功能化磁性纳米颗粒的合成、与铁载体去铁胺的偶联及其在细菌检测中的应用评价

摘要

本研究描述了磁性纳米颗粒的制备方法，其表面包覆 SiO₂，随后使用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）进行氨基功能化，并通过琥珀酰基团作为连接臂与去铁胺偶联。此外，还详细描述了对所有中间产物纳米颗粒及最终偶联物进行的深入结构表征，以及利用Y. enterocolitica进行的细菌捕获实验。

摘要

本研究描述了磁性纳米颗粒的合成，其表面包覆二氧化硅（SiO₂），随后使用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）进行氨基功能化，并通过琥珀酰基团作为连接臂与去铁胺（一种被Yersinia enterocolitica识别的铁载体）偶联的过程。

磁性纳米颗粒（MNP）中的磁铁矿（Fe₃O₄) 通过溶热法合成，并用 SiO 涂覆₂ (MNP@SiO₂) 采用Stöber法合成，随后经APTES功能化处理（MNP@SiO₂@NH₂）。随后，将去铁胺与MNP@SiO₂偶联。₂@NH₂ 通过碳二亚胺偶联反应得到 MNP@SiO₂@NH₂@Fa. 通过八种不同方法对偶联物及中间体的形貌和性质进行了表征，包括粉末X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、拉曼光谱、X射线光电子能谱（XPS）、透射电子显微镜（TEM）以及能量色散X射线（EDX）元素分布图。上述全面的表征结果证实了偶联物的成功形成。最后，为评估纳米颗粒的捕获能力与特异性，进行了细菌捕获实验检测 小肠结肠炎耶尔森菌.

引言

利用磁性纳米颗粒（MNP）进行细菌检测的方法基于抗体、适配体、生物蛋白或碳水化合物与MNP的偶联物对病原菌的分子识别作用¹。鉴于铁载体可被细菌外膜上的特异性受体识别，因此也可将其连接至MNP以提高检测特异性²。铁载体是一类参与细菌摄取Fe³⁺的小分子有机化合物^3,4。目前尚未见有关铁载体与MNP偶联物的制备及其用于细菌捕获与分离效果评价的报道。

将磁性纳米颗粒与小分子偶联的合成过程中，一个关键步骤是选择两者之间的键合类型或相互作用方式，以确保小分子能够固定在磁性纳米颗粒（MNP）表面。因此，制备磁性纳米颗粒与铁氧胺（feroxamine）——一种被Yersinia enterocolitica识别的铁载体——偶联物的过程，重点在于构建可修饰的MNP表面，从而通过碳二亚胺化学方法将铁载体共价连接至MNP表面。为了获得均一的磁铁矿纳米颗粒（MNP），并改善成核过程和粒径控制，采用苯甲醇进行溶剂分解反应，并在无振荡的加热模块中完成⁵。随后，通过Stöber法形成二氧化硅包覆层，以提供保护作用，并提高纳米颗粒在水相介质中悬浮液的稳定性⁶。考虑到铁氧胺的结构特点，需引入氨基官能团，以制备适用于与铁载体偶联的功能化纳米颗粒（MNP@SiO₂@NH₂）。该目标通过溶胶-凝胶法实现，即利用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）与经二氧化硅修饰的纳米颗粒（MNP@SiO₂）表面的羟基发生缩合反应而完成⁷。

同时，通过将市售的去铁胺与乙酰丙酮铁在水溶液中络合，制备了铁(III)去铁胺络合物。N-琥珀酰去铁胺通过去铁胺与琥珀酸酐反应获得，其上带有可作为连接基团的琥珀酰基团。

通过碳二亚胺化学法，在弱碱性介质中使用苯并三唑-1-基-氧-三（二甲氨基）磷六氟磷酸盐（BOP）和1-羟基苯并三唑（HOBt）作为偶联试剂，将MNP@SiO₂@NH₂与N-琥珀酰铁氧胺偶联，得到MNP@SiO₂@NH_@Fa⁸，以活化N-琥珀酰铁氧胺中的末端羧酸基团。

在对磁性纳米颗粒（MNPs）进行表征后，我们评估了未修饰及功能化磁性纳米颗粒捕获野生型（WC-A）以及缺失铁羟肟酸受体FoxA的Y. enterocolitica突变株（FoxA WC-A 12-8）的能力。将普通MNPs、功能化MNPs以及偶联物MNP@SiO₂@NH_@Fa分别与每种Y. enterocolitica菌株进行孵育。通过施加磁场将细菌-偶联物聚集体从细菌悬液中分离出来。分离得到的聚集体用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，重新悬浮于PBS中制备系列稀释液，随后进行平板培养以进行菌落计数。本实验方案详细展示了MNP@SiO₂@NH@Fa的合成各步骤、所有中间产物及最终偶联物的结构表征，以及一种用于评估偶联物相对于中间产物特异性的简便细菌捕获检测方法。⁹

方案

注意：对于在惰性气氛条件下进行的反应，所有玻璃器皿均预先在65 °C的烘箱中干燥，用橡胶隔垫密封，并用氩气吹扫三次。

1. 铁氧化胺偶联磁性纳米颗粒的合成

1. Fe₃O₄ 磁性纳米颗粒（MNPs）的合成
   1. 将 0.5 g Fe(acac)₃ 加入一个 20 mL 玻璃小瓶中，然后加入 10 mL 苯甲醇混合。
   2. 将该混合物超声处理 2 分钟，随后转移至加热块中，在 180 °C 下加热 72 小时。
   3. 反应完成后，让小瓶自然冷却，用 96% 乙醇冲洗纳米颗粒，并在 4000 x g 条件下离心 30 分钟。至少重复离心两次。
   4. 使用钕铁硼（NdFeB）磁铁通过磁力吸引将纳米颗粒与上清液分离，并弃去残余溶剂。
   5. 用 96% 乙醇重复步骤 1.1.4，并交替进行 40 kHz 超声处理 1 分钟，弃去上清液，直至溶剂变得澄清。
2. 磁性纳米颗粒的 SiO₂ 包覆（MNP@SiO₂）
   1. 在圆底烧瓶中加入磁力搅拌子，制备 2 g MNP 在 80 mL 异丙醇中的悬浮液，然后依次加入 4 mL 21% 氨水、7.5 mL 蒸馏水和 0.56 mL 正硅酸四乙酯（TEOS）。
   2. 在持续搅拌下于 40 °C 加热混合物 2 小时，然后超声处理 1 小时。
   3. 用磁铁分离 MNP，弃去上清液，并将其分散于 30 mL 异丙醇中。
   4. 重复步骤 1.2.1 和 1.2.2。
   5. 用 96% 乙醇清洗磁力搅拌子以回收全部材料。
   6. 使用磁铁通过磁力吸引将纳米颗粒与上清液分离。
   7. 弃去上清液，并用 96% 乙醇交替超声清洗纳米颗粒三次。
   8. 在室温下真空干燥纳米颗粒 12 小时。
3. MNP@SiO₂ 与 (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）的功能化修饰
   1. 在惰性气氛下，用 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）冲洗上一步所得的 500 mg MNP@SiO₂，然后在 40 kHz 条件下超声处理 1 分钟。弃去上清液后重复该过程三次。
   2. 将颗粒重新悬浮于圆底烧瓶中，在磁力搅拌下加入 9 mL APTES。
   3. 在 60 °C 下搅拌混合物 12 小时。
   4. 弃去上清液，并用 96% 乙醇交替超声清洗纳米颗粒三次。
4. 去铁胺衍生物 feroxamine 的合成
   1. 将 100 mg（0.15 mmol）甲磺酸去铁胺盐和 53.0 mg（0.15 mmol）Fe(acac)₃ 溶解于 5 mL 蒸馏水中，在室温下搅拌过夜。
   2. 在分液漏斗中用 20 mL 乙酸乙酯洗涤产物三次，然后使用旋转蒸发仪在减压下除去有机溶剂。
   3. 将水相冷冻干燥，得到红色固体形式的 feroxamine。
5. N-琥珀酰feroxamine 的合成
   1. 在惰性气氛下，向 50 mL 圆底烧瓶中加入 350 mg（3.50 mmol）琥珀酸酐至 100 mg（0.17 mmol）feroxamine 溶于 5 mL 吡啶的溶液中。
   2. 在室温下搅拌反应混合物 16 小时。之后，使用旋转蒸发仪在减压下除去多余的吡啶，得到深红色固体。
   3. 将粗反应产物溶于 3 mL 甲醇中。
   4. 将甲醇溶液转移至 Sephadex 柱（20 mm 直径柱中填充 20 cm Sephadex），以 0.5 mL/min 流速洗脱。
   5. 收集红色组分，并使用旋转蒸发仪在减压下除去甲醇。
6. 共轭物 MNP@SiO₂@NH@Fa 的合成
   1. 在惰性气氛下，用 DMF 将 30 mg 干燥的 MNP@SiO₂@NH₂ 冲洗两次，并在 100 mL 锥形瓶中于惰性气氛下超声处理 30 分钟。
   2. 在惰性气氛下，于 50 mL 圆底烧瓶中制备以下混合物（Mix A）：N-琥珀酰feroxamine（200 mg，0.30 mmol）、苯并三氮唑-1-基-氧-三（二甲氨基）磷六氟磷酸盐（BOP，173 mg，0.45 mmol）、1-羟基苯并三氮唑（HOBt，46 mg，0.39 mmol）和 N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，128.8 mg，1.21 mmol）溶于 10 mL DMF 中。
   3. 在氩气保护的无水无氧条件下，将先前冲洗过的 MNP@SiO₂@NH₂ 在 3 mL DMF 中超声悬浮（Mix B）。
   4. 将混合物 A 逐滴加入混合物 B 中。
   5. 将最终混合物在室温下置于轨道摇床上震荡过夜。
   6. 使用磁铁将生成的共轭物（MNP@SiO₂@NH@Fa）从悬浮液中分离。
   7. 冲洗所得固体，并用 10 mL 乙醇超声清洗五次。
   8. 在真空条件下干燥固体 24 小时。

2. 使用Y. enterocolitica菌株进行细菌检测以定量纳米颗粒对致病菌的捕获

1. 在无菌的 2 mL 管中，用 PBS 将所有中间纳米颗粒及最终偶联物配制成浓度为 1 mg/mL 的悬浮液。
2. 在 5 mL LB 肉汤中培养 Y. enterocolitica，于 37 °C 过夜培养。
3. 通过加入 50 µL 的 10 mM 2,2′-联吡啶，制备 5 mL 缺铁的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。
4. 取 50 µL 上述过夜培养的 Y. enterocolitica 菌液接种至 5 mL 缺铁 TSB 中，于 37 °C 振荡培养，直至 OD₆₀₀ 达到 0.5‒0.8。
5. 取步骤 2.4 中获得的菌液 100 µL，加入含有 900 µL PBS 的 2.0 mL 管中，得到 1/10 的初次稀释液；再用相同方法从该稀释液制备 1/100 稀释液，使细菌浓度约为 1 × 10⁶ 菌落形成单位（CFU）/mL。
6. 在 2.0 mL 管中，向 1 mL 的 1/100 稀释菌悬液中加入 100 µL 浓度为 1 mg/mL 的纳米颗粒悬浮液，并用涡旋振荡器混匀。
7. 于 20 °C 培养 1 小时。
8. 使用磁铁分离 MNP/细菌聚集体，并小心弃去上清液。
9. 用 1 mL PBS 对分离的纳米颗粒进行两次洗涤，每次均使用涡旋振荡器混匀。
10. 将纳米颗粒重悬于 1 mL PBS 中，用于测定捕获的细菌数量（CFU/mL）。
11. 从前一步的悬浮液中连续制备四次 1/10 稀释液，直至获得 1 × 10^-4 稀释度。
12. 取每种稀释液各 10 µL 点种于 TSB 琼脂平板上，于 37 °C 过夜培养。
13. 使用凝胶成像系统在透射白光模式下拍摄平板照片。利用适当的软件处理图像，放大局部区域以计数单个菌落数量。
    注意：每种 MNP 中间体均进行了表征，以追踪合成过程的进展。首先，采用 X 射线衍射（XRD）分析裸 MNP 的晶体结构；随后，对各中间体进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析，以检测相应反应中发生的化学变化；同时进行拉曼光谱分析，以验证 FT-IR 光谱得出的结论。热重分析（TGA）用于估算含有有机材料的中间体的失重情况。各中间体的形貌和尺寸通过透射电子显微镜（TEM）进行观察。最后，X 射线光电子能谱（XPS）分析对于确定各 MNP 中间体表面原子的氧化态以及确认偶联产物 MNP@SiO₂@NH@Fa 中共价键的形成至关重要。

结果

为了确定每种中间体及最终偶联物的形貌和性质，需进行全面的结构表征。为此，采用XRD、FT-IR、拉曼光谱、TGA、TEM、EDX元素分布图以及XPS等技术，以证明偶联物的形成。通过X射线光电子能谱（XPS）获得的纳米颗粒表面原子的氧化态数据，是确认纳米颗粒与铁载体之间形成共价键的最关键证据。与这些结果一致，本实验方案具有可重复性。

将裸露的磁性纳米颗粒（MNP）、功能化的磁性纳米颗粒（MNPs）以及偶联物分别与每种Y. enterocolitica菌株在磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中混合。利用磁铁将细菌-磁性纳米颗粒聚集体从悬浮液中分离出来。用PBS洗涤聚集体两次后，将其重新悬浮于PBS中，制备系列稀释液，并接种培养以进行菌落计数。

采用本方案制备的中间产物及最终偶联物通过多种技术进行表征，以展示合成过程中每一步所发生的变化。红外光谱和拉曼光谱是监测合成各步骤的简便快速方法。在傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和拉曼光谱（见下文）中，出现对应于Si-O、C-Si-C、Fe-O、酰胺键O=C伸缩振动以及羟肟酸O=C...

讨论

本方案描述了通过共价键将磁性纳米颗粒与铁载体去铁胺形成偶联物的合成方法。四氧化三铁的合成采用Pinna等人报道的方案⁵，随后进行二氧化硅包覆，以保护磁性核心在水相体系中免受腐蚀，减少聚集，并为后续功能化提供适宜的表面⁶。本研究对二氧化硅包覆过程进行了改进：与Li等人报道的三层包覆方法⁶不同，本方法中磁性纳米颗粒仅包覆两层二氧化硅（图2D），该包覆程度已足以满足后续与APTES的功能化反应步骤⁷。

去铁胺与三价铁形成配合物，因其在室温下数小时内易发生降解。获得铁配合物的最佳方法是使用乙酰丙酮铁，因其通过液-液萃取纯化过程极为简便，且可定量得到去铁胺铁。去铁胺铁性质稳定，可进一步修饰以获得 N-使用琥珀酸酐添加末端酸性基团作为连接臂，制备琥珀酰铁胺素。通过尺寸排阻色谱纯化，可去除多余的琥珀酸酐和琥珀酸 N

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-羟基苯并三唑水合物 HOBT	Acros	300561000
2,2′-联吡啶	Sigma Aldrich	D216305
3-氨基丙基三乙氧基硅烷 99%	Acros	151081000
氢氧化铵溶液 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
苯并三唑-1-氧基三（二甲氨基）磷六氟磷酸盐 BOP试剂	Acros	209800050
苯甲醇	Sigma Aldrich	822259
去铁胺甲磺酸盐 >92.5%（薄层色谱）	Sigma Aldrich	D9533
乙醇，无水，96%	Panreac	131085
乙酸乙酯，特纯，SLR，Fisher Chemical
乙酰丙酮铁(III) 97%	Sigma Aldrich	F300
LB肉汤（Lennox）	Sigma Aldrich	L3022
N,N-二异丙基乙胺，99.5+%，AcroSeal	Acros	459591000
N,N-二甲基甲酰胺，99.8%，超干燥，AcroSeal	Acros	326871000
吡啶，99.5%，超干燥，AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
琥珀酸酐 >99%	Sigma Aldrich	239690
正硅酸四乙酯 >99.0%	Sigma Aldrich	86578