醉后，将其从诱导室中取出，并连接至再呼吸鼻罩，将异氟烷浓度降低至2-2.5%以维持麻醉状态。
2. 皮下注射0.02-0.03 mL卡洛芬溶液（50 mg/mL）与0.2 mL无菌生理盐水混合液，用于镇痛。
3. 在双眼涂抹人工泪膏，以预防角膜溃疡。
4. 使用电动剪毛器剃除整个后肢下部、踝关节区域及足掌侧面的毛发。
5. 用酒精清洁选定的后肢及足底表面，随后使用碘伏溶液消毒，最后再用酒精擦拭一次，以去除残留的碘伏。
6. 使用手持式高速微型电机钻机，配备可拆卸圆形细粒抛光头（转速4000 rpm），对足底表面进行打磨以去除表皮。打磨过程中应持续滴加生理盐水，防止皮肤灼伤。真皮层将呈现光泽外观，并伴有针尖样出血。
7. 在下肢近端施加止血带，以减缓血流。
8. 使用#15手术刀锐性切除足底皮肤，并将其置于生理盐水浸湿的纱布中，防止干燥。此步骤中会连带去除部分肌腱和结缔组织，后续将进一步清除。
9. 用纱布包裹出血的足部以控制出血。若需制备两个构建物，则重复步骤1.5–1.9。
10. 在显微镜下（20倍放大）使用显微剪刀从皮片深层去除肌腱和结缔组织。操作时注意避免在移植物上造成穿孔。修薄后的真皮移植物应略呈半透明，仅含真皮层，大小约为0.5 cm × 1.0 cm。
11. 将处理好的移植物置于生理盐水浸湿的纱布中，待用于C-RPNI构建体制备。移植物应在获取后2小时内使用。

2. 肌肉移植物的制备

1. 使用#15手术刀从踝关节上方至膝关节下方，沿后肢下段前侧做一纵行切口。分离皮下组织，暴露其下方的肌肉组织。
2. 在切口远端，暴露下肢肌肉的肌腱止点。胫骨前肌（TA）通常是最大且位置最靠前的肌肉，其深面及后方为趾长伸肌（EDL）。将EDL远端肌腱与其他邻近肌腱分离，注意此时勿切断其止点。
3. 通过将镊子的两个尖端插入肌腱下方，并张开镊子施加向上压力，使肌腱产生移位，以确认所分离的肌腱是否正确。操作该肌腱时应引起所有脚趾同时伸展。
4. 使用锐性虹膜剪在远端进行肌腱切断术，并用肌腱剥离器（或其他钝头剪刀）钝性分离肌肉与其周围组织，由远向近端游离，以寻找其肌腱起点。
5. 当观察到近端肌腱后，再次使用锐性虹膜剪进行肌腱切断。将肌肉移植物置于生理盐水浸湿的纱布中，防止干燥。
6. 当所有所需移植物均从供体大鼠取出后，首先通过心内注射氯化钾（1–2 mEq K⁺/kg）实施安乐死，随后使用#15刀片进行双侧穿刺性气胸作为二次安乐死措施。

3. 腓总神经的分离与制备

1. 根据步骤 1.1–1.3 中所述方案，对实验大鼠进行麻醉并给予镇痛处理。
2. 剃除目标大腿部位的毛发，并用酒精和碘伏消毒，最后再用酒精擦拭以去除残留的碘伏。
3. 将动物从手术准备台转移至手术显微镜台，放置于带有体温探头的加热垫上以维持体温。维持异氟烷浓度为 2–2.5%，氧气流速为 0.8–1 L/min。
4. 标记切口线，从坐骨切迹远端稍下方延伸至膝关节下部。该切口线应位于股骨下方，并呈远离股骨的角度。使用 #15 刀片切开皮肤及下方的股二头肌筋膜。
5. 使用止血钳或钝头显微剪小心分离股二头肌，暴露其下方的间隙。
   注意：坐骨神经的走行方向大致与初始切口方向一致。该神经通常分为三个分支，其中腓肠神经位于后方，腓总神经和胫神经则分别浅层和深层越过膝关节。
6. 确认腓总神经（CP 神经）后，使用一对显微细尖镊子和显微剪，小心将其从其他坐骨神经分支中分离，并清除远端残余的结缔组织。
7. 在神经跨越膝关节表面的部位，使用显微剪锐性横断神经。
   注意：此步骤中使用锋利的剪刀极为重要，因为对神经造成明显创伤可能增加神经瘤形成的风险。
8. 仔细清除腓总神经上残留的任何结缔组织，并向近端游离神经，使其长度达到约 2 cm。

4. C-RPNI 构建体的制备

1. 从生理盐水浸湿的纱布上取下肌肉移植物，去除所有中央的腱性组织以及中央一小段肌外膜，保留两端的腱性结构完整。
2. 使用8-0尼龙缝线，在神经断端两侧各以两个间断缝合，将腓肠神经（CP神经）断端的神经外膜固定于肌肉移植物去除肌外膜的区域。
3. 在近端和远端分别使用单针6-0尼龙间断缝线，将肌肉移植物固定于股骨骨膜，使神经-肌肉连接处背向股骨。
   注意：固定时应使肌肉处于正常静息长度，避免显著拉伸或留有过多松弛。
4. 在肌肉移植物肌外膜的下缘中央位置放置一针8-0尼龙缝线，将其固定于腓肠神经的神经外膜，使神经在肌肉移植物内形成一定松弛度，以减轻日后活动时可能产生的张力。
5. 从生理盐水浸湿的纱布上取下皮肤移植物，将其覆盖在肌肉移植物上，完全包覆神经及大部分肌肉组织，确保真皮深层边缘贴附于肌肉表面。修剪超出肌肉边缘的多余真皮组织。
6. 使用8-0尼龙间断缝线，沿周向将皮肤移植物与肌肉移植物固定。通常根据构建物大小使用4至8针缝线。
7. 使用5-0铬制肠线连续缝合股二头肌筋膜，覆盖整个构建物。
8. 使用4-0铬制肠线连续缝合表层皮肤。
9. 用酒精棉片擦拭手术区域，并涂抹抗生素软膏。
10. 停止吸入麻醉，让大鼠在与笼内同伴隔离的情况下恢复，并提供独立的食物和水源。

结果

如果大鼠发生感染或未能存活过手术麻醉，则认为构建物制备失败。既往研究表明，这些构建物需要大约三个月的时间实现血管化和神经再支配^2,3,17,36。在为期三个月的恢复期后，可对构建物进行检测以评估其存活情况。若构建成功，三个月后手术暴露构建物将可见已血管化的肌肉和皮肤（图3）。有时，游离的肌肉和真皮移植物可能仅由瘢痕组织构成，和/或神经未与构建物连接；这些发现提示构建失败。然而，若构建成功，用镊子轻轻夹捏构建物近端的腓总神经可引起明显的肌肉收缩（视频1）。构建物的组织学分析应显示存活的皮肤、神经和肌肉组织（图4）。免疫染色还可显示运动神经和感觉神经分别再支配至神经肌肉接...

讨论

C-RPNI 是一种新型结构，可同时放大目标神经的运动传出信号，并提供传入感觉反馈。特别是对于上肢近端截肢者而言，C-RPNI 具有独特应用价值，因为他们的运动和感觉神经束在手术过程中难以通过机械方式分离。相反，C-RPNI 利用神经自身固有的优势性再支配特性，促进感觉纤维向皮肤感觉终器再生，以及运动纤维向神经肌肉接头再生。

由于C-RPNI的制备依赖于靶神经的再神经化能力，因此在操作过程中必须谨慎处理神经。在解剖过程中，应避免直接接触或损伤靶神经。如果必须操作神经，建议改而操作神经外膜或周围结缔组织。尽管本实验室在此类构建体中尚未观察到神经瘤的形成，但从理论上讲，严重的神经损伤可能会增加其发生风险。该过程中的另一个关键步骤是真皮移植物的获取。必须将后足移植物上的所有表皮组织彻底清除，因为残留的表皮可能在愈合过程中增加感染和包涵性囊肿的风险。此外，真皮移植物必须充分削薄，以促进移植物整体的血清浸润和血管再生，避免发生明显的缺血和坏死。

尽管目前使用C-RPNI进行的大多数研究都是在腓总神经上完成的，但任何混合性感觉运动神经均可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#15 手术刀	Aspen Surgical, Inc	Ref 371115	肋背碳钢手术刀片（#15）
4-0 慢性肠线缝合线	Ethicon	SKU# 1654G	P-3 反向切割针
5-0 慢性肠线缝合线	Ethicon	SKU# 687G	P-3 反向切割针
6-0 Ethilon 缝合线	Ethicon	SKU# 697G	P-1 反向切割针（尼龙缝合线）
8-0 单丝缝合线	AROSurgical	T06A08N14-13	黑色聚酰胺单丝缝合线，带螺纹锥形针
实验大鼠	Envigo	F344-NH-sd	大鼠为 Fischer F344 品系
Fluriso（异氟烷）	VetOne	13985-528-40	吸入性麻醉剂
高速微电机钻配磨头	Master Mechanic	Model 151369	手持式旋转工具；套件包含多种细粒度磨头
氧气	Cryogenic Gases	UN1072	标准医用级氧气罐
氯化钾	APP Pharmaceuticals	63323-965-20	注射用，2 mEq/mL
聚维酮碘 USP	MediChoice	65517-0009-1	10% 外用溶液，一瓶可用于多次手术前准备
Puralube Vet 眼科软膏	Dechra	17033-211-38	术中使用的眼角膜保护软膏
Rimadyl（卡洛芬）	Zoetis, Inc.	NADA# 141-199	注射用，50 mg/mL
体视显微镜	Leica	Model M60	用户可根据个人偏好调节放大倍数
外科手术器械	Fine Science Tools	Various	用户可根据个人偏好或实验室现有条件选择器械
三联抗生素软膏	MediChoice	39892-0830-2	软膏为无菌一次性包装
VaporStick 3	Surgivet	V7015	麻醉塔，可容纳异氟烷和氧气罐
Webcol 酒精消毒片	Coviden	Ref 6818	酒精消毒擦拭片；每次消毒使用新的擦拭片