功能化磁性纳米颗粒的合成、与铁载体去铁胺的偶联及其在细菌检测中的应用评价

摘要

本研究描述了磁性纳米颗粒的制备方法，其表面包覆 SiO₂，随后使用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）进行氨基功能化，并通过琥珀酰基团作为连接臂与去铁胺偶联。此外，还详细描述了对所有中间产物纳米颗粒及最终偶联物进行的深入结构表征，以及利用Y. enterocolitica进行的细菌捕获实验。

摘要

本研究描述了磁性纳米颗粒的合成，其表面包覆二氧化硅（SiO₂），随后使用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）进行氨基功能化，并通过琥珀酰基团作为连接臂与去铁胺（一种被Yersinia enterocolitica识别的铁载体）偶联的过程。

磁性纳米颗粒（MNP）中的磁铁矿（Fe₃O₄) 通过溶热法合成，并用 SiO 涂覆₂ (MNP@SiO₂) 采用Stöber法合成，随后经APTES功能化处理（MNP@SiO₂@NH₂）。随后，将去铁胺与MNP@SiO₂偶联。₂@NH₂ 通过碳二亚胺偶联反应得到 MNP@SiO₂@NH₂@Fa. 通过八种不同方法对偶联物及中间体的形貌和性质进行了表征，包括粉末X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、拉曼光谱、X射线光电子能谱（XPS）、透射电子显微镜（TEM）以及能量色散X射线（EDX）元素分布图。上述全面的表征结果证实了偶联物的成功形成。最后，为评估纳米颗粒的捕获能力与特异性，进行了细菌捕获实验检测 小肠结肠炎耶尔森菌.

引言

利用磁性纳米颗粒（MNP）进行细菌检测的方法基于抗体、适配体、生物蛋白或碳水化合物与MNP的偶联物对病原菌的分子识别作用¹。鉴于铁载体可被细菌外膜上的特异性受体识别，因此也可将其连接至MNP以提高检测特异性²。铁载体是一类参与细菌摄取Fe³⁺的小分子有机化合物^3,4。目前尚未见有关铁载体与MNP偶联物的制备及其用于细菌捕获与分离效果评价的报道。

将磁性纳米颗粒与小分子偶联的合成过程中，一个关键步骤是选择两者之间的键合类型或相互作用方式，以确保小分子能够固定在磁性纳米颗粒（MNP）表面。因此，制备磁性纳米颗粒与铁氧胺（feroxamine）——一种被Yersinia enterocolitica识别的铁载体——偶联物的过程，重点在于构建可修饰的MNP表面，从而通过碳二亚胺化学方法将铁载体共价连接至MNP表面。为了获得均一的磁铁矿纳米颗粒（MNP），并改善成核过程和粒径控制，采用苯甲醇进行溶剂分解反应，并在无振荡的加热模块中完成⁵。随后，通过Stöber法形成二氧化硅包覆层，以提供保护作用，并提高纳米颗粒在水相介质中悬浮液的稳定性⁶。考....

方案

注意：对于在惰性气氛条件下进行的反应，所有玻璃器皿均预先在65 °C的烘箱中干燥，用橡胶隔垫密封，并用氩气吹扫三次。

1. 铁氧化胺偶联磁性纳米颗粒的合成

1. Fe₃O₄ 磁性纳米颗粒（MNPs）的合成
   1. 将 0.5 g Fe(acac)₃ 加入一个 20 mL 玻璃小瓶中，然后加入 10 mL 苯甲醇混合。
   2. 将该混合物超声处理 2 分钟，随后转移至加热块中，在 180 °C 下加热 72 小时。
   3. 反应完成后，让小瓶自然冷却，用 96% 乙醇冲洗纳米颗粒，并在 4000 x g 条件下离心 30 分钟。至少重复离心两次。
   4. 使用钕铁硼（NdFeB）磁铁通过磁力吸引将纳米颗粒与上清液分离，并弃去残余溶剂。
   5. 用 96% 乙醇重复步骤 1.1.4，并交替进行 40 kHz 超声处理 1 分钟，弃去上清液，直至溶剂变得澄清。
2. 磁性纳米颗粒的 SiO₂ 包覆（MNP@SiO₂）
   1. 在圆底烧瓶中加入磁力搅拌子，制备 2 g MNP 在 80 mL 异丙醇中的悬浮液，然后依次加入 4 mL 21% 氨水、7.5 mL 蒸馏水和 0.56 mL 正硅酸四乙酯（TEOS）。....

结果

为了确定每种中间体及最终偶联物的形貌和性质，需进行全面的结构表征。为此，采用XRD、FT-IR、拉曼光谱、TGA、TEM、EDX元素分布图以及XPS等技术，以证明偶联物的形成。通过X射线光电子能谱（XPS）获得的纳米颗粒表面原子的氧化态数据，是确认纳米颗粒与铁载体之间形成共价键的最关键证据。与这些结果一致，本实验方案具有可重复性。

将裸露的磁性纳米颗粒（MNP）、功能化的磁性纳米颗粒（MNPs）以及偶联物分别与每种Y. enterocolitica菌株在磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中混合。利用磁铁将细菌-磁性纳米颗粒聚集体从悬浮液中分离出来。用PBS洗涤聚集体两次后，将其重新悬浮于PBS中，制备系列稀释液，并接种培养以进行菌落计数。

采用本方案制备的中间产物及最终偶联物通过多种技术进行表征，以展示合成过程中每一步所发生的变化。红外光谱和拉曼光谱是监测合成各步骤的简便快速方法。在傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和拉曼光谱（见下文）中，出现对应于Si-O、C-Si-C、Fe-O、酰胺键O=C伸缩振动以及羟肟酸O=C.......

讨论

本方案描述了通过共价键将磁性纳米颗粒与铁载体去铁胺形成偶联物的合成方法。四氧化三铁的合成采用Pinna等人报道的方案⁵，随后进行二氧化硅包覆，以保护磁性核心在水相体系中免受腐蚀，减少聚集，并为后续功能化提供适宜的表面⁶。本研究对二氧化硅包覆过程进行了改进：与Li等人报道的三层包覆方法⁶不同，本方法中磁性纳米颗粒仅包覆两层二氧化硅（图2D），该包覆程度已足以满足后续与APTES的功能化反应步骤⁷。

去铁胺与三价铁形成配合物，因其在室温下数小时内易发生降解。获得铁配合物的最佳方法是使用乙酰丙酮铁，因其通过液-液萃取纯化过程极为简便，且可定量得到去铁胺铁。去铁胺铁性质稳定，可进一步修饰以获得 N-使用琥珀酸酐添加末端酸性基团作为连接臂，制备琥珀酰铁胺素。通过尺寸排阻色谱纯化，可去除多余的琥珀酸酐和琥珀酸 N

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-羟基苯并三唑水合物 HOBT	Acros	300561000
2,2′-联吡啶	Sigma Aldrich	D216305
3-氨基丙基三乙氧基硅烷 99%	Acros	151081000
氢氧化铵溶液 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
苯并三唑-1-氧基三（二甲氨基）磷六氟磷酸盐 BOP试剂	Acros	209800050
苯甲醇	Sigma Aldrich	822259
去铁胺甲磺酸盐 >92.5%（薄层色谱）	Sigma Aldrich	D9533
乙醇，无水，96%	Panreac	131085
乙酸乙酯，特纯，SLR，Fisher Chemical
乙酰丙酮铁(III) 97%	Sigma Aldrich	F300
LB肉汤（Lennox）	Sigma Aldrich	L3022
N,N-二异丙基乙胺，99.5+%，AcroSeal	Acros	459591000
N,N-二甲基甲酰胺，99.8%，超干燥，AcroSeal	Acros	326871000
吡啶，99.5%，超干燥，AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
琥珀酸酐 >99%	Sigma Aldrich	239690
正硅酸四乙酯 >99.0%	Sigma Aldrich	86578