在无馈体和化学定义的培养条件下，使用人类多能干细胞的后多能感感神经元的有效分化

Summary

在此协议中，我们描述了一种稳定、高效的分化策略，用于从人类多能干细胞生成后强感致感神经元。此模型将使神经元可用于多个自主障碍的研究。

Abstract

人类多能干细胞（hPSCs）已成为疾病建模和体外人类胚胎发育研究的有力工具。我们之前提出了一种分化协议，用于具有交感特性的自主神经元的衍生，该特性已应用于自主神经病变患者。然而，该协议建立在敲出血清替代（KSR）和基于饲料的培养条件之上，为了确保高分化效率，细胞分拣是必要的。这些因素导致高可变性、高成本和低可重复性。此外，成熟的寄感特性，包括电活动，尚未得到证实。在这里，我们提出了一个优化的协议，其中PSC培养和分化是在无馈料和化学定义的培养条件下进行的。识别躯干神经峰的基因标记被识别。在20天后实现进一步分化成后刚体交感神经元，无需细胞分拣。电生理记录进一步显示功能神经元身份。从我们分化的神经元检测到的激发可以通过尼古丁增强，并抑制由肾上腺素受体拮抗剂蛋白醇。该协议中的中间交感神经祖生可以作为神经球体维持长达2周，这允许培养物的扩展。总之，与以前的版本相比，我们更新的交感神经元分化协议表现出高分化效率、更好的可重复性、更大的灵活性和更好的神经成熟度。该协议将为研究人员提供研究影响自主神经系统的人类疾病所需的细胞。

Introduction

后刚体交感神经元（symNs）属于自主神经系统（ANS），在独立于意识的个体的反应和调节平衡方面具有多重重要作用。例如，压力刺激symN，并唤起战斗或逃跑的反应，导致心率，血压和出汗的增加。SymNs 因遗传、毒性/伤害或其他疾病的同伴而在多种人类疾病中受到影响。遗传神经病变的一个例子是儿童疾病家庭性肌瘤（FD），其中，严重的调节调节的共生导致反乌托邦危机，明显的出汗，皮肤斑点，呕吐发作，高血压和焦虑^1。毒性的一个例子是化疗治疗，据报道，它对自主神经元有毒副作用^2。众所周知，自主变性和超内侧病既可导致或伴随，如帕金森病或高血压肾病^33，4。4因此，能够进行研究，了解symN生物学的机制和疾病背景下的缺陷，有利于寻找新颖有效的治疗方法。

解剖
外围神经系统分支成感官和自主的分裂。感觉神经系统的发泡神经负责疼痛和触觉的感觉，而ANS负责将信息从所有器官中继到大脑。ANS分为肠神经系统，内化胃肠道，寄生神经系统，这是放松的重要，和寄分神经系统（SNS），这是重要的激活/调节器官。SNS 调整双神经元系统⁵。前刚利感神经斧头在脊髓第一个项目到交感性神经神经神经斧子，其中后刚体symN细胞....

Protocol

注:H9 PHOX2B:GFP记者专线由Oh等人^提供。本文中使用的一些qPCR引物来自OriGene技术公司，而一些序列则从Frith等人^20、30.,30

1. 设置用于盘涂、介质制备和 hPSC 维护

1. 碟涂层
   1. 体外内他 （VTN） 涂层
      1. 将 VTN 小瓶放入 37 °C 水浴中，直到完全解冻，然后彻底混合。
      2. 对于 100 mm 的 Petri 盘，将 7 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 与 0.5 mg/mL VTN 混合，在盘中加入 VTN 溶液，并在室温 （RT） 下孵育 1 小时。
   2. 地下室膜基质涂层
      1. 在4°C的冰上解冻基底膜基质的瓶（见材料表）。
      2. 对于 6 口板的一口井，将 2 mL 的 DMEM/F12 与 20 μL 的 100x 基底膜基质混合，在盘中加入基底膜基质溶液，用石蜡薄膜包裹盘子，并在 4°C 过夜时存放在干净的容器中。尽快工作。涂层菜肴可在4°C下储存长达2周。

Results

在此协议中，我们将给出有关如何从 hPSC 生成符号的说明。这里演示的培养条件从先前公布的协议^23、24（图1A）到无馈送和化学定义的条件（图1B）都得到了改善。^23,提供了两个选项，一个在 20 天内生成符号，另一个选项可以扩展 NcC 2 周以生成更多的单元格，然后可以分化为符号（图 1B、选项 1 和 2）。

为了正确监测分化细胞的symN特性，PHOX2B-eGFP WA09报告器行和父WA09 PSCs线路^19。所有分化都至少进行三次生物重复，定义为在至少一次通过和/或从新解冻的细胞小瓶中提取的独立分化实验。当无分化hPSCs的共性达到80%-90%时，诱导分化。hPSC 菌落是圆形的，有光泽、光滑的边缘，几乎没有差别。殖民地不应相.......

Discussion

我们最近发表了两篇评论，一篇讨论使用hPSC衍生的symN进行疾病建模^31，以及深入比较现有的分化协议^22。因此，在这里，我们重点对当前协议进行故障排除，以帮助感兴趣的研究人员成功创建 symN。在整个分化过程中，为了获得一致的数据以及健康的分化细胞，应仔细控制各个阶段的污染。在常规 hPSC 维护中，支原体测试应每两周或每月执行一次。如果在第10天进行细胞分拣，强烈建议向任何介质添加抗生素。在开始分化之前和之后检查细胞形态也很重要。在这里，我们建议几个关键检查点（图6A）。首先，理想的hPSC菌落准备分化应该有明亮和光滑的边缘与微小的尖峰。具有齿轮状尖峰的殖民地已开始分化，不应使用。强烈建议在最佳时间点使用细胞，因为形态可以在几小时内改变。仅仅推迟一天可能会崩溃细胞（图6B，a），或导致菌落之间的接触（图6B，b），这刺激

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm 细胞培养皿	Falcon	353003
15 mL 锥形组织培养管	VWR/Corning	89039-664
24 孔组织培养板	Falcon	353047
24 孔超低吸附板	康宁	07 200 601 和 07 200 602
5% CO2/20% O2 组织培养箱	Thermo Fisher/Life技术	Heracell VIOS 160i
50 ml 锥形组织培养管	VWR/Corning	89039-656
6 孔组织培养板	Costar	3516
Accutase	Innovation Cell Technologies	AT104500	细胞解离溶液
抗 AP2a 抗体	Abcam	ab108311	宿主：兔;1：400 稀释
抗 Ascl1 抗体	BD Pharmingen	556604	宿主：小鼠 IgG1;1：200 稀释
抗 CD49D 抗体	BioLegend	304313	宿主：小鼠 IgG1;5 μ100 &mu 中 l/百万个细胞;l 体积
抗 CD49D 抗体（同种型）	BioLegend	400125	宿主：小鼠 IgG1;5 μ100 &mu 中 l/百万个细胞;l 体积
DAPI 染料	Sigma	D9542	1：1000 稀释
抗 DBH 抗体	Immunostar	22806	宿主：兔;1：500 稀释
抗 GFP 抗体	Abcam	ab13970	宿主：鸡;1：100 稀释
抗 HOXC9 抗体	Abcam	ab50839	宿主：小鼠;1：100 稀释
抗 NET1 抗体	Mab	NET17-1	宿主：小鼠;1：1000
抗PRPH抗体	Santa Cruz Biotechnology	SC-377093/H0112	：小鼠IgG2a;1：200
抗SOX10抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-365692	：小鼠IgG1;1：100
抗TH抗体	Pel-Freez	P40101- 150	：兔;1：500
抗坏血酸	Sigma	A8960-5G	储备液浓度：100 mM
B27 补充剂	Thermo Fisher/Life Technologies	12587-010	储备液浓度：50x
BDNF	R&D Systems	248-BD	原液浓度：10 &μ;g/mL
BMP4	R&D Systems	314-BP	原液浓度：6 mM
细胞计数器	Thermo Fisher/Life Technologies	Countess II
细胞计数室载玻片	Invitrogen	C10312
离心机	Eppendorf	57021&5424R
CHIR99021	研发D Systems	4423	储备液浓度：6 mM
冷冻瓶	Thermo Fisher/Life Technologies	375353
dbcAMP	Sigma	D0627	储备液浓度：100 mM
DMEM	Thermo Fisher/Life Technologies	10829-018	储备液浓度：1x
DMEM/F12	Thermo Fisher/Life Technologies	11330-057	储备液浓度：1x
DMSO	Thermo Fisher/Life Technologies	BP231-100
E6 培养基	gibco	A15165-01
E8 培养基	gibco	A15169-01	储备液浓度：1x
E8 补充剂	gibco	A15171-01	储备液浓度：50x
EDTA	Sigma	ED2SS	储备液浓度：0.5 M
电生理学板（AXION cytoview MEA96）	Axion BioSystems	M768-tMEA-96W
FACS 机器	贝克曼库尔特	CytoFLEX（用于 FACS）
FACS 机器	贝克曼库尔特	MoFlo Astrios EQ（用于分选）
FACS 管（蓝色过滤器盖）	Falcon	352235
FACS 管（白色盖）	Falcon	352063
胎牛血清 （FBS）	Atlanta Biologicals	S11150
GDNF	PeproTech	450	原液浓度：10 μg/mL
Geltrex	Invitrogen	A1413202	基底膜基质;原液浓度：100x
hPSCs	Thomson et al.， （1998）	WA09
hPSCs	Oh et al. （2016）	H9-PHOX2B：：eGFP
人纤连蛋白 （FN）	VWR/Corning	47743-654	原液浓度：1 mg/mL
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher/Gibco	25030-081	原液浓度：200 mM
LN 电泳槽	定制生物系统定制生物系统	V-1500AB
MEA 微孔板检测仪	Axion BioSystems	Maestro Pro
小鼠层粘连蛋白 I （LM）	R&D 系统	3400-010-01	储备液浓度：1 mg/mL
N2 补充剂	Thermo Fisher/Life Technologies	17502-048	储备液浓度：100x
Neurobasal 培养基	gibco	21103-049	储备液浓度：1x
NGF	PeproTech	450-01	储备液浓度：25 &μ;g/mL
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Gibco	14190-136	储备液浓度：1x
聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐 （PO）	Sigma	P3655	储备液浓度：15 mg/mL
初氨星（抗生素）	InvivoGen	ANTPM1	储备液浓度：50 mg/mL
qPCR 机	Bio-Rad Laboratories	C1000 Touch
qPCR 板	Bio-Rad Laboratories	HSP9601
重组 FGF2	R&D Systems	233-FB/CF	原液浓度：10 &μ;g/mL
视黄酸	Sigma	R2625	储备液浓度：1 mM
SB431542	Tocris/R&D Systems	1614	储备液浓度：10 mM
台盼蓝	康宁	MT-25-900-CI
玻连蛋白 （VTN）	Thermo Fisher/Life Technologies	A14700	储备液浓度：0.5 mg/mL
水浴	VWR/康宁	706308
Y27632	R&D Systems	1254	储备液浓度：10 mM