需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

用于评估疫苗研发中功能性抗体的调理-黏附试验 炭疽杆菌 及其他包封病原体

3.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/60873

⸱

2020年5月19日

 ,  ,  , 
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 3Bioqual

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

调理黏附试验是评估疫苗研发中抗体调理功能的一种替代方法，可作为调理吞噬杀伤试验的补充。

摘要

调理黏附试验是一种功能性检测方法，用于定量细菌病原体与专职吞噬细胞的黏附情况。由于黏附是吞噬作用和杀灭病原体的前提，该试验可作为调理吞噬杀伤试验的一种替代方法 。调理黏附 试验的一个优势在于可使用灭活的病原体和哺乳动物细胞系，从而实现多个实验之间的标准化。在试验中使用灭活病原体还有助于对生物安全等级3的感染性因子及其他高毒力病原体进行操作。在我们的研究中，采用调理黏附试验评估了经炭疽荚膜疫苗免疫的动物血清中抗体诱导固定化的Bacillus anthracis与小鼠巨噬细胞系RAW 264.7发生黏附的功能能力。通过自动化荧光显微镜拍摄黏附于巨噬细胞的杆菌图像。黏附程度的增加与血清中存在抗荚膜抗体相关。血清中抗荚膜抗体浓度较高的非人灵长类动物可免受炭疽攻击。因此，调理黏附试验可用于阐明血清中抗原特异性抗体的生物学功能，评估候选疫苗及其他治疗手段的有效性，并可能作为免疫保护的相关指标。

引言

识别、附着、内化和降解病原体是吞噬作用的关键环节1，该过程是宿主先天免疫应答中的一个重要通路，最早由Ilya Metchnikoff于1883年提出2,3。吞噬性白细胞以及其他免疫系统细胞在靶标选择上具有高度特异性；它们可通过模式识别受体（PRRs）识别病原体相关分子模式，从而区分“感染性非己”与“非感染性自身”4,5。宿主对病原体的识别还可通过宿主 调理素（如补体和抗体）的结合而实现6。这一过程称为调理作用，即在病原体表面包被这些分子，使其与吞噬细胞上的调理素受体（如补体受体和Fc受体）结合后更易被内化6。病原体与吞噬细胞的附着需要多个受体与其相应配体共同结合才能实现。只有在此基础上，附着才能触发并在细胞内持续激活信号级联反应，从而启动内化过程6。

由于吞噬作用在清除病原体和预防感染方面具有重要作用，胞外病原体已进化出多种机制来破坏这一过程，以延长其存活时间。其中一种重要策略是产生带负电荷的聚合物荚膜（例如多糖或聚氨基酸），这类荚膜因其电荷特性而具有抗吞噬性，免疫原性差，并能屏蔽细菌包膜上的分子，使其免于被模式识别受体（PRRs）识别6,7。Cryptococcus neoformans 和 Streptococcus pneumoniae 等病原体的荚膜由糖类聚合物组成，而 Staphylococcus epidermidis 及某些 Bacillus 物种则产生聚-ɣ-谷氨酸（PGGA）7,8。另一些病原体产生的荚膜则类似于非感染性的自身成分。例如，Streptococcus pyogenes 和一种致病性 B. cereus 菌株具有透明质酸荚膜，这种荚膜不仅具有抗吞噬性，还可能不被免疫系统识别为外来物质9,10。

将荚膜与载体蛋白偶联，可将其从弱的、T细胞非依赖性抗原转化为高免疫原性的T细胞依赖性抗原，从而诱导产生高滴度的血清抗荚膜抗体11,12。该策略被用于已获许可的疫苗以预防 S. pneumoniae, 流感嗜血杆菌，以及 脑膜炎奈瑟菌11抗荚膜抗体的调理活性通常通过以下方法进行评估： 调理吞噬杀伤试验（OPKA）13,14,15,16。这些 检测方法测试 功能性抗体是否能够触发吞噬作用和杀伤效应14然而，使用OPKA检测感染性病原体（如第一级生物选择剂和毒素（BSAT））时，包括 B. anthracis17，具有危险性并存在安全风险；这些检测需要大量操作管制性病原体。管制性病原体的操作只能在受限的生物安全三级（BSL-3）实验室中进行；由于必须遵循众多安全与安保措施，此类区域的工作流程极为繁琐。此外，BSL-3实验室通常未配备用于OPKA实验的专用设备，例如显微镜和流式细胞仪。因此，我们开发了一种基于灭活细菌的替代检测方法18,19我们将此称为依赖调理的黏附试验（OAA），该试验不以内化和杀伤作为检测指标；而是以调理后的灭活病原体的黏附作用作为吞噬作用的指标。从机制上讲，OAA 是一种合适的替代方法，因为黏附是吞噬过程中的一个必要步骤 先验的 并且与病原体的内化及细胞内杀伤过程密切相关。从生物安全角度而言，优选氧化偶联法（OAA），因其对传染性病原体的操作需求极少，实验周期较血清杀菌活性试验（OPKA）更短，且在制备并转移灭活病原体储备液后，可在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。

我们展示了如何利用吞噬活性分析（OAA）来检测接种了荚膜结合疫苗（即炭疽杆菌 B. anthracis 的PGGA与脑膜炎奈瑟菌 Neisseria meningitidis 外膜蛋白复合物[OMPC]结合而成的疫苗）的非人灵长类动物（NHPs）血清中抗荚膜抗体的调理功能20。 经血清调理的杆菌与贴壁生长的小鼠巨噬细胞系RAW 264.7共同孵育。固定后，通过荧光显微镜对细胞单层及附着的杆菌进行成像。与对照血清相比，当杆菌与接种荚膜结合疫苗的NHP血清孵育时，其黏附量增加20。这种黏附程度与炭疽攻击后的存活率呈正相关20,21。因此，OAA的应用明确了抗荚膜抗体的功能，并极大促进了我们对候选疫苗的评估。 

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究遵循《动物福利法》、公共卫生服务政策以及与动物及动物实验相关的其他联邦法规和条例，在经机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。开展本研究的机构已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证，并遵守美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》（2011年版）中所述的各项原则24。

1. RAW 264.7 细胞系的培养与维持

注意：以下操作必须使用无菌技术进行。

  1. 将胎牛血清（FBS）在56 °C水浴中加热30分钟，以灭活补体。
    注意：30 分钟的灭活时间从 FBS 达到 56 °C 时开始计算。为监测温度，可在同一水浴中用烧杯加热与 FBS 相近体积的水。当水温达到 56 °C 时，开始对 FBS 启动 30 分钟倒计时。或者，已灭活的 FBS 已热灭活 也可商业获取。
  2. 通过将90%高糖DMEM与10%热灭活FBS（v/v）混合，制备RAW 264.7细胞培养基。加入L-谷氨酰胺，使其终浓度为6 mM。
    注意：高糖DMEM含有4 mM L-谷氨酰胺。将L-谷氨酰胺补充至6 mM可促进细胞稳定生长。可添加100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素以防止污染。另一种常用的小鼠细胞系J774A.1也可使用，其培养条件相似。
  3. 将一管冷冻细胞在37 °C水浴中解冻，一旦完全融化立即取出。无菌操作将内容物转移至含有5 mL完全培养基的锥形管中。轻轻倒置锥形管两次，随后在300 x g 离心5分钟以沉淀细胞。
  4. 使用连接真空泵的无菌巴斯德吸管吸除冻存液，重悬细胞沉淀于 5 mL 新鲜培养基中。
  5. 将悬液转移至经组织培养处理的培养瓶或培养皿中。加入足量培养基，使其完全覆盖瓶底，轻轻晃动以均匀分布细胞。标注传代次数，起始编号为“1”。
  6. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞2 并在湿度达到95%至100%汇合度前持续培养。从孵育的第二天开始，每天在显微镜下观察细胞。切勿让细胞达到 >100% 汇合度，因为这会导致细胞脱落并死亡。
    注意：达到汇合所需的时间取决于接种的活细胞数量以及培养瓶的生长面积。因此，建议每天观察细胞生长情况。
  7. 通过刮取细胞并将其稀释至新鲜培养基中进行传代培养，每次刮取间确保至少两天的生长时间。每次传代培养时，传代次数增加1。
    注意：传代后次日立即刮取细胞将导致随时间推移细胞总体黏附性更快丧失。RAW 264.7 细胞最多仅可使用至约第 15 代。
  8. 为OAA检测接种RAW 264.7细胞时，更换新鲜培养基，使用细胞刮轻轻刮下培养瓶中的细胞。反复吹打悬液以分散细胞团块，便于细胞计数。
    注意：传代培养RAW 264.7细胞的传统方法为刮取法。根据我们的经验，使用胰蛋白酶消化会导致RAW 264.7细胞随时间推移失去贴壁能力的速度较刮取法更快。
  9. 为计数细胞，取等体积的细胞悬液与台盼蓝溶液混合。取10 µL混合液加入血细胞计数板。使用倒置显微镜配合10倍物镜观察，并计数拒染的活细胞数量。
  10. 接种 1.4 × 104 每孔接种活细胞至96孔0.15 µm厚玻璃平底板（Plate #1）中。细胞培养3天。在进行OAA实验前一天更换培养基。
    注意：培养3天后，细胞数量应约为5 x 104/孔  

2. 细菌培养与制备

注意：本方案中使用的细菌物种为具有荚膜的高毒力菌株 B. anthracis Ames。对该菌株的所有操作均需具备相应的生物安全与安保许可，并且必须在位于BSL-3实验室内的II级或III级生物安全柜中进行。操作细菌时，须遵循机构关于BSL-3工作的标准操作程序以及个人防护装备的使用规范。

  1. 通过将37 g脑心浸液（BHI）粉末溶解于1 L水中，并在121 °C下高压灭菌15分钟，制备脑心浸液肉汤。将肉汤储存在室温条件下。
  2. 用水配制8%碳酸氢钠溶液，并使用0.20 µm滤膜注射器过滤除菌。将溶液储存在4 °C下，并在1天内使用。
  3. 将8 g营养肉汤、3 g酵母提取物和15 g琼脂溶于1 L水中，制备NBY琼脂平板。在121 °C下高压灭菌15分钟，倒入培养皿中，静置使其凝固。将平板储存在4 °C下。
    注意：NBY琼脂平板可含或不含碳酸氢钠。在液体和固体培养基中添加碳酸氢钠可诱导产生黏液型菌落，这些菌落由有荚膜的杆菌组成。液体和固体培养基中碳酸氢钠的终浓度为0.8%。
  4. 通过混合50%高压灭菌的BHI肉汤、40%胎牛血清（FBS）和10%碳酸氢钠溶液（v/v），制备用于培养B. anthracis的培养肉汤。
    注意：该培养基配方旨在产生短链的有荚膜杆菌。
  5. 在进行液体培养前一天，从芽孢储备液中取样，在NBY琼脂平板上划线分离，制备B. anthracis主平板。于37 °C培养。
  6. 在通气的250 mL三角瓶中加入30 mL培养肉汤，并接种数个B. anthracis菌落。
    注意：为获得最大程度荚膜化的杆菌，需使用此处指定的液体体积与表面积比例。
  7. 将肉汤培养物在37 °C、20% CO2及湿度条件下，以125 rpm振荡培养18–24小时。
    注意：在高于37 °C的温度下培养B. anthracis可能会抑制荚膜的生成。
  8. 在固定前，使用印度墨水负染法确认荚膜形成充分，且杆菌呈短链排列（每链1–5个杆菌）（见第3节）。
  9. 为测定菌落形成单位（CFU），取100 µL培养物用磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液进行1:10系列稀释，将稀释后的菌液涂布于羊血琼脂平板上。在37 °C培养12–18小时。计数CFU，并计算每毫升培养物中的细菌数量。
    注意：细菌固定后也可在显微镜下使用血细胞计数板进行计数。但不推荐此方法，因为在低倍镜下难以观察到杆菌。
  10. 向全部体积的细菌培养物中加入16%多聚甲醛（PF），使其终浓度为4% PF，以固定杆菌。在室温下缓慢振荡孵育7天。
    注意：在4% PF中孵育7天的操作依据美国传染病医学研究所（USAMRIID）机构标准操作程序，用于固定营养态杆菌。
  11. 为去除固定剂并检测无菌性，将4 mL（占总体积10%）固定后的细菌悬液转移至50 mL锥形管中，用PBS洗涤三次，每次加入30 mL PBS，在≥3000 x g条件下离心45分钟。将剩余样品储存在含4% PF的溶液中，置于4 °C保存。
    注意：由于荚膜的存在，离心后细菌沉淀呈蓬松状。洗涤过程中应避免扰动沉淀。必须彻底去除所有固定剂，以防干扰后续的活性检测。如有必要，可增加洗涤次数。
  12. 进行活性检测时，取4 mL洗涤后的悬液（不超过肉汤体积的10%）接种至40 mL细菌生长培养基（如BHI肉汤）中，在37 °C培养7天。分别在培养前后测定600 nm处的光密度以评估浊度变化。
  13. 在肉汤培养中孵育7天后，取≥100 µL培养液涂布于琼脂平板，并继续培养7天。若未观察到浊度增加且平板上无菌落生长，则认为原始培养物已达到无菌状态，可转移至BSL-2实验室。
    注意：根据美国联邦特定病原体计划22规定，灭活的B. anthracis仅可在证明样品完全无菌后，方可从BSL-3实验室转移。对灭活B. anthracis的活性检测要求是：先将样品的10%接种于液体培养基中培养7天，再转接至固体培养基继续培养7天22,23。在确认无菌后，应遵循所在机构的指导方针申请转移许可。 

3. 负染色法与光学显微镜观察荚膜及杆菌链

  1. 在载玻片上将5 µL细菌悬液与2 µL印度墨水混合。将厚度为1或1.5 µm的盖玻片覆盖在悬液上，避免产生气泡。
    注意：可使用指甲油将盖玻片密封固定在载玻片上。
  2. 使用光学显微镜的40x至100x油镜观察细菌悬液。通过观察每个细菌周围是否存在透明区（荚膜排斥印度墨水形成的空白区域）来确认细菌是否具有荚膜，并确认杆菌呈短链排列。

4. 细菌的FITC标记

  1. 将异硫氰酸荧光素（FITC）溶于二甲基亚砜中，配制成浓度为 2 mg/mL 的溶液。
  2. 测量灭活细菌储备液的体积。
  3. 用 PBS 洗涤储备液 3 次，以去除固定剂。
  4. 加入 FITC 溶液，使其终浓度为 75 µg/mL。在 4 °C 下缓慢振荡混合物 18–24 小时。
  5. 通过在 ≥3000 x g 条件下离心 45 分钟，将细菌洗涤 3 次，每次使用 30 mL PBS 以去除过量的 FITC。洗涤过程中应确保疏松的沉淀不受扰动。将杆菌重新悬浮于与初始体积相同的 PBS 中。
  6. 将杆菌分装至微量管中，于 -20 °C 保存备用。避免多次冻融，以免杆菌丢失荚膜。

5. 细菌调理作用

  1. 将少量待测血清（来自非人灵长类动物）置于56 °C的加热块中，灭活30分钟。
  2. 将FITC标记的细菌解冻，并用PBS洗涤两次，每次在15000 ×g离心3–5分钟。然后将其重悬于与初始体积相同的PBS中。
  3. 在96孔圆底板（板#2）中，用细胞培养基对待测血清进行系列稀释。在另一块96孔圆底板（板#3）中，向每个孔加入10 µL稀释后的待测血清。
    注意：每块板中均以PBS和正常猴血清替代稀释的待测血清作为阴性对照。我们还选择一份待测血清作为阳性对照，用于生成标准曲线，以标准化不同日期进行的所有实验。该阳性对照血清为任意选定，因其来源充足。
  4. 向板#3中加入10 µL新配制的幼兔补体。
    注意：一旦配制完成，剩余的幼兔补体应丢弃；不得再次冻融。
  5. 向板#3中加入适量的FITC标记杆菌，使感染复数为1:20。例如，若细胞数量为5 × 104，则加入含有5 × 104 × 20个杆菌的体积。随后向板#3的每孔中加入适量细胞培养基，使总体积达到105 µL。
    注意：含细胞的板#1将加入100 µL调理后的细菌，剩余5 µL为空白体积。每个待测血清稀释度均设复孔。
  6. 将板#3置于37 °C、5% CO2及湿度条件下孵育30分钟，以完成杆菌的调理作用。

6. 哺乳动物细胞黏附实验与荧光标记

  1. 使用前将所有试剂保持在 37 °C。
  2. 将含有贴壁细胞的 1 号板放置于 37 °C 的加热金属块上。
  3. 使用多通道移液器从孔中移除用过的培养基，并迅速加入来自 3 号板的 100 µL 已调理的细菌。确保移液过程中孔内未产生气泡。将 1 号板在 37 °C、5% CO2 及湿度条件下孵育 30 分钟，以促进细菌黏附。
  4. 在 37 °C 加热金属块上，用 150 µL PBS 每孔洗涤 5 次，以去除未黏附的杆菌。
    注意：洗涤过程中需小心操作，避免细胞意外脱落。
  5. 用 PBS 将 16% PF 按 1:4 比例稀释，配制成 4% PF。向每孔加入 150 µL 该固定液，固定细胞 1 小时。用 PBS 洗涤细胞 2 次。
  6. 将 2 µL HCS（高内涵筛选）Orange 细胞染料加入 10 mL PBS 中混匀。向固定后的细胞中每孔加入 150 µL 染色液，在室温下孵育 30 分钟。
  7. 用 PBS 洗涤各孔 2 次。
  8. 于 4 °C 保存，直至进行显微镜观察。

7. 显微镜观察

注意：通常情况下，高通量自动化荧光显微镜有助于OAA的成像。如果缺乏自动化系统，可手动采集贴壁杆菌的荧光图像21。在本研究中20，使用配备专用设备的蔡司700激光扫描显微系统对贴壁杆菌和细胞单层进行成像；我们的系统由配备自动载物台、定焦模块（Definite Focus module）、40倍NA 0.6物镜、Axio Cam HRc相机和Zen 2012（蓝版）软件的蔡司Axio Observer Z1倒置显微镜组成。所获取的图像为宽场图像，而非共聚焦图像。以下方案旨在提供一种适用于多种自动化显微镜系统的基本显微镜设置。

  1. 将 1 号培养板在室温下孵育 30 分钟。开启显微镜及相关设备。
    注意：在成像前将样品于室温下进行适应，可防止玻璃板上产生冷凝水，同时避免因温度变化导致的失焦现象。
  2. 将培养板置于载物台上，使用明场或相差显微镜对细胞进行聚焦。
  3. 选择96孔板作为板型设置。选择通道设置。
    注意：FITC 的最大激发和发射波长分别为 495 nm 和 519 nm；HCS 橙色细胞染料分别为 556 nm 和 572 nm。可根据显微镜所配备的滤光片选择其他荧光染料。
  4. 选择设置为平铺模式。指定要采集的图像数量。
    注意：拼接功能可用于捕获样本孔中的多个位置，可设置为以拼接或随机模式采集图像。我们每孔采集了10个随机区域的图像。
  5. 将采集模式更改为“black” & 白色”或“单色”且合并像素 ≥ 2x2。
    注意：将 binning 从 1x1 设置为 2x2 或 4x4 可提高显微镜成像速度，但会导致图像分辨率降低。对于 OAA 检测而言，使用这些设置已足够，因为该实验需同时计数巨噬细胞和黏附的细菌。
  6. 打开自动对焦或聚焦模块，设置自动对焦功能的执行频率。若设备支持，开启Z轴层扫功能，并设置Z轴层扫数量，以完整捕获细胞单层及附着杆菌的厚度。
    注意：选择的Z轴层扫描数量越多，显微成像时间越长，但可确保在每个Z轴层均获得聚焦正确的图像。
  7. 指定一个文件夹用于保存图像。运行自动成像程序。

8. 数据收集与分析

  1. 计数每张图像中贴壁的杆菌数量和哺乳动物细胞数量。每条杆菌链计为一个细菌。
  2. 将阳性对照试验血清的杆菌/细胞数与滴度（例如，1:10 稀释对应 10 个滴度单位）绘制成标准曲线，使用合适的统计学软件进行分析。
  3. 采用非线性回归曲线拟合方法分析阳性对照试验血清。然后利用该阳性对照试验血清的标准曲线分析其余样本，以确定相应的滴度。
    注意：在确定滴度时，通常选择标准曲线中段附近的样本稀释度最为准确。
  4. 计算每个疫苗组样本的几何平均值。对经对数转换后的滴度值采用最小显著差异法进行单因素方差分析（ANOVA），计算 P 值。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本部分展示了在OAA实验期间采集的代表性显微图像，以及表明OAA可用于研究抗体生物学功能的结果。此处，该检测成功用于评估一种炭疽疫苗候选物的有效性。验证芽孢杆菌的荚膜包裹状态至关重要，因为极少或无荚膜包裹会导致其黏附于宿主细胞，从而产生较高的背景信号。图1为经印度墨汁负染色后观察B. anthracis Ames荚膜的图像。OAA需要对多个相邻视野进行照明，若使用共聚焦显微镜，则需采集多个焦平面或切片图像。因此，必须确认芽孢杆菌的荧光信号既不过弱，也不会过快发生光漂白。图2为用FITC标记的芽孢杆菌图像。图3展示了B. anthracis Ames附着于细胞单层的最大投影图像。这些为OAA计数与评分所依据的代表性视野。与PGGA-OMPC抗血清共同孵育的芽孢杆菌附着增加，是由于抗荚膜抗体的存在，这些抗体对芽孢杆菌起到了调理作用。图4显示，接种10 µg和50 µg ...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

基于荚膜的疫苗已被证明对多种细菌病原体具有有效性，且其中许多已获准用于人类25,26,27这些疫苗通过诱导产生靶向荚膜的抗体发挥作用，许多此类研究采用OPKA来展示抗体的调理吞噬功能。13,14,16,28,29由于生物安全方面的考虑以及为了便于操作，我们开发了一种OAA，用于评估接种疫苗动物所产生的抗体 B. anthracis 荚膜结合物。荚膜的存在表明 B. anthracis 防止黏附和吞噬作用30，但用疫苗接种动物的血清对杆菌进行调理可诱...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者不存在可能构成利益冲突的商业或其他关联。

致谢

J. Chua、D. Chabot 和 A. Friedlander 设计了本文所述的实验方案。J. Chua 和 T. Putmon-Taylor 进行了实验操作。D. Chabot 完成了数据分析。J. Chua 撰写了本文。

作者感谢 Kyle J. Fitts 提供出色的技术支持。

本工作由国防威胁降低局资助，资助编号为 CBM.VAXBT.03.10.RD.015，计划编号 921175。

观点、解释、结论和建议均为作者个人观点，不一定代表美国陆军的立场。本出版物的内容不一定反映国防部的观点或政策，提及的商标名称、商业产品或组织并不意味着得到美国政府的认可。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.20 µm 注射器滤器（25 mm，再生纤维素）康宁，纽约州康宁市431222
10 mL 注射器（鲁尔锁扣式针头）BD，美国新泽西州富兰克林湖302995
15µ 96孔黑色培养板（成像用1号板）In Vitro Scientific，加利福尼亚州森尼韦尔P96-1-N
16% 多聚甲醛电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德15710
75 cm² 组织培养处理过的培养瓶康宁，纽约州，康宁430641
琼脂（粉末）Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯A1296
幼兔补体Cedarlane Labs，北卡罗来纳州伯灵顿CL3441
酵母提取物（Bacto）BD，Sparks，医学博士288620
BBL 脑心浸液（BHI）BD，Sparks 博士211059
血琼脂（含羊血的TSA）平板Remel，Lenexa，KSR01198
细胞刮刀Sarstedt，牛顿，北卡罗来纳州83.183
Costar 96 孔细胞培养板（板 #2 &以及用于稀释的3号管康宁，纽约州，美国3596
盖玻片电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德72200-10
Difco 营养肉汤BD，Sparks，MD234000
高糖型杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆11965-092含 4500 mg/L 葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺、酚红
EVOS FL Auto 细胞成像系统（荧光显微镜）Life Technologies，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆AMAFD1000
胎牛血清Hyclone，GE Healthcare Life Sciences，美国犹他州南洛根SH30071.03未经γ射线照射，未经热灭活
异硫氰酸荧光素Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆F143
HCS Cell Mask Orange 细胞染料Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆H32713
血细胞计数板（改良型纽鲍尔）Hausser Scientific，宾夕法尼亚州霍舍姆3900
印度墨水溶液BD，Sparks，医学博士261194
L-谷氨酰胺（200 mM）Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham MA25030081在培养基中补充额外的 2 mM L-谷氨酰胺
尼康Eclipse TE2000-U（倒置复合显微镜）尼康仪器公司，美国纽约州梅尔维尔TE2000
不含钙和镁的 PBSLonza，美国马里兰州沃克维尔17-516F
青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩Hyclone，GE Healthcare Life Sciences，美国犹他州南洛根SV30010
培养皿（100 × 15 mm）Falcon，康宁，北卡罗来纳州德罕351029用于琼脂平板
RAW 264.7 巨噬细胞系（Tib47）ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯ATCC TIB-71
载玻片VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州16004-422
碳酸氢钠Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯S5761
台盼蓝溶液（0.4%）Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯T8154
蔡司700激光扫描显微镜（共聚焦显微镜）卡尔·蔡司显微成像公司，美国纽约州桑伍德4109001865956000

参考文献

  1. Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
  2. Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144(1883).
  3. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
  4. Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  5. Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
  7. Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
  8. Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
  9. Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
  10. Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
  11. Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
  12. Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
  13. Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
  14. Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
  15. Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
  16. Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
  17. List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
  18. Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
  19. Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
  20. Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
  21. Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
  22. Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
  23. Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
  24. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  25. Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
  26. Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
  27. Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
  28. Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
  29. Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400(2019).
  30. Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250(1999).
  31. Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
  32. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  33. Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
  34. Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
  35. Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
  36. Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
  37. Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
  38. Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

RAW 264.7 细胞荧光显微镜FITC 标记补体调理作用自动成像包封验证无菌检测疫苗效力
用于评估疫苗研发中功能性抗体的调理-黏附试验 炭疽杆菌 及其他包封病原体
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。