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在无饲养层且化学成分明确的培养条件下利用人多能干细胞高效分化出节后交感神经元

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DOI：

10.3791/60843

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2020年5月24日

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

本文内容

摘要

在本实验方案中，我们描述了一种稳定且高效的分化策略，可用于由人类多能干细胞生成节后交感神经元。该模型将为多种自主神经系统疾病的研究所需的神经元提供来源。

摘要

人类多能干细胞（hPSCs）已成为体外研究疾病建模和人类胚胎发育的有力工具。我们此前报道了一种可诱导生成具有交感神经特性的自主神经元的分化方案，并已将其应用于自主神经病变患者的研究所。然而，该方案依赖于 Knock Out 血清替代物（KSR）和饲养层细胞支持的培养体系，且为确保较高的分化效率，必须进行细胞分选。这些因素导致实验变异性高、成本高且可重复性低。此外，尚未验证所获得细胞是否具备成熟的交感神经特性，包括电生理活性。本文中，我们提出了一种优化后的方案，该方案在无饲养层且化学成分明确的培养条件下完成 PSC 的培养与分化。我们鉴定了可识别躯干神经嵴的遗传标记物。在无需细胞分选的情况下，经过 20 天的进一步分化即可获得节后交感神经元。电生理记录结果进一步证实了这些细胞具备功能性神经元特征。我们所分化的神经元可记录到放电活动，该活动可被尼古丁增强，并被肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔抑制。本方案中的中间态交感神经前体细胞可作为神经球样结构维持培养长达 2 周，从而实现细胞的大规模扩增。综上所述，与先前版本相比，更新后的交感神经元分化方案具有更高的分化效率、更好的可重复性、更强的灵活性以及更优的神经元成熟度。该方案将为研究人员提供研究影响自主神经系统的各类人类疾病的必要细胞资源。

引言

节后交感神经元（symNs）属于自主神经系统（ANS），在无意识状态下参与机体稳态的响应与调节，具有多种重要功能。例如，应激可激活symNs，引发“战斗或逃跑”反应，导致心率加快、血压升高和出汗增多。由于遗传因素、毒性/损伤或其他疾病伴随影响，symNs在多种人类疾病中受到累及。遗传性神经病变的一个例子是家族性自主神经功能障碍（FD）这一儿童期疾病，其中symNs的严重失调可导致自主神经危象，表现为出汗、皮肤斑驳、呕吐发作、高血压和焦虑1。毒性损伤的一个例子是化疗，已有报道指出化疗对自主神经元具有毒性副作用2。已知自主神经去神经支配和过度神经支配均可导致或伴随某些疾病的发生，如帕金森病或高血压性肾病3,4。因此，能够在疾病背景下开展研究并深入理解symN生物学机制及其缺陷，对于发现新型且有效的治疗方法具有重要意义。

解剖学
周围神经系统分为感觉神经系统和自主神经系统。感觉神经系统的传入神经负责感知疼痛和触觉，而自主神经系统（ANS）则负责将来自各器官的信息传递至大脑。自主神经系统进一步分为支配胃肠道的肠神经系统、在机体放松过程中起重要作用的副交感神经系统，以及在器官激活与调节中发挥关键作用的交感神经系统（SNS）。交感神经系统采用双神经元结构5。脊髓中的交感前节神经元轴突首先投射至交感神经节，此处为交感后节神经元（symN）胞体所在位置。这些神经元随后发出长轴突支配全身各个器官的靶组织。前节神经元传递的信号为胆碱能性，而后节交感神经元为肾上腺素能性，因此以去甲肾上腺素（NE）为主要神经递质。少数交感后节神经元例外地表现为胆碱能性，例如支配血管的神经元。肾上腺素能性后节神经元表达多种酶，包括酪氨酸羟化酶（TH）、芳香族L-氨基酸脱羧酶（AAAD）、多巴胺β-羟化酶（DBH）和单胺氧化酶（MAO-A），这些酶均参与NE的合成与代谢。此外，它们还表达NE再摄取转运蛋白和/或受体，包括α-肾上腺素能受体（ADRA2）、β-肾上腺素能受体（ADR2B）、去甲肾上腺素转运体（NET1）以及囊泡单胺转运体（VMAT1/2）。

发育过程
在胚胎发育过程中，交感神经元（symNs）起源于神经嵴（NC），神经嵴出现在神经管与表层外胚层之间6，并可分化为多种细胞谱系，包括黑色素细胞、成骨细胞、脂肪细胞、胶质细胞、肠神经元、感觉神经元以及自主神经元7。神经嵴细胞（NCCs）具有高度迁移能力，在胚胎内沿多条路径迁移。在神经嵴发育的早期阶段，这些细胞表达 SNAIL1/2、FOXD3 和 SOX10 等标志物8,9,10,11。迁移路径及其所处的轴向位置决定了它们将发育为哪一类神经嵴亚型。这些神经嵴亚型可通过其特异的 HOX 基因表达加以区分：头区 NCCs 不表达 HOX 基因，迷走神经区 NCCs 表达 HOX 1–5，躯干区 NCCs 表达 HOX 6–9，而骶区 NCCs 表达 HOX 10–1112。其中，躯干区 NCCs 被认为是交感神经元的主要来源。交感神经元前体表达转录因子 MASH1/ASCL113，该因子促进 PHOX2B14 和 INSM115 的表达。GATA 转录因子家族在交感神经系统晚期发育过程中表达。GATA2 和 GATA3 在交感神经元中表达，并进一步激活 DBH16。转录因子 HAND2 对于 DBH 和 TH 的表达与维持也具有重要作用17。

人多能干细胞（如胚胎干细胞和诱导性多能干细胞）是一种强大的工具18，可用于重现发育过程，并生成对称神经元（symNs），进而用于多种人类疾病的建模研究。因此，在由人多能干细胞（hPSCs）生成对称神经元的过程中，遵循发育规律并在分化过程中评估相应标志物的表达至关重要。

先前的交感神经元（symN）培养方案
此前，仅有少数研究团队报道过从人多能干细胞（hPSCs）生成交感神经元（symNs）的方法19,20,21。这些方案与我们当前方案之间的直接比较已在近期综述中有所阐述22。2016年23，我们发表了一种用于生成具有交感神经元特征的自主神经元的分化方案（图1A）。该方案采用基于KSR的培养基，该培养基既用于未分化hPSCs的维持，也用于细胞分化过程。此外，hPSCs被维持在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF饲养层细胞）上。我们曾利用该方案及家族性自主神经功能障碍（FD）患者的PSCs对该疾病进行建模23。2019年，我们进一步描述了这一早期方案的更详细版本24。简而言之，在前两天通过双抑制SMAD通路25以阻断TGF-β和BMP信号，从而诱导神经命运；随后使用CHIR99021激活WNT信号，促进神经前体细胞转化为神经嵴细胞（NC细胞）。在第11天，通过流式细胞分选术（FACS）对CD49D+或SOX10+细胞群体进行分选26,23，获得约40%的神经嵴细胞生成效率。因此，分选步骤对于确保后续分化步骤的效率与纯度至关重要。神经嵴细胞（NCCs）在FGF2与CHIR联合处理下以球状体形式进行维持与扩增。4天后，将维持状态的神经嵴球状体接种，并添加BDNF、GDNF和NGF以完成交感神经元的成熟过程。尽管这些交感神经元表达了较强的交感神经元标志物，如ASCL1、TH、DBH和PHOX2A，但即使在分化70天后，成熟交感神经元相关标志物（如烟碱型乙酰胆碱受体CHRNA3/CHRNB4以及囊泡转运蛋白VMAT1/2）的表达水平仍然较低。在该方案中，HOX基因未被系统检测，且细胞的成熟神经特性（包括电生理活性）也未得到验证。

本文介绍了一种优化的方案，用于生成交感神经元（symNs）（图1B）。人多能干细胞（HPSCs）在无饲养层条件下培养，接种于包被了玻连蛋白（VTN）的培养皿中，并使用Essential 8（E8）培养基进行维持27。在分化过程的每个阶段均对分化培养基的配方进行了优化，从而提高了神经嵴细胞（NC）群体的比例28。交感神经元的成熟可使用经CD49D+/SOX10+分选或未分选的大量神经嵴前体细胞（NCC）群体进行。两种条件下，到第30天均可观察到高水平的交感神经元标志物表达。此外，采用本方案生成的交感神经元对电生理记录以及交感神经元激活剂和抑制剂处理均具有响应性。

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方案

注意：H9 PHOX2B:GFP 报告基因细胞系由 Oh 等人提供19。本文使用的部分 qPCR 引物购自 OriGene Technologies，少数序列来自 Frith 等人20,30。

1. 培养皿包被、培养基制备和hPSC维持的准备工作

  1. 培养皿包被
    1. 玻璃粘连蛋白（VTN）包被
      1. 将VTN小瓶置于37 °C水浴中直至完全解冻，然后充分混匀。
      2. 对于一个100 mm的培养皿，将7 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）与0.5 mg/mL VTN混合，加入VTN溶液至培养皿中，在室温（RT）下孵育1小时。
    2. 基底膜基质包被
      1. 将基底膜基质（见材料表）小瓶在4 °C冰上过夜解冻。
      2. 对于6孔板中的一个孔，将2 mL DMEM/F12与20 µL 100×基底膜基质混合，加入基底膜基质溶液至培养皿中，用封口膜包裹培养皿，并在4 °C洁净容器中过夜保存。操作应尽可能迅速。包被后的培养皿可在4 °C保存最多2周。
    3. 多聚鸟氨酸（PO）/层粘连蛋白（LM）/纤连蛋白（FN）包被
      1. 第一天，对于24孔板中的一个孔，将15 µg/mL的PO与1 mL的1×PBS混合，在37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。将LM和FN在-20 °C过夜解冻，完全解冻后转移至4 °C保存。
      2. 第二天，吸除PO溶液，用1×PBS洗涤孔2次，加入含2 µg/mL LM和2 µg/mL FN的1 mL 1×PBS，并在37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。此时，含LM/FN溶液的培养皿只要不干燥，可在培养箱中保存数月。为防止干燥，可补充更多1×PBS。
  2. 培养基制备
    1. 制备Essential 8培养基（E8）：将一瓶E8添加剂在4 °C过夜解冻，将添加剂与500 mL E8基础培养基混合，根据需要加入抗生素。
      注：工作浓度的E8溶液应在2周内用完。
    2. 制备hPSC冻存培养基：将90 mL完全E8培养基与10 mL DMSO混合，总体积为100 mL。过滤除菌。
    3. 制备第0天至第1天分化培养基：将100 mL Essential 6（E6）培养基与10 µM SB431542、1 ng/mL BMP4、300 nM CHIR99021和10 µM Y27632混合，总体积为100 mL。
    4. 制备第2天至第10天分化培养基：将100 mL E6培养基与10 µM SB和0.75 µM CHIR99021混合，总体积为100 mL。
    5. 制备第10天至第14天类球体培养基：将神经基础培养基与2 mL B27（50×）、1 mL N2（100×）、2 mM L-谷氨酸、3 µM CHIR99021和10 ng/mL FGF2混合，总体积为100 mL。
    6. 制备第14天至第28天类球体长期维持培养基：每次换液时，在第10天至第14天类球体培养基中添加0.5 µM新鲜RA。
      注：RA应始终保存在-80 °C。
    7. 制备SymN成熟培养基：将神经基础培养基与2 mL B27（50×）、1 mL N2（100×）、2 mM L-谷氨酸、25 ng/mL GDNF、25 ng/mL BDNF、25 ng/mL NGF、200 µM抗坏血酸和0.2 mM dbcAMP混合，总体积为100 mL。该溶液应在2周内使用完毕。每次换液前添加0.125 µM新鲜RA。该溶液从第14天（方案1）或第28天（方案2）开始使用。
    8. 制备FACS缓冲液：将DMEM与2% FBS、2 mM L-谷氨酸及根据需要添加的抗生素混合，总体积为100 mL。
  3. hPSC的维持
    1. hPSC的解冻与培养
      1. 准备一个VTN包被的100 mm培养皿。
      2. 将一管直接从液氮中取出的hPSC放入37 °C水浴中，小心地在水中轻轻晃动试管直至完全解冻。将解冻后的hPSC转移至含有10 mL 1×PBS的15 mL离心管中，在200 × g条件下离心4分钟。
      3. 弃去上清液，向管中加入1 mL E8培养基，吹打数次以充分重悬细胞沉淀，再加入9 mL E8培养基，使总体积达到10 mL。
      4. 吸除100 mm培养皿中的VTN溶液。
      5. 将hPSC转移至100 mm培养皿中，轻轻摇晃（上下左右，非环形）以确保细胞在培养皿中均匀分布。
      6. 在37 °C、5% CO2条件下孵育。
      7. 次日，吸除全部培养基，加入10 mL E8培养基进行换液。
      8. 此后每天换液一次，持续3–4天，然后准备传代。
    2. hPSC传代
      注：传代时hPSC应达到80%–90%汇合度。应观察到大而完整、边缘光滑明亮的克隆。但应避免克隆之间相互接触（图2B，第0天和图6B）。
      1. 根据需要准备VTN包被的100 mm培养皿。
      2. 吸除E8培养基，用1×PBS洗涤待传代的培养皿1次。
      3. 吸除1×PBS，加入4 mL 0.25 M EDTA，在37 °C、5% CO2条件下孵育2分钟。
        注：hPSC应以小克隆形式进行传代/重铺。EDTA处理时间不应超过2分钟，以防止细胞解离为单细胞。2分钟处理后，细胞仍应附着于培养皿表面。
      4. 吸除EDTA，用10 mL E8培养基强力吹打培养皿表面以脱离克隆，并将全部培养基和细胞收集至15 mL离心管中。
      5. 对于汇合度为80%–90%的hPSC，按1:15–1:20比例传代。例如，若以1:20比例将hPSC传代至一个100 mm培养皿，取500 µL E8/hPSC混合液与9.5 mL新鲜E8培养基混合。
      6. 将hPSC接种至VTN包被的100 mm培养皿中。
        注：建议每位研究人员根据自身实验条件和细胞系独立确定最佳传代比例。
    3. hPSC冻存
      1. 对于一皿准备传代的100 mm培养皿中的hPSC，准备三个冻存管和3.5 mL冻存培养基。
        注：培养基和冻存管应在使用前保持在4 °C或冰上。
      2. 吸除E8培养基，用1×PBS洗涤培养皿2次。
      3. 吸除1×PBS，加入4 mL 0.25 M EDTA，在37 °C、5% CO2条件下孵育2分钟。
        注：hPSC应在准备传代时以小克隆形式冻存。EDTA处理时间不应超过2分钟，以防止细胞解离为单细胞。2分钟处理后，细胞仍应附着于培养皿表面。
      4. 吸除EDTA，用10 mL 1×PBS强力吹打培养皿表面以脱离克隆，并将全部培养基和细胞收集至50 mL离心管中。
      5. 加入20 mL 1×PBS，在200 × g条件下离心4分钟，以洗去残留EDTA。
      6. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于3 mL冻存培养基中。
      7. 将hPSC均匀分装至三个冻存管中，每管1 mL。
      8. 在-80 °C过夜保存于程序降温盒或泡沫盒中，以确保缓慢降温，随后转移至液氮罐中长期保存。

2. 接种hPSCs以启动分化（第0天）

注意：人多能干细胞（hPSCs）在复苏后经过稳定培养（即复苏后传代2–3次）应已准备好进行分化。确保细胞集落状态良好，边缘光滑发亮，且分化程度极低（图2B）。

  1. 根据需要，在第0天前一天准备包被基底膜基质的培养皿（24孔或6孔板）。在开始分化前将培养皿移至室温。
  2. 根据需要配制第0–1天分化培养基。
  3. 吸除汇合且准备传代的hPSCs中的E8培养基，用1×PBS洗涤培养皿2次。
  4. 每100 mm培养皿加入7 mL 0.25 M EDTA，于37 °C、5% CO2条件下孵育15分钟。
    注意：此时延长EDTA处理时间以使细胞分散为单细胞。
  5. 用移液器将所有hPSCs（应呈悬浮状态）转移至50 mL离心管中。加入与EDTA溶液体积相等或更多的1×PBS以稀释EDTA。
  6. 以200 × g离心4分钟。
  7. 弃去上清液，加入1 mL第0–1天分化培养基，吹打混匀细胞。随后加入更多培养基并混匀，将细胞悬液稀释至适合细胞计数的浓度。
    注意：不要过度稀释细胞悬液。一个完整100 mm培养皿的细胞起始稀释体积应为5 mL培养基。
  8. 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。
  9. 根据需要将细胞悬液稀释至终浓度为125,000个细胞/cm2，并保持较低的终体积（例如，6孔板每孔2 mL，24孔板每孔500 µL）。
    注意：较低体积有助于细胞更快贴壁。
  10. 吸除包被培养皿中的所有基底膜基质溶液，将细胞悬液接种至各孔中。
  11. 于37 °C、5% CO2条件下孵育。

3. 神经嵴细胞诱导（第1天至第10天，图2A）

  1. 第1天，使用第0–1天分化培养基对细胞进行换液（6孔板每孔3 mL，24孔板每孔1 mL）。
  2. 第2天，使用第2–10天分化培养基对细胞进行换液（6孔板每孔3 mL，24孔板每孔1 mL）。
  3. 此后，应每隔一天换液一次，直至第10天（即下一次换液时间为第4天）。
    注意：从第6天开始，应可观察到神经嵴样结构（图2B）。为确认分化是否正常进行，建议同时在较小孔板（如24孔板）中进行平行分化培养，以便在分化过程中不同时间点对SOX10/AP2a进行染色，并检测标志基因的表达情况（图2B、C）。
  4. 若需进行细胞分选，请进入第4节；否则，请进入第5节。

4. 采用荧光激活细胞分选（FACS）检测神经嵴标志物CD49D及在类球体中聚集的神经嵴细胞

注意：进行 FACS 分选时，样品染色后应置于冰上，并避免光照，直至完成分选。

  1. 若需分选细胞，请预先配制FACS缓冲液。
  2. 配制第10–14天类球体培养基。
  3. 第10天，吸除培养基，并用1× PBS洗涤一次。
  4. 按每孔2 mL（6孔板）或每孔1 mL（24孔板）加入解离溶液（见材料表），于37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟。
  5. 用移液器吸出所有hPSCs，转移至50 mL离心管中。
  6. 用FACS缓冲液补足体积，于200 × g离心4分钟。
    注意：每个50 mL离心管最多可容纳20 mL或更少的细胞悬液。FACS缓冲液的体积应足够中和解离溶液。
  7. 弃去上清液，用适量FACS缓冲液重悬细胞（约每6孔板孔加2 mL），计数以确定细胞数量。
  8. 准备以下样品：
    1. 样品1（未染色对照）：将1 × 106个细胞重悬于400 µL FACS缓冲液中。通过带滤网帽的FACS管过滤细胞，将离心管置于冰上保存。
    2. 样品2（仅DAPI对照）：将1 × 106个细胞重悬于含0.5 µg/mL DAPI的400 µL FACS缓冲液中。通过带滤网帽的FACS管过滤细胞，将离心管置于冰上保存。
    3. 样品3（CD49d标记）：将剩余细胞用含PE/Cy7标记的CD49D抗体的FACS缓冲液重悬（每1 × 106个细胞在100 µL FACS缓冲液中加入5 µL抗体），置于15 mL离心管中，冰上孵育20分钟。
  9. 用FACS缓冲液补满离心管，于200 × g离心4分钟。
  10. 弃去上清液，根据制造商说明书，将每5–10 × 106个细胞重悬于含0.5 µg/mL DAPI的1 mL FACS缓冲液中。
  11. 通过带滤网帽的FACS管过滤细胞，将离心管置于冰上保存。
  12. 准备收集用FACS管，每管预先加入2 mL FACS缓冲液。
  13. 使用可检测DAPI和PE-Cy7荧光信号的流式分选仪进行分选，以分离CD49D+细胞群体。
  14. 分选完成后，对分选后的细胞进行计数。
  15. 将所有分选后的细胞离心，重悬于第10–14天类球体培养基中，终浓度为每500 µL培养基含0.5 × 106个细胞。
  16. 将0.5 × 106个细胞每孔接种至超低吸附24孔板中。
  17. 将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。

5. 将神经嵴细胞在球状体中聚集成团

  1. 若不使用流式细胞术分离神经嵴细胞，而是直接将其聚集成球状体，则首先按照步骤 4.2–4.5 所述方法制备细胞。
  2. 用 1× PBS 补充至管中其余体积，并在 200 × g 条件下离心 4 分钟。
  3. 弃去上清液，用适量的第 10–14 天球状体培养基重悬细胞（例如，每孔约 2 mL 培养基用于 6 孔板），并进行细胞计数以确定细胞数量。
  4. 用第 10–14 天球状体培养基将细胞稀释至每 500 µL 培养基中含有 0.5 × 106 个细胞。
  5. 在超低吸附 24 孔板中，每孔接种 500 µL 细胞悬液。
  6. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。

6. 神经嵴类球体的维持与交感神经前体诱导（第10天至第14天，图4A）

  1. 方案1：最小化类球体培养
    1. 第11天，在未吸除第10天培养基的情况下，向NC类球体中加入500 µL第10–14天类球体培养基。于37 °C、5% CO2条件下孵育。
    2. 第12天，倾斜培养板使NC类球体聚集于孔的一侧。小心吸除并弃去尽可能多的培养基，然后加入1 mL第10–14天类球体培养基进行换液。
    3. 持续每天换液，直至第14天。
    4. 可选步骤：若类球体发生聚集形成大团块，可用移液器将类球体团块吹散。此操作也有助于防止单个类球体过大。
      注意：理想的类球体大小范围约为100–500 μm。在此范围内，单个类球体的具体尺寸并不关键。然而，形态特征（如边缘光滑清晰）对于后续实验的成功至关重要（图3和图6）。至第14天，每个24孔板理想情况下应含有约50–60个处于上述尺寸范围内的不同大小的类球体。
  2. 方案2：扩增类球体培养
    1. 第15天，为维持NC类球体生长，加入含0.5 µM RA的1.5 mL第10–14天类球体培养基。于37 °C、5% CO2条件下孵育。
      注意：RA需每次换液时新鲜添加，并始终保存于-80 °C。
    2. 此后每隔一天换液一次，持续至第28天，然后继续进行类球体接种（第7.1节）。
      注意：生长中的类球体大约每周通过1 mL移液器吹打分散一次，分裂比例约为1:2–1:4。在为期两周的扩增期间，细胞数量应大致扩增至原来的四倍。

7. SymN 的分化与成熟（选项 1：第 14 天后；选项 2：第 28 天后）

  1. 在普通培养皿中接种类球体
    1. 准备经PO/LM/FM包被的24孔板。
    2. 配制含有0.125 µM RA（每次换液时新鲜添加）和10 µM Y27632（仅第14天使用）的symN培养基。
    3. 在第14天，倾斜培养板使神经嵴类球体（NC spheroids）聚集于孔的一侧，小心吸除并弃去尽可能多的培养基，然后加入1 mL symN培养基。
    4. 从包被的培养板中去除LM/FN。
    5. 将原24孔板中每孔的类球体分种至新的包被24孔板中的4个独立孔中。每个原始孔含有约50–60个类球体，总体积为1 mL。分种后，新板中每孔体积为250 µL，含有约10–15个类球体。
    6. 每孔额外添加250 µL培养基。
      注：此为1:4比例的分种；确保类球体在溶液中分布均匀，以实现相对均等的分种。无需计数类球体数量，因为最终数量不影响生成symN的成功率。
    7. 在37 °C、5% CO2条件下培养。
    8. 在第15天（或方案2中的第29天），更换全部培养基为1 mL含0.125 µM RA的symN培养基。此后，神经元应每2天换液一次，直至第20天（或方案2中的第35天）。
    9. 第20天后（或方案2中的第35天后），应仅小心更换一半原有培养基（500 µL）。此后每周换液一次，除非培养基迅速变黄。
    10. 持续每周换液至目标时间点。
      注：symN倾向于聚集成神经节样结构，并易从培养皿脱落。为防止此现象，建议采用半量换液并尽量减少操作。
  2. 为电生理记录接种细胞
    1. 准备经PO/LM/FM包被的96孔电生理记录板。
    2. 配制含有0.125 µM RA（每次换液时新鲜添加）和10 µM Y27632（仅第14天使用）的symN培养基。
    3. 在第14天，收集所有类球体，于200 x g离心4分钟。
    4. 弃去上清液，加入2 mL解离液，将混合物转移回超低吸附培养板中的一个孔内。在37 °C、5% CO2条件下孵育20–45分钟。
      注：根据类球体大小，解离时间可能超过20分钟。每10分钟检查一次细胞解离情况，最长至45分钟。可选：可在解离液中加入0.1 mg/mL DNase，以防止死细胞释放的游离DNA导致溶液黏稠。本方案中此步骤为可选，因为类球体一旦完全解离便不会再次聚集。
    5. 用移液器充分吹打以完全解离类球体，然后于200 x g离心4分钟。
    6. 弃去上清液，用适量symN培养基重悬细胞，并计数细胞数量。
    7. 以100,000/cm2的密度将细胞接种于经PO/LM/FN包被的电生理记录孔中，每孔总体积为200 µL。
    8. 在第15天（或方案2中的第29天），按照第7.1节相同流程进行换液。第15天（或方案2中的第29天）后每孔总体积应为300 µL。
    9. 在第20天后（或方案2中的第35天后），使用多电极阵列（MEA）设备检测电生理信号。
      注：在方案2中，类球体可在第14至28天之间的任意时间点接种。首次电生理信号检测可在接种后1周进行。

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结果

在本方案中，我们介绍了如何从人多能干细胞（hPSCs）诱导生成交感神经元（symNs）。此处展示的培养条件是在先前发表的方案23,24（图1A）基础上改进而来，实现了无饲养层且化学成分明确的培养体系（图1B）。本方案提供两种选择：一种可在20天内直接生成symNs；另一种则可先将神经嵴细胞（NCCs）扩增培养2周以获得更多的细胞，再进一步分化为symNs（图1B，方案1和2）。

为了准确监测分化细胞的神经嵴（symN）特性，使用了PHOX2B-eGFP WA09报告细胞系以及亲本WA09 PSC细胞系19。所有分化实验均至少进行三次生物学重复，定义为经过至少一次传代后或由新解冻的细胞冻存管独立开展的分化实验。当未分化hPSCs的融合度达到80...

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讨论

我们最近发表了两篇综述，其中一篇探讨了利用人多能干细胞衍生的对称神经元（symNs）进行疾病建模31 以及现有分化方案的深入比较22因此，本文重点在于对现有方案进行故障排查，以帮助感兴趣的科研人员成功制备对称神经元（symNs）。在整个分化过程中，为了获得一致的数据以及健康的分化细胞，必须严格控制各阶段的污染。在常规人多能干细胞（hPSC）培养中，应每两周至一个月进行一次支原体检测。若在第10天进行细胞分选，则强烈建议在任何培养基中添加抗生素。在启动分化前后检查细胞形态也至关重要。本文提出以下几个关键质控节点（图6A）。首先，适合分化的理想hPSC集落应具有明亮、平滑的边缘，并带有细小的尖状突起。具有齿轮状尖突的集落已开始分化，不应使用。强烈建议在细胞处于最佳时间点时立即使用，因为其形态可能在数小时内发生变化。仅推迟一天就可能导致细胞死亡（图6B，a）或导致菌落之间发生接触（

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Heidi Ulrichs对本文手稿的审阅和编辑。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 细胞培养皿Falcon353003
15 mL 锥形细胞培养管VWR/Corning89039-664
24 孔细胞培养板Falcon353047
24 孔超低吸附培养板Corning07 200 601 和 07 200 602
5% CO2/20% O2 细胞培养孵育箱Thermo Fisher/Life TechnologiesHeracell VIOS 160i
50 mL 锥形细胞培养管VWR/Corning89039-656
6 孔细胞培养板Costar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500细胞解离溶液
抗 AP2a 抗体Abcamab108311宿主：兔；稀释比例：1:400
抗 Ascl1 抗体BD Pharmingen556604宿主：小鼠 IgG1；稀释比例：1:200
抗 CD49D 抗体BioLegend304313宿主：小鼠 IgG1；每 100 μl 体积中加入 5 μl/百万个细胞
抗 CD49D 抗体（同型对照）BioLegend400125宿主：小鼠 IgG1；每 100 μl 体积中加入 5 μl/百万个细胞
DAPI 染料SigmaD9542稀释比例：1:1000
抗 DBH 抗体Immunostar22806宿主：兔；稀释比例：1:500
抗 GFP 抗体Abcamab13970宿主：鸡；稀释比例：1:1000
抗 HOXC9 抗体Abcamab50839宿主：小鼠；稀释比例：1:100
抗 NET1 抗体MabNET17-1宿主：小鼠；稀释比例：1:1000
抗 PRPH 抗体Santa Cruz BiotechnologySC-377093/H0112宿主：小鼠 IgG2a；稀释比例：1:200
抗 SOX10 抗体Santa Cruz Biotechnologysc-365692宿主：小鼠 IgG1；稀释比例：1:100
抗 TH 抗体Pel-FreezP40101- 150宿主：兔；稀释比例：1:500
抗坏血酸SigmaA8960-5G储存浓度：100 mM
B27 添加剂Thermo Fisher/Life Technologies12587-010储存浓度：50x
BDNFR&D Systems248-BD储存浓度：10 μg/mL
BMP4R&D Systems314-BP储存浓度：6 mM
细胞计数仪Thermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
细胞计数板载玻片InvitrogenC10312
离心机Eppendorf57021&5424R
CHIR99021R&D Systems4423储存浓度：6 mM
冻存管Thermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627储存浓度：100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018储存浓度：1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057储存浓度：1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 培养基gibcoA15165-01
E8 培养基gibcoA15169-01储存浓度：1x
E8 添加剂gibcoA15171-01储存浓度：50x
EDTASigmaED2SS储存浓度：0.5 M
电生理学培养板（AXION Cytoview MEA96）Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACS 仪器Beckman CoulterCytoFLEX（用于 FACS）
FACS 仪器Beckman CoulterMoFlo Astrios EQ（用于分选）
FACS 管（蓝色滤帽）Falcon352235
FACS 管（白色盖）Falcon352063
胎牛血清（FBS）Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450储存浓度：10 μg/mL
GeltrexInvitrogenA1413202基底膜基质；储存浓度：100x
人多能干细胞（hPSCs）Thomson et al., (1998)WA09
人多能干细胞（hPSCs）Oh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
人纤连蛋白（FN）VWR/Corning47743-654储存浓度：1 mg/mL
L-谷氨酰胺Thermo Fisher/Gibco25030-081储存浓度：200 mM
液氮罐（LN tank）Custom Biogenic SystemsV-1500AB
MEA 记录仪Axion BioSystemsMaestro Pro
小鼠层粘连蛋白 I（LM）R&D Systems3400-010-01储存浓度：1 mg/mL
N2 添加剂Thermo Fisher/Life Technologies17502-048储存浓度：100x
Neurobasal 培养基gibco21103-049储存浓度：1x
NGFPeproTech450-01储存浓度：25 μg/mL
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco14190-136储存浓度：1x
聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐（PO）SigmaP3655储存浓度：15 mg/mL
Primocin（抗生素）InvivoGenANTPM1储存浓度：50 mg/mL
qPCR 仪器Bio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCR 板Bio-Rad LaboratoriesHSP9601
重组 FGF2R&D Systems233-FB/CF储存浓度：10 μg/mL
视黄酸SigmaR2625储存浓度：1 mM
SB431542Tocris/R&D Systems1614储存浓度：10 mM
台盼蓝CorningMT-25-900-CI
玻连蛋白（VTN）Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700储存浓度：0.5 mg/mL
水浴锅VWR/Corning706308
Y27632R&D Systems1254储存浓度：10 mM

参考文献

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