调理黏附试验是评估疫苗研发中抗体调理功能的一种替代方法，可作为调理吞噬杀伤试验的补充。
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方法文章
用于评估疫苗研发中功能性抗体的调理-黏附试验 炭疽杆菌 及其他包封病原体
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
调理黏附试验是一种功能性检测方法，用于定量细菌病原体与专职吞噬细胞的黏附情况。由于黏附是吞噬作用和杀灭病原体的前提，该试验可作为调理吞噬杀伤试验的一种替代方法 。调理黏附 试验的一个优势在于可使用灭活的病原体和哺乳动物细胞系，从而实现多个实验之间的标准化。在试验中使用灭活病原体还有助于对生物安全等级3的感染性因子及其他高毒力病原体进行操作。在我们的研究中，采用调理黏附试验评估了经炭疽荚膜疫苗免疫的动物血清中抗体诱导固定化的Bacillus anthracis与小鼠巨噬细胞系RAW 264.7发生黏附的功能能力。通过自动化荧光显微镜拍摄黏附于巨噬细胞的杆菌图像。黏附程度的增加与血清中存在抗荚膜抗体相关。血清中抗荚膜抗体浓度较高的非人灵长类动物可免受炭疽攻击。因此，调理黏附试验可用于阐明血清中抗原特异性抗体的生物学功能，评估候选疫苗及其他治疗手段的有效性，并可能作为免疫保护的相关指标。
引言
识别、附着、内化和降解病原体是吞噬作用的关键环节1，该过程是宿主先天免疫应答中的一个重要通路，最早由Ilya Metchnikoff于1883年提出2,3。吞噬性白细胞以及其他免疫系统细胞在靶标选择上具有高度特异性；它们可通过模式识别受体（PRRs）识别病原体相关分子模式，从而区分“感染性非己”与“非感染性自身”4,5。宿主对病原体的识别还可通过宿主 调理素（如补体和抗体）的结合而实现6。这一过程称为调理作用，即在病原体表面包被这些分子，使其与吞噬细胞上的调理素受体（如补体受体和Fc受体）结合后更易被内化6。病原体与吞噬细胞的附着需要多个受体与其相应配体共同结合才能实现。只有在此基础上，附着才能触发并在细胞内持续激活信号级联反应，从而启动内化过程6。
由于吞噬作用在清除病原体和预防感染方面具有重要作用，胞外病原体已进化出多种机制来破坏这一过程，以延长其存活时间。其中一种重要策略是产生带负电荷的聚合物荚膜（例如多糖或聚氨基酸），这类荚膜因其电荷特性....
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方案
本研究遵循《动物福利法》、公共卫生服务政策以及与动物及动物实验相关的其他联邦法规和条例，在经机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。开展本研究的机构已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证，并遵守美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》（2011年版）中所述的各项原则24。
1. RAW 264.7 细胞系的培养与维持
注意：以下操作必须使用无菌技术进行。
- 将胎牛血清（FBS）在56 °C水浴中加热30分钟，以灭活补体。
注意：30 分钟的灭活时间从 FBS 达到 56 °C 时开始计算。为监测温度，可在同一水浴中用烧杯加热与 FBS 相近体积的水。当水温达到 56 °C 时，开始对 FBS 启动 30 分钟倒计时。或者，已灭活的 FBS 已热灭活 也可商业获取。 - 通过将90%高糖DMEM与10%热灭活FBS（v/v）混合，制备RAW 264.7细胞培养基。加入L-谷氨酰胺，使其终浓度为6 mM。
注意：高糖DMEM含有4 mM L-谷氨酰胺。将L-谷氨酰胺补充至6 mM可促进细胞稳定生长。可添加100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素以防止污染。另一种常用的小鼠细胞系J774A.1也可使用，其培养条件相似。 - 将一管冷冻细胞在37 °C....
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结果
本部分展示了在OAA实验期间采集的代表性显微图像，以及表明OAA可用于研究抗体生物学功能的结果。此处，该检测成功用于评估一种炭疽疫苗候选物的有效性。验证芽孢杆菌的荚膜包裹状态至关重要，因为极少或无荚膜包裹会导致其黏附于宿主细胞，从而产生较高的背景信号。图1为经印度墨汁负染色后观察B. anthracis Ames荚膜的图像。OAA需要对多个相邻视野进行照明，若使用共聚焦显微镜，则需采集多个焦平面或切片图像。因此，必须确认芽孢杆菌的荧光信号既不过弱，也不会过快发生光漂白。图2为用FITC标记的芽孢杆菌图像。图3展示了B. anthracis Ames附着于细胞单层的最大投影图像。这些为OAA计数与评分所依据的代表性视野。与PGGA-OMPC抗血清共同孵育的芽孢杆菌附着增加，是由于抗荚膜抗体的存在，这些抗体对芽孢杆菌起到了调理作用。图4显示，接种10 µg和50 µg .......
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讨论
基于荚膜的疫苗已被证明对多种细菌病原体具有有效性，且其中许多已获准用于人类25,26,27这些疫苗通过诱导产生靶向荚膜的抗体发挥作用，许多此类研究采用OPKA来展示抗体的调理吞噬功能。13,14,16,28,29由于生物安全方面的考虑以及为了便于操作，我们开发了一种OAA，用于评估接种疫苗动物所产生的抗体 B. anthracis 荚膜结合物。荚膜的存在表明 B. anthracis 防止黏附和吞噬作用30，但用疫苗接种动物的血清对杆菌进行调理可诱.......
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披露
作者不存在可能构成利益冲突的商业或其他关联。
致谢
J. Chua、D. Chabot 和 A. Friedlander 设计了本文所述的实验方案。J. Chua 和 T. Putmon-Taylor 进行了实验操作。D. Chabot 完成了数据分析。J. Chua 撰写了本文。
作者感谢 Kyle J. Fitts 提供出色的技术支持。
本工作由国防威胁降低局资助，资助编号为 CBM.VAXBT.03.10.RD.015，计划编号 921175。
观点、解释、结论和建议均为作者个人观点，不一定代表美国陆军的立场。本出版物的内容不一定反映国防部的观点或政策，提及的商标名称、商业产品或组织并不意味着得到美国政府的认可。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.20 µm 注射器滤器（25 mm，再生纤维素） | 康宁，纽约州康宁市 | 431222 | |
| 10 mL 注射器（鲁尔锁扣式针头） | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | 302995 | |
| 15µ 96孔黑色培养板（成像用1号板） | In Vitro Scientific，加利福尼亚州森尼韦尔 | P96-1-N | |
| 16% 多聚甲醛 | 电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德 | 15710 | |
| 75 cm² 组织培养处理过的培养瓶 | 康宁，纽约州，康宁 | 430641 | |
| 琼脂（粉末） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | A1296 | |
| 幼兔补体 | Cedarlane Labs，北卡罗来纳州伯灵顿 | CL3441 | |
| 酵母提取物（Bacto） | BD，Sparks，医学博士 | 288620 | |
| BBL 脑心浸液（BHI） | BD，Sparks 博士 | 211059 | |
| 血琼脂（含羊血的TSA）平板 | Remel，Lenexa，KS | R01198 | |
| 细胞刮刀 | Sarstedt，牛顿，北卡罗来纳州 | 83.183 | |
| Costar 96 孔细胞培养板（板 #2 &以及用于稀释的3号管 | 康宁，纽约州，美国 | 3596 | |
| 盖玻片 | 电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德 | 72200-10 | |
| Difco 营养肉汤 | BD，Sparks，MD | 234000 | |
| 高糖型杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 11965-092 | 含 4500 mg/L 葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺、酚红 |
| EVOS FL Auto 细胞成像系统（荧光显微镜） | Life Technologies，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | AMAFD1000 | |
| 胎牛血清 | Hyclone，GE Healthcare Life Sciences，美国犹他州南洛根 | SH30071.03 | 未经γ射线照射，未经热灭活 |
| 异硫氰酸荧光素 | Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange 细胞染料 | Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | H32713 | |
| 血细胞计数板（改良型纽鲍尔） | Hausser Scientific，宾夕法尼亚州霍舍姆 | 3900 | |
| 印度墨水溶液 | BD，Sparks，医学博士 | 261194 | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham MA | 25030081 | 在培养基中补充额外的 2 mM L-谷氨酰胺 |
| 尼康Eclipse TE2000-U（倒置复合显微镜） | 尼康仪器公司，美国纽约州梅尔维尔 | TE2000 | |
| 不含钙和镁的 PBS | Lonza，美国马里兰州沃克维尔 | 17-516F | |
| 青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩 | Hyclone，GE Healthcare Life Sciences，美国犹他州南洛根 | SV30010 | |
| 培养皿（100 × 15 mm） | Falcon，康宁，北卡罗来纳州德罕 | 351029 | 用于琼脂平板 |
| RAW 264.7 巨噬细胞系（Tib47） | ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯 | ATCC TIB-71 | |
| 载玻片 | VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州 | 16004-422 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | S5761 | |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯 | T8154 | |
| 蔡司700激光扫描显微镜（共聚焦显微镜） | 卡尔·蔡司显微成像公司，美国纽约州桑伍德 | 4109001865956000 |
参考文献
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoolo....
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重印与许可
