用于测试（新）辅助疗法的不完全切除软组织肉瘤的小鼠模型

Summary

在该协议中，我们描述了一个小鼠模型，不完整的手术切除软组织肉瘤测试（新）辅助疗法。

Abstract

手术通常是许多实体肿瘤的第一次治疗。然而，局部复发经常发生在原发性肿瘤切除后，尽管辅助或新佐剂疗法。当手术边缘不足无肿瘤，导致残余癌细胞时，将发生这种情况。从生物学和免疫学的角度来看，手术不是一个空事件;伤口愈合环境已知能诱导亲肿瘤和抗肿瘤通路。因此，旨在预防局部复发的药物开发临床前模型在测试新的（新）辅助疗法时应纳入手术切除，以模拟接受手术治疗的患者的临床设置。

在这里，我们描述了一个小鼠模型不完全手术切除的 WEHI 164 软组织肉瘤，允许测试（新）辅助疗法在伤口愈合反应的设置。在此模型中，50% 或 75% 的肿瘤被切除，留下一些原位癌组织，在临床环境中模拟手术后的粗残病。此模型允许在手术环境中测试疗法，同时考虑伤口愈合反应，这可能会影响（新）辅助治疗的疗效。不完全的手术切除导致肿瘤在没有辅助治疗的情况下在所有小鼠中可重现。带检查点封锁的辅助治疗可减少肿瘤再生。因此，该模型适用于在脱毛手术及其相关的伤口愈合反应的背景下测试疗法，并可以扩展到其他类型的固体癌症。

Introduction

手术仍然是许多实体肿瘤¹的主要治疗选择，包括软组织肉瘤^2，3。2,尽管癌症手术技术有所改善，并结合（新）辅助疗法，在原发性肿瘤切除^4，5,后癌症复发和转移的风险^仍然很高。在软组织肉瘤中，复发特别多发，在手术现场，导致发病率和死亡率增加。在临床环境中，可能很难获得足够宽的边距（例如，由于解剖限制），导致不完全切除和随后的肿瘤复发⁶。手术压力和随后的伤口愈合过程已知创造一个免疫抑制肿瘤微环境有利于肿瘤复发^7,7，8。因此，软组织肉瘤，特别是免疫疗法的新疗法的发现和发展，最好考虑手术伤口愈合反应。

大多数临床前研究佐剂疗法最初使用皮下合成或异种移植小鼠模型，没有纳入手术压力和伤口愈合反应^9,9，10。因此，我们开发了一个合成皮下小鼠软组织肉瘤模型，结合了不完整的手术切除。WEHI 164纤维肉瘤细胞在皮下接种，一旦肿瘤建立，我们去除50-75%的肿瘤体积（图1A-E）。肿瘤不断从剩余的肿瘤重新生长。此模型允许测试辅助疗法，同时考虑手术压力和伤口愈合的效果。多个小组在多项研究中都使用了类似的手术模型，发现这些模型可重复有效，^{包括11、12、13。,12,13}在这里，我们提供了此协议的详细说明。

Protocol

这些实验中使用的动物是从动物资源中心（西澳大利亚州珀斯）获得的。在Har harryPerkins医学研究所生物资源北设施（西澳大利亚州珀斯）的条件下饲养动物。所有实验都是按照哈利·帕金斯医学研究所动物伦理委员会批准的议定书进行的。在这些实验中使用了8-12周大的BALB/c小鼠。WEHI 164 纤维瘤细胞系来自澳大利亚细胞银行（新南威尔士州韦斯特米德）。

1. 细胞接种

1. 细胞和动物的制备
   1. 确保在推荐的介质中维护单元系。例如，在罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）保持 WEHI 164 细胞系（RPMI） 1640 中，辅以 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎儿牛血清、20 mM HEPES、0.05 mM 2-甲氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。
      注:从低温储存中去除后，通道细胞至少3次，最多5次。为了确保最佳的细胞生存能力，当细胞在70-80%的汇合之间时，应进行分裂。肿瘤细胞系应测试支原体，因为感染可以改变细胞生长，影响体内的免疫反应。
   2. 接种前一天，用剪子剃右下侧的小鼠。
      注:本实验使用了正常体重（16-22克）的8-12周龄为8-12周的雌性BALB/c小鼠。
   3. 在接种当天，收获 WEHI 164 细胞时，70-80% 的汇合通过三脑子炎。
      1. 从组织培养瓶中吸出培养基，然后加入无菌磷酸盐缓冲溶液（1x PBS），去除胎儿牛血清（FBS）的剩余痕迹。
      2. 从组织培养瓶中吸出 PBS。加入 3 mL 的 0.05% trypsin （对于 T75 烧瓶）， 然后旋转烧瓶， 使带细胞的烧瓶的整个表面被 trypsin 覆盖。
      3. 在37°C下孵育烧瓶，5%CO₂培养箱3分钟。通过敲击烧瓶的两侧，检查细胞是否脱落，定期检查细胞。
      4. 从细胞培养箱中取出烧瓶，并添加 5 mL 的介质，辅以 FBS，以中和尝试性。
         注:不要将细胞留在尝试性中的时间超过必要的时间，因为这样会损害细胞并导致细胞活力低。
      5. 多次移液悬浮液，获得单个单元悬浮液。将电池悬浮液转移到锥形离心管。
      6. 在350 x g下旋转3分钟，使细胞产生颗粒。
   4. 在1x PBS中清洗细胞三次。
      1. 在50 mL的无菌1x PBS中重新悬浮细胞，通过移液细胞悬浮上下清洗细胞。在350 x g下旋转3分钟，使细胞产生颗粒。
      2. 在15 mL无菌1xPBS中吸升和再增殖细胞。通过移液细胞悬浮液上下冲洗细胞。在350 x g下旋转3分钟，使细胞产生颗粒。
      3. 在正好 10 mL 的无菌 1x PBS 中吸升和重新暂停的细胞。如步骤 1.1.4.2 中一样清洗细胞，将少量（约 100 μL）的细胞悬浮液转移到离心管进行计数。在350 x g下旋转3分钟，使细胞产生颗粒。
   5. 使用 Trypan 蓝色排除方法使用血细胞计或自动细胞计数器确定细胞号。在无菌1x PBS中以5 x 10^{6 6细胞/mL}的浓度重新发送细胞。将细胞悬浮在冰上。
      注:肿瘤细胞的生存能力应等于或超过80%，以确保肿瘤生长可重复。
2. 皮下接种
   1. 将细胞悬浮液彻底混合，在无菌 1x PBS 中用 26 G 针头填充注射器，并填充 100 μL 的细胞悬浮液（5 x 10⁵细胞）。在加载下一个注射器之前重复混合细胞。
      注:在整个过程中保持细胞在冰上，以保持生存能力。
   2. 适当限制鼠标，确保进入右下侧。在剃光的右下侧侧下皮接种小鼠。
      注:通过稍微抬起针头，确保接种不在佩罗酮中，针应在皮肤下可见。接种后，皮肤下应形成气泡状肿块。
   3. 根据适用的道德批准要求监测小鼠，当肿瘤长到约50 mm²时进行手术切除。

2. 肿瘤部分手术切除

注:此协议需要两名研究人员;一个用于外科手术（SURGEON），另一个用于小鼠监测（助手）。

1. 手术设置
   1. 在接种后的第12天，当肿瘤达到约50毫米²的大小时，在手术前30分钟，在颈部擦伤时，用100μL（0.1毫克/千克）的丁丙诺啡s.c.给小鼠服用剂量。
   2. 设置手术区与热垫覆盖长凳外套，并设置一个鼻锥麻醉。使用前对手术工具进行消毒，并在每个动物之间使用热珠消毒器，使工具在使用前冷却。有以下手术设备清洁，触手可及:氯己丁，拭子，纱布，眼凝胶，两个弯曲的钳子，剪刀，夹子施用器，夹子去除剂，夹子填充（图2A，2B）。
   3. 将加热室加热至37°C，并设置另一个加热垫进行恢复（图2C）。将灭菌工具放在无菌表面上，如自洗垫。
2. 麻醉
   1. 将鼠标放在感应室中，用 4% 异氟兰（100% 氧气中的 4%在 1 L/min 的流速下）麻醉小鼠，直到呼吸速率减慢到每分钟约 60 次呼吸（1 分钟）（这通常需要 <1 分钟）。
      注:不要将鼠标留在室内太久，因为这可能导致窒息和死亡。一次只有一只老鼠麻醉。
   2. 将鼠标转移到手术台上的热垫上，将鼻子上的鼠标放在鼻锥中，在 0.5 L/min 的流量下，用 3-4% 异氟兰保持麻醉状态。监测呼吸速率，确保麻醉深度保持。
      注:助手必须在整个手术过程中监测小鼠的呼吸，以确保保持正确的麻醉水平。如果呼吸太慢，降低麻醉浓度，如果麻醉深度太浅，就会增加麻醉浓度。如果鼠标开始喘气，请将鼠标从鼻锥中取出，降低麻醉浓度，并等待呼吸恢复正常，然后再放在鼻锥上。
   3. 执行"捏测试"和"角反射测试^"14，以确保小鼠在开始手术前完全麻醉。
      注:鼠标任何部分的移动表明鼠标未完全麻醉。动物应该立即通过增加麻醉浓度来给予额外的麻醉剂。
   4. 用少量的眼部凝胶盖住老鼠的眼睛，以避免眼睛干燥。
3. 外科手术（SURGEON）
   1. 用酒精氯己丁擦拭手术区3次。使用钳子和一把剪刀，沿着后侧做一个1厘米的直切口，离肿瘤3毫米（图3A，3B）。
      注:将每只小鼠的切口标准化为 1 厘米（使用标尺），可以甚至评估小鼠之间的伤口愈合。将切口定位在离肿瘤 3 mm 的地方，可以进行随后的肿瘤内辅助治疗，而不会从伤口中渗漏。
   2. 使用钳子，拉开肿瘤和内皮之间的筋膜和皮下脂肪组织。皮下肿瘤通常附着在皮肤侧。
   3. 打开伤口，用钳子轻轻握住肿瘤轴承侧的皮肤，并"反转"肿瘤，使肿瘤在肿瘤外可见（图3C，3D）。
      注:要切除的肿瘤部分应最接近开口，有足够的皮肤来关闭伤口。切除肿瘤时，注意不要割皮。
   4. 用一把剪刀，从肿瘤胶囊的一半切开，从肿瘤底部最接近开口开始。
   5. 对于50%的脱布手术，切过肿瘤的中间。使用弯曲钳子，挖出要切除的肿瘤部分（50%）;从脱骨区域挖出任何残留物。
   6. 对于 75% 的脱布，执行 50% 的肿瘤脱布，如上文第 2.3.5 部分所示。然后切入剩余的50%的肿瘤的一半，并挖出25%的肿瘤，使用弯曲钳，如上所述。
4. 关闭手术场
   1. 将剩余的肿瘤放回皮肤下方，并使用钳子，将皮肤皮瓣拉在一起，沿着伤口将皮肤拉上线。
   2. 将皮肤从伤口边缘握在一起 5 mm，并使用手术夹关闭伤口，从最接近钳子的一侧开始。根据需要应用尽可能多的夹子，以确保没有底层组织暴露。通常，应用三到四个夹子，夹子之间有 2 mm 的间隙。
      注:如果任何剪辑应用不好，请使用剪辑移除器将其删除，然后替换为新剪辑。
5. 小鼠的恢复（助手）
   1. 将小鼠放入加热（37°C）加热室，让小鼠恢复。
   2. 将鼠标的笼子放在热垫上。监测加热室中的小鼠，直到它们从麻醉剂中恢复（觉醒和行走），然后将小鼠放回笼子里。将笼子放在热垫上再放在10分钟，直到老鼠变得更活跃。
   3. 给老鼠湿和软的食物。手术后1小时监测小鼠进行恢复，并确保夹子保持到位。确保笼子在热垫上半开/半开，让动物在无人看管时自行调节温度。
   4. 剂量小鼠与0.1毫克/千克丁丙诺啡（100μL皮下在颈部擦伤），手术后6-8小时（在一天结束）。第二天一早监测小鼠，并再次用0.1毫克/千克丁丙诺啡（100μL皮下在颈部擦伤）对小鼠进行剂量。根据需要给予更多的湿食物。
   5. 接下来的七天每天监测老鼠。使用剪辑移除器七天后可能会移除剪辑。
6. 佐剂或新辅助治疗
   1. 在任何给定时间用（新）辅助治疗治疗小鼠，具体取决于感兴趣的治疗。
   2. 例如，在接种后的第15天，或在接种后的第15天用100μg抗CTLA-4的一剂剂量治疗小鼠，或在接种后的第15天、第17天和19天用三剂200微克抗PD-1.p.。
7. 实验控制
   1. 当使用此模型评估炎症/伤口愈合的影响时，请考虑使用以下对照组:1） 无手术控制（治疗仍然可以在肿瘤内进行）;2） 沙姆手术控制:在皮肤上进行手术切口;肿瘤纵和暴露，但没有切除肿瘤组织 ;伤口用夹子闭合。

Results

肿瘤生长到50 mm²的大小是部分脱虫的理想尺寸。50 mm^{2 肿瘤}的不完全手术切除导致肿瘤在没有辅助免疫治疗的情况下 100% （n=5） 可再生（图 4A）。接下来，我们使用该模型测试辅助免疫疗法，使用抗体对检查点分子细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）和编程死亡受体1（PD-1）。对抗CTLA-4或抗PD-1小鼠的治疗，治愈率分别达到80%和25%（每组n=4-5）（图4B，4C）。抗PD-1的响应提供了一个机会来测试新颖的组合，以进一步提高响应率。

Discussion

我们为软组织肉瘤的不完全手术切除小鼠模型提供一种方案，以测试术内疗法。我们还标准化了手术切口，以便评估治疗后小鼠之间的伤口愈合情况。

肿瘤放置是此协议的重要组成部分。我们选择了皮下肿瘤模型，以便于手术访问肿瘤位点，并管理局部疗法，同时对小鼠负担最小。同样重要的是，确保肿瘤生长在皮下空间，而不是在近膜内，这可能导致意外的发病率和死亡率。

当为该协议选择肿瘤细胞系时，我们建议在体内生长的细胞形成固体质量（例如，WEHI-164模型），而不是半固体质量（如B16模型），因为在技术上很难部分切除。此外，如果肿瘤开始通过皮肤生长（通常在大于100 mm²的肿瘤中看到），不建议脱泡，因为皮肤可能会变得坏死，手术后无法愈合。我们已经克服了这个问题，通过去免疫肿瘤，一旦他们达到50毫米²的大小。

由于我们的模型可用于评估伤口愈合对治疗的影响，我们建议一个控制/耻辱组作为比较。控制可能是不变的肿瘤，或假手术，将只有皮肤切口，暴露的肿瘤，伤口闭合没...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 号 0.5 mL 胰岛素注射器	Becton Dickinson，澳大利亚	326769	无
2-巯基乙醇	Life Technologies Australia Pty Ltd	21985023	无
麻醉气体机	Darvall Vet，澳大利亚	SKU：2848	无
抗 CTLA-4	BioXcell，美国	BE0164	无
抗 PD-1	BioXcell，美国	BP0273	无
盐酸丁丙诺啡注射液，0.3mg/mL	RB healthcare UK Limited，UK	55175	处方单
洗必泰手术磨砂膏 4%	Perigo 澳大利亚	CHL01449F（磨砂	无
胎牛血清	CellSera，澳大利亚	AU-FBS-PG	无
镊子细 10.5 cm	外科手术室，西澳大利亚	CC74110	无
镊子 细 12 cm 锯齿	状手术室，西澳大利亚	CC74212	无
镊子 Halsted 14 cm	手术室，西澳大利亚	CD01114	无
加热室	Datesand Ltd，英国	Mini-Thermacage	无
HEPES （1M）	Life Technologies Australia Pty Ltd	15630080	无
异氟烷	Henry Schein Animal Health，澳大利亚	SKU：29405	处方单
润滑眼膏	Alcon	n/a	无
青霉素/链霉素 1000X	Life Technologies Australia Pty Ltd	15140122	无
磷酸盐缓冲溶液 10x	Life Technologies Australia Pty Ltd	70013-032	无
反射 7mm 夹	子 Able科学，澳大利亚	AS59038	无
反射 7 毫米伤口夹涂抹器	Able scientific，澳大利亚	AS59036	无
反射伤口夹去除器	Able scientific，澳大利亚	AS59037	无
啮齿动物 Qube 麻醉呼吸回路	Darvall Vet，澳大利亚	#7885	无
罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 1640 培养基 + L-谷氨酰胺	Life Technologies Australia Pty Ltd	21870092	无
剪刀 虹膜 STR 11 cm	手术室，西澳大利亚	KF3211	无
剪刀 虹膜 STR 9 cm	手术室，西澳大利亚	JH4209	无
小感应室	Darvall Vet，澳大利亚	SKU：9630	无
TrypLE express 1x	Life Technologies Australia Pty Ltd	12604-021	无
Germinator 500 玻璃珠灭菌器	Cellpoint Scientific Inc.，美国	5-1460-DK