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方法文章

经验证的LC-MS/MS检测面板用于定量小份毛发样本中11种耐药结核病药物

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DOI：

10.3791/60861

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2020年5月19日

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1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, TB Hair Analysis Laboratory, University of California San Francisco, 2Department of Epidemiology and Biostatistics, University of California San Francisco, 3Department of Medicine, Division of HIV, Infectious Diseases, and Global Medicine, University of California San Francisco, 4Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California San Francisco

本文内容

摘要

目前用于分析患者对耐药结核病（DR-TB）复杂治疗方案依从性的方法可能存在不准确且资源消耗大的问题。我们的方法利用易于采集和保存的毛发样本，检测其中11种DR-TB药物的浓度。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），可测定低至亚纳克水平的药物含量，从而更准确地评估患者的用药依从性。

摘要

耐药结核病（DR-TB）正日益成为重大的公共卫生威胁，评估治疗药物浓度可能具有重要的临床意义。目前血浆药物浓度是评估的金标准，但其需要采血以及冷链运输，且仅能反映极短期内的服药依从性。我们的方法采用毛发作为检测基质，毛发易于采集，且能反映长期服药依从情况，可用于检测11种抗结核药物。本课题组先前的研究表明，毛发中抗逆转录病毒药物浓度与HIV治疗结局相关。本方法使用2 mg毛发（距发根最近的3 cm段），经研磨后用甲醇提取。样本通过单一的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行分析，在16分钟内定量检测11种药物。11种药物的定量下限（LLOQ）范围为0.01 ng/mg至1 ng/mg。通过比较两个质谱离子通道的比值来确认药物的存在。采用药物与其氘代、15N标记或13C标记的同位素异构体的峰面积比进行定量。校准曲线浓度范围为0.001–100 ng/mg。将该方法应用于在直接面视下服药治疗（DOT）的DR-TB患者毛发样本（便利抽样）时，结果显示11种药物中的9种（异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、利奈唑胺、左氧氟沙星、莫西沙星、氯法齐明、贝达喹啉、普托马尼）在毛发中的药物浓度处于线性动态范围内。所有患者均未使用丙硫异烟胺，而乙硫异烟胺的检测浓度接近其LLOQ（后续研究将进一步评估其代谢产物用于暴露监测的适用性）。综上所述，我们描述了一种针对DR-TB治疗药物的多组分毛发检测方法，可作为耐药结核病治疗过程中进行治疗药物监测的技术手段。

引言

在21世纪，耐药结核病（DR-TB）已成为本已薄弱的国家结核病控制项目的不断加剧的灾难，仅在过去5年中确诊病例数量翻倍，占全球与抗微生物药物耐药性相关死亡病例的近三分之一1,2。传统上，DR-TB的成功治疗需要比药物敏感型结核病更长且毒性更强的二线治疗方案。此外，DR-TB患者通常存在显著的既往依从性困难，这正是导致耐药性最初出现的重要因素3。

与HIV感染中可用病毒载量监测治疗效果不同，结核病（TB）治疗反应的替代性终点指标在个体层面上存在延迟且不可靠4。监测患者依从性也具有挑战性，而依从性是亚治疗性抗结核药物浓度和治疗失败的重要预测因素。自我报告的依从性易受回忆偏倚以及患者取悦医护人员意愿的影响5,6。药片计数和用药事件监测系统（MEMS）可能更为客观7，但无法测量实际的药物摄入情况8,9,10。生物基质中的药物浓度可同时提供依从性和药代动力学数据，因此血浆药物浓度常用于治疗药物监测11,12。然而，在药物依从性监测的背景下，血浆浓度仅反映短期暴露情况，并且在确定适当的依从性参考范围时，受到显著的个体内和个体间变异性的限制。“白大衣效应”——即患者在就诊或研究随访前依从性提高——进一步影响了血浆药物浓度准确反映真实用药依从性模式的能力13。

毛发是一种可检测长期药物暴露的替代生物基质14,15。许多药物和内源性代谢物在毛发生长过程中从体循环进入毛发蛋白质基质。随着毛发生长过程中这一动态过程的持续，药物在毛发基质中的沉积量取决于药物在体循环中的持续存在，因此毛发可作为药物摄入时间的良好指标。作为生物基质，毛发还具有易于采集、无需冷链储存和运输（与血液相比）的额外优势。此外，毛发无生物危害性，这在现场应用中提供了更大的可行性优势。

毛发中的药物浓度长期以来一直用于法医学领域16。在过去十年中，毛发中的抗逆转录病毒药物（ARV）浓度已被证明在评估HIV治疗和预防中的用药依从性方面具有重要价值，本研究团队对此作出了贡献。研究表明，毛发中的ARV浓度是预测HIV感染治疗结局的最强独立指标17,18,19,20,21。为了确定耐药结核病（DR-TB）患者毛发中药物浓度是否同样可用于预测治疗结局，我们采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）建立并验证了一种可在少量毛发样本中分析11种DR-TB药物的方法。作为对该检测方法性能的初步评估，我们测量了南非西开普省接受直接面视下治疗（DOT）的DR-TB患者便利样本中DR-TB药物的毛发浓度22。

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方案

所有患者在采集毛发样本前均签署了书面知情同意书。本研究获得了开普敦大学和加州大学旧金山分校机构审查委员会的批准。

1. 毛发取样

  1. 获得书面知情同意书。
  2. 使用洁净的剪刀从枕部区域尽可能贴近头皮处剪取约20-30根头皮发丝。
  3. 用胶带缠绕在发丝远端以标明方向性。将头发样本折叠入铝箔纸中，并在室温下保存。标记发丝远端，以避免因额外接触近端而可能造成的污染。
  4. 除患者样本外，还需采集“空白头发”：即来自未服用结核病药物人员的头皮头发样本。每20份患者样本需采集大量空白头发（>30 mg）。

2. 药物提取

  1. 标记珠子管。每个患者样本需要一个管。标记12个管，分别标为“C0”至“C11”，对应12个校准点。标记一个低浓度质控管、一个中浓度质控管和一个高浓度质控管。最后，标记一个基质空白管。
  2. 打开装有头发样本的铝箔纸。如果头发样本长度超过3 cm，则从近端起截取3 cm，并使用该近端部分进行分析。
  3. 称取2 mg头发样本加入珠子管中。
  4. 称取2 mg空白头发加入另外16个珠子管中。这些将用于校准点、质控样本和基质空白。这些管将与患者样本采用相同的提取流程，但需在步骤2.8和2.9指定的浓度下加入药物参考标准品。
  5. 将所有珠子管放入均质器中。以6.95 m/s的速度运行均质器，进行两个30秒的循环，两次循环之间休息15秒。
  6. 配制内标混合液并加入样本中。
    1. 向50 mL容量瓶中加入约40 mL甲醇。
    2. 在棕色玻璃小瓶中，使用甲醇作为溶剂，配制表1所示的内标混合液。
      注：甲醇具有高挥发性。此过程中应始终保持小瓶加盖，以防止因蒸发造成损失。
    3. 从上述混合液中，取表1所示体积加入50 mL容量瓶中，然后用甲醇定容至50 mL。
    4. 盖紧并混匀容量瓶。除基质空白管外，向每个粉碎后的头发管中加入500 μL该混合液；向基质空白管中加入500 μL甲醇。
  7. 配制参考标准品混合液。
    1. 用甲醇溶解以下药物的纯品参考标准品，配制成步骤2.7.2表格中所示浓度。每种浓度仅需1 mL。
    2. 向一个新小瓶中加入1768 μL甲醇，再加入表2所列量的参考标准品，最终体积为2 mL。将该小瓶标记为“Ref Std Mix 1x”。涡旋混匀。
    3. 取“Ref Std Mix 1x”100 μL，加入另一新小瓶中的900 μL甲醇中。将该小瓶标记为“Ref Std Mix 10x”。涡旋混匀。
    4. 取“Ref Std Mix 10x”100 μL，加入另一新小瓶中的900 μL甲醇中。将该小瓶标记为“Ref Std Mix 100x”。涡旋混匀。
    5. 取“Ref Std Mix 100x”100 μL，加入另一新小瓶中的900 μL甲醇中。将该小瓶标记为“Ref Std Mix 1000x”。涡旋混匀。
  8. 根据表3所述量，向校准曲线管中加入“Ref Std Mix”进行加标。
  9. 配制质控混合液并加标至质控管。
    1. 标记5个小瓶，分别标为“QC-A”至“QC-E”。
    2. 向五个已标记的小瓶中分别加入以下体积的甲醇：
      QC-A：990 μL
      QC-B：940 μL
      QC-C：950 μL
      QC-D：980 μL
      QC-E：950 μL
       
    3. 使用步骤2.7.1中配制的1 mg/mL药物储备液，向下列指定小瓶中加入10 μL；对于浓度为0.5 mg/mL的BDQ和CLF储备液，则向下列小瓶中加入20 μL。
      QC-A：PTH
      QC-B：EMB、CLF、BDQ、PTM
      QC-C：INH、LFX、LZD、MFX、PZA
      QC-D：PTH、EMB
      QC-E：CLF、BDQ、PTM

      注：某些药物存在于多个混合液中。
    4. 标记一个小瓶为“QC-A df100”。将10 μL QC-A稀释至990 μL甲醇中。
    5. 标记一个小瓶为“Low QC stock”。向该小瓶中加入1832 μL甲醇，并加入以下量的QC混合液：
      QC-A df100：80 μL
      QC-B：8 μL
      QC-C：80 μL
       
    6. 标记一个小瓶为“Mid QC stock”。向该小瓶中加入760 μL甲醇，并加入以下量的QC混合液：
      QC-A df100：800 μL
      QC-B：40 μL
      QC-C：400 μL
       
    7. 标记一个小瓶为“High QC stock”。向该小瓶中加入1376 μL甲醇，并加入以下量的QC混合液：
      QC-D：160 μL
      QC-E：320 μL
      MFX, 1mg/mL stock：16 μL
      INH, 1mg/mL stock：32 μL
      LFX, 1mg/mL stock：32 μL
      LZD, 1mg/mL stock：32 μL
      PZA, 1mg/mL stock：32 μL
       
    8. 向低浓度质控珠子管中加入10 μL低浓度质控储备液。
    9. 向中浓度质控珠子管中加入10 μL中浓度质控储备液。
    10. 向高浓度质控珠子管中加入10 μL高浓度质控储备液。
  10. 将所有管置于37 °C恒温振荡器中孵育2小时。振荡速度应足够缓慢，避免水溅到管上。
  11. 从振荡器中取出管。将珠子管中的液体转移至新的微量离心管中。新管应与原管标记方式一致。
  12. 向旧管中加入500 μL甲醇。盖紧后涡旋混匀。
  13. 再次将珠子管中的液体转移至对应的微量离心管中。可接受转移少量粉碎的头发，后续将通过离心去除。
  14. 将微量离心管在2,800 x g条件下离心10分钟。
  15. 小心吸取上清液并转移至带有对应标签的新离心管中。注意不要扰动或转移头发沉淀物。
  16. 在32 °C下将离心管中的液体完全吹干。
  17. 向干燥的管中加入200 μL流动相A（含1%甲酸的HPLC级水），重新溶解样本。涡旋混匀。
  18. 将液体转移至带有250 μL插件的棕色小瓶中。

3. 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）样品制备

  1. 通过向一个一升容量瓶中加入一些HPLC级水，配制一升流动相A（含1%甲酸的HPLC级水）。然后向该容量瓶中加入10 mL >95%甲酸，再用HPLC级水定容至刻度线。
    1. 通过向一个一升容量瓶中加入一些乙腈，配制一升流动相B（含0.1%甲酸的乙腈）。然后向该容量瓶中加入1 mL >95%甲酸，再用乙腈定容至刻度线。
  2. 在柱温箱中安装一根2 × 100 mm、粒径为2.5 μm、孔径为100 Å、采用全多孔二氧化硅基质、极性封端、醚键连接苯基填料的色谱柱。确保该色谱柱已安装制造商推荐的保护柱。
  3. 打开数据采集软件，双击“硬件配置”。选中LCMS，然后点击激活配置文件。
    1. 点击新建子项目；如果已有其他子项目存在，则点击复制子项目，并为该子项目命名。
    2. 点击新建文档，双击采集方法。在采集方法窗口中点击质谱仪。
    3. 将扫描类型下拉菜单更改为MRM (MRM)，并确保极性设置为正离子模式。
    4. 点击导入列表，选择补充材料中提供的MDR-TB LCMS method transitions.csv文件。
    5. 向下滚动，将持续时间设置为16.751分钟。相应的循环时间和循环次数将自动填充。
    6. 在左侧侧边栏中点击集成式Valco阀。确保步骤0的位置名称为A。在总时间（分钟）列中，第一行输入0.4，第二行输入13。
    7. 在位置列中，将第一行设为B，第二行设为A。
    8. 在左侧侧边栏中点击二元泵。根据表4设置梯度和流速表。
    9. 在左侧侧边栏中点击自动进样器。将进样体积更改为10 μL。启用温度控制，并设置为4 °C。
    10. 在左侧侧边栏中点击柱温箱。将右侧和左侧温度均设置为50 °C。
    11. 关闭并保存方法。
  4. 点击新建文档，选择采集序列以创建序列。输入序列名称，并从下拉栏中选择新创建的方法。
    1. 在电子表格中创建一个按以下顺序排列的序列：校准曲线、质控样品、患者样本、校准曲线、质控样品、患者样本、校准曲线、质控样品。在运行开始和结束时，以及在校准曲线、质控样品和患者样本前后添加溶剂空白进样。在校准曲线和高浓度质控样品进样后，至少插入八个溶剂空白进样，以减少分析物残留。
      注：根据色谱柱使用时间的长短，可能需要增加更多的溶剂空白进样。
    2. 在样品名称相邻的列中，输入对应样品瓶的自动进样器位置。
    3. 点击添加序列。在弹出窗口中输入序列中的样品数量。
    4. 将电子表格中的样品名称和样品瓶位置复制粘贴到新创建的序列中。
    5. 转到提交选项卡，点击提交按钮。
  5. 将溶剂管路A插入流动相A，溶剂管路B插入流动相B，以平衡系统。打开二元泵上的 purge 阀。
    1. 将溶剂组成设置为50% B，流速为4 mL/min。启动二元泵。
    2. 5分钟后，将流速降低至0.3 mL/min，关闭 purge 阀。检查是否存在泄漏。
    3. 在软件中，点击顶部工具栏的平衡按钮。将时间设置为>5分钟，点击确定。
    4. 仪器平衡完成后，窗口右下角的模块将显示为绿色。确认压力已稳定后，点击开始 样品以启动序列。

 4. 数据分析

  1. 批次完成后，打开定量软件。点击魔棒图标以创建一个新的结果表。
    1. 点击浏览，导航至相应文件夹，然后选中数据文件并点击右向箭头，将数据移至已选区域。点击下一步。
    2. 选择创建新方法，然后点击新建。输入新的定量方法名称，点击保存，然后点击下一步。
    3. 选择中间校准点的第一次进样。按下一步。
    4. 在内标（IS）列中，勾选所有内标物的跃迁通道。
    5. 对于参考标准品的定量离子跃迁，在内标名称（IS Name）列中选择相应的内标物。点击下一步。
    6. 滚动查看各跃迁通道，确认自动选择的保留时间准确无误。确保高斯平滑（Gaussian Smoothing）设置为1.5。其余默认设置保持不变（即噪声百分比100%，基线扣除窗口2.00分钟，峰分裂2个点）。
      注：如有需要，可在此处修改自动积分参数。由于这些参数随仪器设置而异，本文未提供具体数值。
    7. 点击完成，将该定量方法应用于当前批次。
  2. 点击左上角的显示峰审查按钮以查看色谱图。使用左侧边栏浏览各个跃迁通道。逐个检查每个定量离子跃迁的每次进样，必要时手动积分正确峰。
    1. 要手动积分峰，请点击启用手动积分模式按钮，通过在x轴或y轴上点击并拖动来放大色谱图，然后从一个基线画线至另一个基线以定义峰。 图3 显示了两个色谱图：一个含有INH，因此已进行手动积分；另一个不含INH。
      注：所有进样必须使用相同的参数进行积分。峰宽可作为遵循这些参数的参考依据，但有时峰宽会有所不同。为定量一个峰，其保留时间必须在该分析物预期保留时间的±0.15分钟范围内（由参考标准品峰定义），定性上需确认其定量离子与定性离子比值符合预期（如图2所示），且信噪比大于10。
  3. 在样品类型列中，将校准曲线进样（空白校准曲线进样除外）设置为标准品，将质控样品进样设置为“质控品”（Quality Control），其余进样保持为未知样品。
    注：此设置将应用于所有跃迁通道。
  4. 在实际浓度列中，输入表5中列出的所有校准曲线和质控样品进样的浓度。
  5. 点击左上角第二个显示校准曲线按钮。点击回归按钮。
  6. 将权重类型设置为1/x，然后点击确定。
  7. 验证校准曲线和质控样品，以确保批次运行成功。
    1. 针对每个定量离子参考跃迁（非内标跃迁），查看每个校准曲线进样的准确度（位于准确度列）。至少三分之二的校准点准确度应在80%-120%之间。
    2. 对于明显偏离预期准确度的校准点，该进样可能为离群值。若某进样计算浓度与其他两针该样品瓶进样结果相差超过两个标准差，则可将其排除。点击每张色谱图上方的“设峰为‘未检出’”按钮。
    3. 检查校准曲线上方显示的R值是否>0.975。
    4. 检查所有质控样品进样的准确度是否均在80%-120%之间。
  8. 若上述所有条件均满足，则该批次通过，样品可进行定量。点击工具栏中的编辑，然后点击复制整个表格。将表格粘贴至电子表格中。
  9. 取两个样品进样计算浓度的平均值，作为每个样品的报告浓度。

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结果

一张包含全部11种耐药结核病药物确认浓度水平的色谱图示意图如图所示 图1不同仪器和色谱柱使用时，各分析物的保留时间可能发生变化，因此应分别确定其确切保留时间。

在其中一个校准样品（添加了耐药结核病药物参考标准品的空白毛发样本）中，某种特定药物（异烟肼，INH）的提取离子色谱图（EIC）如图2所示。通过定量离子和定性离子的跃迁来定性确认药物的存在，因为定量离子峰面积与定性离子峰面积之比在不同样品间保持恒定。同时监测内标物，以确保每次样品进样的信号均一化。

为演示目的，我们分析了来自南非西开普省在直接面视下服药（DOT）条件下接受耐药结核病（DR-TB）药物治疗的96例患者中的15份便利性采集的毛发样本。表6展示了每种分析物检测到的最低和最高浓度范围内的代表性DR-TB药物水平。尽管展示了15例患者的样本数据，但由于每位患者所使用的DR-TB药物组合不同，因此并非每种分析物均有1...

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讨论

本文报告了我们开发并验证的一种方法的操作方案，该方法利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对用于治疗耐药结核病（DR-TB）的小份头发样本中的11种抗结核药物进行定量分析。此前尚无任何其他针对这11种药物在头发中定量分析的方法被开发、验证并发表。我们的方法仅需约3厘米长的20至30根头发（约2 mg），即可实现药物在亚纳克水平的定量，并且该方法已通过验证22。由于所需头发样本重量极低，参与研究的患者可隐秘地完成采样，并可能在无需担心暴露秃发头皮的情况下接受重复检测。我们此前已发表关于耐药结核病治疗药物在头发中的浓度与治疗结局之间关联的研究数据23。因此，该多组分分析面板方法的开发与验证代表了耐药结核病治疗药物监测领域的一项重大进展。

毛发所需的均质化技术与液体生物基质不同。将毛发纤维粉碎可使提取溶剂高效地接触毛发基质中的分析物。因此，本方法的一个重要特点是利用粉碎后的样品实现药物从毛发中快速、简便地提取。由于粉碎后毛发具有较大的可接触表面积，提取过程中的孵育时间仅为2小时，且由于样...

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披露

本工作由美国过敏与传染病研究所 RO1 AI123024（共同项目负责人：John Metcalfe 和 Monica Gandhi）资助。

致谢

作者谨此感谢开普敦大学肺病研究所的Keertan Dheda教授、Ali Esmail博士以及Marietjie Pretorius，他们协助完成了本研究中毛发样本的采集工作。作者还衷心感谢参与本研究的各位受试者所做出的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 mL 注射小瓶Agilent Technologies5182-0716
250 µL 注射小瓶内插管Agilent Technologies5181-8872
Bead Ruptor 24OMNI International19001
均质管（2 mL 均质套件，2.8 mm 陶瓷珠，2 mL 微量管）OMNI International19628
贝达喹啉Toronto Research ChemicalsB119550
贝达喹啉-d6Toronto Research ChemicalsB119552
氯法齐明Toronto Research ChemicalsC324300
氯法齐明-d7Toronto Research ChemicalsC324302
一次性石灰玻璃培养管VWR60825-425
乙胺丁醇Toronto Research ChemicalsE889800
乙胺丁醇-d4Toronto Research ChemicalsE889802
乙硫异烟胺Toronto Research ChemicalsE890420
乙硫异烟胺-d5ClearSynthCS-O-06597
甲酸Sigma-AldrichF0507-100mL
玻璃瓶Corning1395-1L
加热振荡器Bellco Glass Inc7746-32110
HPLCAgilent TechnologiesInfinity 1260
色谱纯乙腈Honeywell015-4
色谱纯甲醇Honeywell230-1L
色谱纯水Aqua Solutions IncW1089-4L
异烟肼Toronto Research ChemicalsI821450
异烟肼-d4Toronto Research ChemicalsI821452
LC 色谱柱，Synergi 2.5 µm Polar RP 100 A，100 × 2 mmPhenomenex00D-4371-B0
LC 保护柱芯PhenomenexAJ0-8788
LC 保护柱套PhenomenexAJ0-9000
LC-MS/MS 定量分析软件SciexMultiquant 2.1
左氧氟沙星Sigma-Aldrich1362103-200MG
左氧氟沙星-d8Toronto Research ChemicalsL360002
利奈唑胺Toronto Research ChemicalsL466500
利奈唑胺-d3Toronto Research ChemicalsL466502
微量离心管E&K Scientific695554
莫西沙星Toronto Research ChemicalsM745000
莫西沙星-13C, d3Toronto Research ChemicalsM745003
MS/MSSciexTriple Quad 5500
OPC 14714Toronto Research ChemicalsO667600
普托马尼（PA-824）Toronto Research ChemicalsP122500
丙硫异烟胺Toronto Research ChemicalsP839100
丙硫异烟胺-d5Toronto Research ChemicalsP839102
吡嗪酰胺Toronto Research ChemicalsP840600
吡嗪酰胺-15N, d3Toronto Research ChemicalsP840602
注射小瓶用隔垫盖Agilent Technologies5185-5862
TurboVap LV 浓缩仪Biotage103198/11

参考文献

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