本方案介绍了一种无需光刻技术的微图形化方法，操作简便，适用于生物工程背景有限的研究人员。该方法利用定制的激光切割掩膜，将细胞外基质蛋白微图形化为特定形状，以调控细胞形态。本文以诱导多能干细胞来源的心肌细胞为例，演示了微图形化的操作流程。
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本文内容
摘要
摘要
微图形化技术已广泛应用于细胞生物学领域，用于在单细胞分辨率下研究控制细胞形态和大小对细胞命运决定的影响。目前最先进的单细胞微图形化技术涉及软光刻和微接触印刷，尽管该技术功能强大，但需要具备微加工方面的专业工程技能和相关设施支持。这些限制促使人们寻求一种更易获取的技术方法。本文介绍了一种简单且无需光刻的替代方法：基于模板的单细胞图形化技术。我们提供了详细的分步操作流程，包括模板设计、聚丙烯酰胺水凝胶制备、基于模板的蛋白质引入，以及细胞接种与培养。这种简单的方法可用于排列多达2,000个细胞的阵列。我们展示了来源于单个人诱导多能干细胞（hiPSC）的心肌细胞在不同细胞形态下的图形化结果，从1:1的正方形到7:1的类似成人心肌细胞的矩形。这种基于模板的单细胞图形化技术无需光刻，技术稳健、操作便捷、成本低廉，最重要的是，即使缺乏生物工程背景的研究人员也能轻松掌握和应用。
引言
人诱导多能干细胞（hiPSCs）的出现以及随后建立的将其定向分化为不同类型细胞的实验方案，使得在分子水平和患者特异性层面上研究发育过程和疾病成为可能，特别是利用患者来源的诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）来建模心肌病1,2。然而，使用iPSC系统及其他体外模型研究发育和生理功能的一个主要局限在于缺乏结构化的微环境。在体内，细胞受到细胞外基质（ECM）以及邻近细胞的物理约束。这些微环境特定的生化组成和刚度决定了细胞的空间分布以及可用于细胞黏附的因子。这反过来影响细胞内信号通路、基因表达和细胞命运决定。例如，被微图形化为成年样杆状结构的iPSC-CM在收缩能力、钙离子流动、线粒体排列、电生理特性以及横小管形成方面均显著改善3。因此，微环境的特性在调控细胞功能中起着关键作用。
以往的微图形化技术在很大程度上依赖于光刻技术（图1A）。在该技术中，将一层光敏聚合物（即光刻胶）从溶液中旋涂于平坦的基底上，形成厚度约为1 μm的薄膜。随后，通过含有目标图形的掩膜将紫外（UV）光照射到光刻胶上。紫外（UV）光照射会通过改变光刻胶在其对应显影液中的溶解度，从而在化学上改变光刻胶的性质，将掩膜上的图形转移到基底上。许多微图形化方法都结合了光刻技术，因为它能够对....
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方案
1. 负图案聚酰亚胺基掩模的制备
- 使用计算机辅助设计软件（例如 AutoCAD、SolidWorks、Onshape、Adobe Illustrator）生成.dxf格式的图案（图2A）。
- 绘制一个圆（直径 = 22 mm），用于界定掩膜的边界。
- 绘制实心填充的形状或所需的图案。
- 添加一个手性字母（例如 R），以标记掩膜的正面。
注意：作为示例，生成了方形和矩形阵列，用于在单细胞和细胞对水平上图案化iPSC-CMs。设计文件可获取（见补充文件）。微加工分辨率极限约为10 µm。
- 将设计提交至微加工公司，进行聚酰亚胺薄膜的激光切割并制作掩膜（图2B、C）。
2. 硫代磺基-SANPAH 分装液的制备
注意：本方案修改自 Fischer 等人11。
- 使用防潮的硬纸板样品储存盒（例如，100 孔，10 × 10 离心管位，尺寸：13.4 cm × 13.4 cm × 5.1 cm）。在盒上标记为"....
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结果
已成功制备出包含方形或矩形阵列的模板（图4A）。按照本方案，我们获得了图案化的基质蛋白岛（图4B 和 图5A）以及细胞（图4C）。基质蛋白溶液浓度不适宜会导致图案化效果不佳（图5B）。使用模板的正面至关重要。若使用模板的背面，由于激光切割方向的影响，基质蛋白岛的尺寸会增大（图6A、B）。虽然矩形图案的宽度未发生显著变化（图6C），但使用模板背面时其高度显著增加，导致预期的长宽比降低（图6D、E）。我们将基于模板的图案化技术应用于硅弹性体基底（图7
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讨论
我们介绍一种无需光刻的基于掩膜板的微图形化方法，该方法可有效实现贴壁细胞的图案化。在本实验方案中，我们通过在具有生理或病理相关组织硬度的聚丙烯酰胺水凝胶或基于硅的弹性体基底上，对基底膜基质蛋白进行微图形化，形成特定岛状结构，从而实现不同长宽比的人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）的图案化。该方法相对简单，易于操作，适用于所有研究人员，包括那些在光刻和微加工技术方面经验有限的研究者。本方法避免了软光刻技术中制备印章以及微接触印刷技术中将蛋白质从印章模具转移至目标基底所面临的主要挑战。本方案提供了一套完整的工作流程：1）以经济高效的方式创建具有特定面积和形状的定制化掩膜板；2）制备具有目标硬度的水凝胶基底；3）在水凝胶基底上高效共价结合细胞外基质（ECM）蛋白。
传统的软光刻方法已被用于在不同材料的基底（如基于硅的材料和玻璃盖玻片）上图案化各种形状的细胞外基质（ECM）蛋白，包括三角形和星形13,14。在本研究中，我们仅展示了矩形图案，因为心肌细胞在生理和.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了以下资助：S.L. 获斯坦福儿童健康研究所（CHRI）博士后奖学金和美国国立卫生研究院（1F32HL142205-01）资助；S.M.W. 获美国国立卫生研究院院长办公室先锋奖（LM012179-03）、美国心脏协会资深研究者奖（17EIA33410923）、斯坦福心血管研究所、Hoffmann 和 Schroepfer 基金会以及斯坦福大学医学院心血管医学部资助；J.C.W. 获美国国立卫生研究院（UG3 TR002588、P01 HL141084、R01 HL126527、R01 HL113006、R01 HL123968）和烟草相关疾病研究计划（TRDRP 27IR-0012）资助；H.Y. 获美国心脏协会（AHA）博士后奖学金（18POST34030106）资助；T.S. 获Hengstberger奖学金资助。我们感谢斯坦福神经科学显微成像服务中心的Andrew Olsen博士在微图形化hiPSC-CM共聚焦成像方面的支持。我们感谢H.Y.完成了首个模板设计、制备、在聚丙烯酰胺水凝胶包被的盖玻片上对iPSC-CM进行单细胞微图形化，以及对单细胞微图形化iPSC-CM肌节结构的初步共聚焦成像。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-氨基乙基甲基丙烯酸盐酸盐（粉末） | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| 丙烯酰胺溶液 40%（溶液） | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| 台式紫外灯 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex 培养板 | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 含硅弹性体基底的 6 孔板 | |
| 双丙烯酰胺溶液 2%（溶液） | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning 盖玻片，方形，No. 2，W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure（2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮）（粉末） | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | 基底膜基质蛋白溶液 |
| 二甲基亚砜，99.7+%，超干燥，AcroSeal，ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex（13 mm）Durapore 膜滤器单元 | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50 mL Steriflip（0.22 µm） | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| 模板 | Potomac | 定制设计 | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | 用于模板清洗的酶 |
参考文献
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of ....
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重印与许可
