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方法文章

在哺乳动物细胞中构建细胞内蛋白质传感器

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⸱

DOI：

10.3791/60878

⸱

2020年4月28日

 ,  ,  , 
1Istituto Italiano di Tecnologia, 2Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

本文内容

摘要

本文介绍了一种构建基因编码的细胞内蛋白质传感器-效应器的实验方案。该装置通过细胞内抗体（intrabody）特异性地检测目标蛋白质，并通过启动基因转录输出作出响应。本研究建立了一个通用框架，可快速替换intrabody，从而实现对任意目标蛋白质的快速检测，且无需改变整体结构设计。

摘要

蛋白质可作为神经退行性疾病、感染或代谢综合征等病理状况的生物标志物。通过改造细胞以感知并响应这些生物标志物，有助于理解疾病背后的分子机制，并推动新型细胞疗法的开发。尽管已有多种检测细胞外蛋白质的系统被开发出来，但此前尚缺乏一种可模块化设计、易于重新改造以感知不同细胞内蛋白质的通用框架。

本文介绍了一种用于构建模块化遗传平台的实验方案，该平台可感知细胞内蛋白质并激活特定的细胞反应。该装置利用细胞内抗体或小肽高特异性地识别目标蛋白，并通过基于TEV蛋白酶（TEVp）的激活模块，触发输出基因的转录激活。TEVp是一种病毒蛋白酶，能够特异性切割其同源短肽，在生物技术和合成生物学中广泛应用，因其对切割位点具有高度正交性。具体而言，我们设计了可识别并响应病毒性感染和遗传性疾病相关蛋白生物标志物的装置，包括突变型亨廷顿蛋白（huntingtin）、NS3丝氨酸蛋白酶以及Tat和Nef蛋白，分别用于检测亨廷顿病、丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）感染。重要的是，该系统可根据所需输入-输出功能进行定制，例如采用荧光信号输出用于生物传感器，促进抗原呈递以激活免疫反应，或启动细胞凋亡以清除异常细胞。

引言

通过可控的工程化基因回路来研究和调控细胞反应，是合成生物学的主要目标1,2,3，旨在开发具有潜在生物学或医学应用前景的工具，应用于癌症4、感染5,  代谢性疾病6以及免疫学7等领域。

针对特定信号重新编程细胞功能需要设计智能界面，将对细胞外或细胞内动态变化（输入）的感知与下游处理过程相连接，从而触发特定输出，用于诊断目的（例如报告基因）或重编程细胞反应（治疗）。传感模块所检测的输入信号可以是小分子分析物8、蛋白质9,10,11 或微小RNA（microRNA）11,12,13，这些分子与疾病的发生或进展密切相关。此外，通过多输入信息的整合处理可实现复杂的电路调控，从而在特定条件下更精确地控制转基因的表达水平14,15,16。例如，基于microRNA的传感器可识别特定类型的细胞（如癌细胞），并通过表达促凋亡基因诱导其清除13。由于microRNA可模块化地便捷整合至合成回路中，因此已成为基因编码型生物传感器中广泛使用的输入信号12,13,17。蛋白质也是遗传突变、癌症和感染的重要生物标志物，已有多种可感知细胞外蛋白质的装置被报道18,19。

许多检测细胞外蛋白的电路依赖于使用经过改造的受体，该受体将转录因子（TF）锚定在膜上，并融合了TEV蛋白酶响应性切割位点（TCS）。TEV蛋白酶（TEVp）的一个主要优势在于其切割的高度特异性，并且不会干扰内源性蛋白质的加工过程。在这些系统中，TEVp与第二种肽段融合，当细胞外分子结合时，该肽段可与工程化受体发生相互作用。因此，外部输入信号会诱导TEVp介导的切割，从而释放转录因子。采用此类机制运行的系统包括Tango/TEVp18, 光诱导系统20 以及模块化细胞外传感器架构（MESA）19。尽管在检测细胞外蛋白方面已取得进展，但以模块化方式感应细胞内蛋白的技术此前一直未能实现，其局限性在于为响应特定蛋白而开发单个装置时，必须经历大量构建与测试的迭代过程。

我们的系统是首个用于细胞内蛋白质检测的平台21。该系统的模块化设计通过使用特异性识别目标蛋白的胞内抗体（intrabody）来实现，而细胞重编程则由TEV蛋白酶（TEVp）介导。具体而言，一种胞内抗体锚定于细胞膜上，并在其C末端融合了荧光蛋白mKate、跨膜结构域（TCS）和转录因子（TF）（融合蛋白1）；第二种胞内抗体则与TEVp融合，定位于细胞质中（融合蛋白2）（图1）。

因此，两种胞内抗体与靶蛋白在细胞质中的相互作用可导致TEVp对TCS的切割，从而促使转录因子（TF）转位至细胞核内，激活功能性输出。该感应—效应装置已成功用于检测四种细胞内疾病特异性蛋白：丙型肝炎病毒（HCV）表达的NS3丝氨酸蛋白酶22、HIV感染产生的Tat和Nef蛋白23,24，以及亨廷顿病相关的突变型亨廷顿蛋白（mutated huntingtin, HTT）25。输出表达包括荧光报告基因、促凋亡基因（hBax）26 以及免疫调节因子（XCL-1）27。我们证明，该系统还可干扰其靶蛋白的病理功能。例如，响应Nef蛋白的装置可通过结合靶蛋白，阻止病毒感染的扩散，并逆转感染T细胞表面HLA-I受体的下调24。所描述的感应—效应平台是首个用于检测细胞内蛋白的此类系统，未来有望应用于异常蛋白表达、翻译后修饰或表观遗传修饰的检测，在诊断和治疗中具有潜在用途20。

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方案

1. 传感器-执行器装置构建与测试的设计原则

  1. 选择一个目标蛋白。
    注意：我们设计的系统适用于位于细胞质中或在细胞质与其他区室之间穿梭的蛋白质。
  2. 选择两种可结合目标蛋白不同表位的胞内抗体。在本研究中，我们选择了已有现成且经过验证的胞内抗体的蛋白质28,29,30,31。若无可用的胞内抗体，则需新开发。
    注意：除胞内抗体外，也可使用其他能与目标蛋白相互作用的分子。例如，Nef 检测装置包含一个胞内抗体（sdAb19）和 p59fyn 蛋白酪氨酸激酶的 SH3 结构域32。
  3. 在计算机中设计编码融合蛋白的质粒DNA序列。
    注意：质粒设计软件可免费获取或购买。
    1. 生成包含以下模块的序列：融合蛋白1 包含膜定位标签、荧光标记（例如 mKate）、胞内抗体、TEV切割位点（TCS）和转录因子（TF）；融合蛋白2 包含胞内抗体和TEV蛋白酶（TEVp）。
      注意：基于多个组分相互作用构建新结构时，需关注可能在检测到目标蛋白时最大化信号激活的参数。具体而言，我们重点关注了TEVp的活性以及嵌合蛋白的柔性，以促进蛋白-蛋白相互作用（表1）。所有这些特征将在以下各点中详细说明。
    2. 在胞内抗体–TCS 和/或 TEVp–胞内抗体之间插入一段柔性甘氨酸-丝氨酸连接区（LD）。LD的长度可变（0、10或15个氨基酸-AA）。
    3. 融合蛋白1：设计包含高亲和力TCS（S）或低亲和力TCS（L）的变体，以调控TEVp的切割活性。该构建体的表达由组成型启动子驱动。在TCS的C末端包含GAL4VP16转录因子，以便在TEVp切割后转入细胞核。
      注意：我们使用了hEF1a启动子，但也可选择其他组成型启动子。
    4. 融合蛋白2：使用组成型（hEF1a）或强力霉素诱导型（pTET）启动子来调控TEVp的转录。使用由小分子保护剂调控的降解结构域（DD）来调节蛋白稳定性。
      注意：其他可调控蛋白表达的诱导系统也可被选用。
    5. 输出部分：在UAS启动子下游放置一个响应GAL4VP16转录因子的报告基因。根据装置的应用选择输出信号（例如荧光蛋白、细胞因子等）。
  4. 采用任意偏好的克隆策略进行克隆。本研究中，我们使用Golden Gate或Gateway技术构建质粒。
  5. 通过瞬时转染在目标细胞系中测试装置的各种构型。将编码融合蛋白1和2的质粒以及荧光报告基因（如UAS-EYFP）共转染至细胞中。融合蛋白1包含一个红色荧光蛋白（mkate），用作转染标记。
    注意：可先使用易于转染的细胞系（如HEK293FT细胞）测试装置。
    1. HEK293FT细胞转染：将2 × 105个细胞以500 µL DMEM培养基接种于24孔板中。使用转染试剂将300 ng总DNA转染细胞，涡旋混匀后室温孵育20分钟。
      1. 将细胞置于37 °C/5% CO2培养箱中。转染24小时后更换新鲜培养基。
    2. Jurkat细胞转染：在24孔板中使用3 × 105个细胞，加入500 µL RPMI培养基。按照制造商说明进行电穿孔。每个样品使用2–4 µg总DNA。转染24小时后加入500 µL新鲜细胞培养基。
      1. 电穿孔过程中，将细胞与DNA混合物置于冰上。随后将细胞放入37 °C/5% CO2培养箱中。
        注意：可根据装置的具体应用选择不同的细胞系和转染方法。
  6. 获取显微镜图像，以定性评估装置的功能性。通过检测荧光信号（mkate）是否位于细胞膜附近，确认融合蛋白1的膜定位。在存在或不存在目标蛋白（阴性对照-NC）的情况下观察荧光输出信号（EYFP）。
    1. 使用配备Tx Red和GFP滤光片的细胞成像系统检测mKate和EYFP荧光蛋白。使用10x或20x物镜。
      注意：使用未转染的细胞以确保无自发荧光。
  7. 通过流式细胞术（FACS）分析转染效率。
    注意：样品制备详见方案2。
    1. 在存在目标蛋白的情况下评估装置性能。建立实验矩阵，组合融合蛋白1和2的不同变体，并通过以下方式调控TEVp：(i) 组成型hEf1a启动子，(ii) 强力霉素诱导型TET启动子，(iii) 保护剂以调节蛋白稳定性。加入不同浓度（0–1000 nM）的强力霉素和保护剂。
    2. 进行FACS分析，比较有无目标蛋白时EYFP的诱导倍数。
      注意：最高的诱导倍数对应于“开启”状态（存在目标蛋白）相对于“关闭”状态（无目标蛋白）的最大输入灵敏度。
  8. 根据预期应用测试装置的功能性。
    1. 进行FACS分析以测量输出蛋白水平、细胞凋亡或其他相关指标。
    2. 若装置的输出部分调控目标基因的表达水平，则进行RT-PCR分析。以看家基因（GAPDH或等效基因）为参照，计算2-ddCT，并比较“开启” 和“关闭”模式下输出表达的倍数变化。

2. 流式细胞术分析的样品制备

  1. 转染后48小时，使用流式细胞仪（FACS）对蛋白质器件进行定量分析。
    1. 吸除DMEM培养基，用300 µL PBS洗涤HEK293FT细胞。加入100 µL胰蛋白酶，置于37 °C/5% CO2培养箱中孵育2–4分钟。
      注意：Jurkat细胞无需使用胰蛋白酶。
    2. 加入400 µL不含酚红的DMEM培养基，重悬细胞以避免形成团块，转移至FACS管中。
    3. 使用配备405 nm、488 nm和561 nm激光器的流式细胞仪。
    4. 根据以下仪器设置，从活细胞群体中采集30,000–100,000个事件：EYFP/EGFP检测使用488 nm激光器和530/30 nm带通滤光片，mKate检测使用561 nm激光器和610/20 nm滤光片，EBFP检测使用405 nm激光器和450/50滤光片。
      注意：流式细胞仪设置时，应包括未转染细胞以及转染单一荧光蛋白的细胞作为对照。
    5. 使用首选软件（例如DIVA软件、Flowjo或TASBE33 方法）对采集的样本进行分析。

3. HCV 传感器-驱动装置的表征

  1. 选择检测 NS3 蛋白的胞内抗体。scFv35 和 scFv162 可结合两个不同的表位，因此被选中。
  2. 根据步骤 1.3 中所述原理，设计并测试 NS3 响应装置的变体（例如：融合蛋白 1：膜标签、mKate、单链片段胞内抗体 scFv35、LD0、TCS-L 和转录因子 GAL4VP16；融合蛋白 2：单链片段胞内抗体 scFv162、LD0 和 TEV 蛋白酶；输出：UAS-EYFP 或 UAS-hBax（凋亡）；NS3（参见 表 2））。
  3. 在 HEK293FT 细胞中测试构建体。
    注意：每次实验均需设置阴性对照，即在无目标蛋白的情况下递送装置并进行输出定量。
    1. 在有或无 NS3 的情况下，测试组成型启动子驱动 TEV 蛋白酶的装置。按照步骤 1.5.1 所述方法，在 HEK293FT 细胞中转染融合蛋白 1（步骤 1.3.3）、融合蛋白 2（步骤 1.3.4）和 EYFP 输出（步骤 1.3.5）。转染后 48 小时，通过流式细胞术（方案 2）检测荧光报告蛋白（EYFP）以分析样品。
    2. 利用 BFP-NS3 融合蛋白，通过 mKate 与 BFP 的共定位评估胞内抗体与 NS3 的相互作用。将包含 mKate 的融合蛋白 1 与 BFP-NS3 共转染细胞。转染后 48 小时，使用共聚焦显微镜（63 倍物镜）观察细胞，检测荧光蛋白的共定位情况。
      注意：使用未与 NS3 融合的 BFP 作为阴性对照。在此条件下，BFP 应呈现弥散的细胞定位，且不与膜结合的 mKate 共定位。
    3. 在有或无 NS3 的情况下，测试由 pTET 启动子驱动 TEV 蛋白酶的装置。比较有无 NS3 时 EYFP 的表达水平。按照步骤 1.5.1 所述方法，将融合蛋白 1（步骤 1.3.3）、融合蛋白 2（步骤 1.3.4）和 EYFP 输出（步骤 1.3.5）共转染细胞。转染在有或无 NS3 的条件下进行。转染后 48 小时，通过流式细胞术（方案 2）检测荧光报告蛋白（EYFP）以分析样品。
  4. 测试由 NS3 装置介导的细胞杀伤。
    1. 将 EYFP 输出替换为促凋亡基因 hBax。
    2. 重复步骤 3.3.3。转染后 48 小时收集细胞，用 PBS 洗涤后开始检测。
    3. 使用 Pacific Blue 标记的 Annexin V 进行凋亡检测。将细胞与凋亡标志物 Annexin V（用结合缓冲液稀释，Pacific Blue 标记物用量为 2.5 µL，体积比 1:20）在室温下孵育 10 分钟进行染色。
    4. 通过流式细胞术分析细胞。根据 Pacific Blue（Annexin V）阳性细胞数量计算群体中的凋亡水平。

4. Nef响应性HIV传感器-驱动装置的表征

  1. 选择能够结合 Nef 的胞内抗体。选择单结构域胞内抗体 sdAb19 和 SH3，因为它们结合于不同的表位。
    注意：SH3 并非胞内抗体，而是 p59fyn 蛋白酪氨酸 激酶的一个结构域，该结构域在生理条件下可与 Nef 相互作用。
  2. 根据步骤 1.3 中所述原理设计并测试 Nef 响应装置的变体（例如：融合蛋白 1：膜定位标签、mKate、sdAb19、LD0、TCS-L 和 GAL4-VP16；融合蛋白 2：SH3、LD0 和 TEVp；输出信号：UAS-EYFP；Nef（见 表 3））。
  3. 在 HEK293FT 和 Jurkat T 细胞中测试这些装置。
    注意：每次实验均设置阴性对照，即在无目标蛋白存在的情况下递送检测装置并进行输出信号的定量。
    1. HEK293FT 细胞转染：按照步骤 1.5.1 所述程序进行，有或无 Nef 表达。
    2. Jurkat T 细胞转染：按照步骤 1.5.2 所述程序进行，有或无 Nef 表达。
    3. 转染后 48 小时，按照方案 2 所述方法使用流式细胞仪分析样品。
  4. 用 HIV LAI 毒株感染 Jurkat 细胞以检测 HIV。
    1. 至少在实验前 48 小时制备病毒储备液。使用 HEK-293T 细胞转染传染性分子克隆（NIH AIDS 试剂项目）并按照制造商说明使用商业试剂获得病毒。在 40 小时后通过超速离心（64,074 × g，4°C，1 小时）在 20% 蔗糖上浓缩病毒，以避免病毒颗粒中混入游离蛋白。使用 HIV-1 p24 ELISA 测定病毒滴度。
    2. 使用含 500 ng p24 接种量的 HIV-1 毒株感染细胞。感染后 40 小时，通过 KC57-FITC 标记抗体检测病毒蛋白 p24，并进行流式细胞术分析，以定量感染细胞的比例。
    3. 使用 AlexaFluor 647 标记的 W6/32 单克隆抗体对 HLA-A、B、C 进行细胞染色。固定细胞后在流式细胞仪上分析。检测在有或无蛋白传感器装置存在时，Nef 介导的 Jurkat T 细胞中 HLA-I 的下调情况。

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结果

一种用于模块化细胞内蛋白质检测的架构
如图1所示，该装置由以下部分组成：1）与膜锚定荧光标记（mKate）和TEVp切割位点（TCS）相连的胞内抗体1，其后接转录激活因子GAL4VP16（TF）；2）与TEV蛋白酶（TEVp）融合、游离于细胞质中的胞内抗体2；3）一个可响应GAL4VP16的合成启动子，用于驱动报告基因的表达。该系统的模块化特性由胞内抗体保证，后者可像“即插即用”一样更换，以靶向任意目标蛋白。此外，输出信号也可根据具体应用需求进行选择。为优化传感-响应性能，一个关键方面是避免系统在无目标蛋白时的背景激活。因此，我们对装置的多个特性进行了优化（表1）。

HCV、亨廷顿蛋白和 HIV 传感器-执行器装置
首个装置被设计用于识别丙型肝炎病毒（HCV）表达的 NS3 蛋白29。该传感器的研究为后续装置的设计奠定了基础。具体而言，我们将 NS3 响应型装...

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讨论

直到最近，基于细胞内环境对细胞进行检测仍依赖于为特定靶标从头开发的系统。本方案描述了最新的细胞工程方法的一个实例，该方法在一个装置中实现了蛋白质的检测与调控，并可快速适配于新的目标生物标志物。

该开创性系统可感知细胞内蛋白质，并提供特定输出以检测或中和疾病。这类基因回路的优势在于胞内抗体所提供的模块化特性，以及能够使用其他传感“元件”来靶向目标蛋白质，正如Nef传感器所示。据我们所知，此前从未有系统被证明可潜在应用于多种细胞内蛋白质。

模块化结构使得研究人员能够调整组件，以针对任何特定应用最大化设备的开启/关闭比率。这表明必须对设备进行仔细测试，以实现最佳功能性能。通常情况下，我们观察到缺少连接域（LD0）时设备功能更有效，这或许可作为新型蛋白质检测设备的首要设计策略。这可能是由于在此设备构型中，目标蛋白质、胞内抗体和TEV蛋白酶之间存在最佳的物理相互作用35。

关于致动模块，我们发现TEVp的表达水平、对其切割位点的亲和力...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由意大利技术研究院资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AlexaFluor 647 小鼠抗人 HLA-A, B, C 抗体克隆 W6/32Biolegend311414抗体
Annexin VLifeTechnologiesA35122凋亡标志物
AttracteneQiagen301005转染试剂
BD Falcon 圆底管BD Biosciences352053FACS 管
强力霉素Clonetech-细胞培养：药物
DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）Cellgro10-013-CM细胞培养：培养基
Evos 细胞成像系统Life TechnologyEVOS M5000成像系统；感染性分子克隆
FACSDiva8 软件BD Biosciences659523FACS 软件
Fast SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612qPCR 反应
FBS（胎牛血清）Atlanta BIOS11050细胞培养：培养基
Gateway 系统Life Technologies-质粒构建
Golden Gate 系统in-house-质粒构建
HEK 293FTInvitrogenR70007细胞培养：细胞
Infusion 克隆系统Clonetech638920质粒构建
JetPRIME 试剂Polyplus transfection114-15转染试剂
Jurkat 细胞ATCCTIB-152细胞培养：细胞
L-谷氨酰胺Sigma-AldrichG7513-100ML细胞培养：培养基
Lipofectamine LTX 加 Plus 试剂Thermo Fisher Scientific15338030转染试剂
LSR Fortessa 流式细胞仪（405、488 和 561 nm 激光器）BD Biosciences649225流式细胞仪
MicroAmp 快速光学 96 孔反应板（0.1 mL）ThermoFisher Scientific4346907qPCR 反应
Neon 转染系统Life TechnologiesMPK10025转染试剂
非必需氨基酸HyCloneSH3023801细胞培养：培养基
Opti-MEM I 低血清培养基Life Technologies31985070转染培养基
青霉素/链霉素Sigma-AldrichP4458-100ML细胞培养：培养基
QuantiTect 反转录试剂盒Qiagen205313反转录酶试剂盒
RNeasy Mini 试剂盒Qiagen74106RNA 提取试剂盒
RPMI-1640ATCCATCC 30­2001细胞培养：培养基
ShieldClonetech632189细胞培养：药物
SpheroTech RCP-30-5-A 微球SpherotechRCP-30- 5A-2补偿设置
StepOnePlus 7500 Fast 仪器Applied Biosystems4351106qPCR 反应

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