聚电解质复合胶束的组装与表征

摘要

我们提供了设计、组装和表征聚电解质复合胶束的实验方案及代表性数据，这类核-壳纳米颗粒由聚电解质与亲水性带电-不带电嵌段共聚物形成。

摘要

由带电聚合物在水溶液中自组装形成的核-壳纳米粒子——聚电解质复合胶束（PCMs），为研究聚电解质相互作用的物理机制提供了有力平台，同时也为解决治疗性寡核苷酸在体内的递送难题提供了有前景的方案。建立PCMs结构与性能之间的可预测关系一直具有挑战性，部分原因在于纳米粒子自组装过程中存在强烈的动力学陷阱。本文讨论了用于构建PCMs的聚合物选择标准，并提供了基于盐退火的实验方案，可实现可重复、低多分散性的纳米粒子组装。我们还介绍了利用光散射、小角X射线散射和电子显微镜对PCMs进行表征的方法。

引言

当带相反电荷的聚电解质在水溶液中混合时，由于反离子释放导致熵增加，溶液会分离为富含聚合物的凝聚相和贫聚合物的上清液^1,2,3,4,5，这一现象称为聚电解质复合。如果将中性亲水嵌段连接到一个或两个聚电解质上，则会发生纳米尺度的相分离（图1A）。由此形成的自组装核-壳纳米颗粒根据其与表面活性剂胶束化的类比，被不同地称为聚电解质复合胶束（PCMs）、聚离子复合胶束、嵌段离子体复合物或共凝聚核胶束，尽管该体系的所有组分均为亲水性^6,7。由于PCMs能够包载蛋白质和核酸等亲水性分子，并且其嵌段共聚物载体结构具有高度可调性，因此它们成为体内递送治疗分子的有吸引力的候选载体^{8,9,10,11,12,13}。

将治疗性核酸递送至细胞靶点是一项尤为重要的挑战，而相分离复合物（PCMs）在这一领域具有多项优势。治疗性核酸（包括基因DNA、mRNA以及siRNA等寡核苷酸）在改善人类健康方面具有巨大潜力，但其实现潜力需克服众多生物学和物理屏障^14,15,16。裸露的核酸易被血清和细胞内的核酸酶降解，在循环系统中被迅速清除，且其强烈的负电荷使其在无辅助情况下难以穿透细胞膜。目前克服这些障碍的方法包括昂贵的化学修饰以防止核酸酶破坏，和/或通过疏水相互作用将核酸封装到各种脂质纳米颗粒中^15,17,18。尽管这些方法在局部注射和肝脏靶向方面已被证明有效，但在全身性应用时仍存在毒性、免疫原性以及生物分布有限等显著局限性¹⁶。相比之下，PCMs利用核酸的负电荷将其浓缩于相分离的核心内，而中性的外壳则提供空间位阻以抵抗降解，并可作为平台整合配体以增强靶向性或细胞摄取^11,19。体外和动物研究表明，PCMs能够有效递送多种核酸载荷^{20,21,22,23,24}，但我们目前尚难以根据组成聚合物的性质准确预测PCM的尺寸、形状和稳定性等特性，这限制了其更广泛的应用。

我们课题组及领域内其他研究者近期的工作已开始通过建立核酸与各类阳离子-中性聚合物形成的相容性复合材料（PCM）的结构-性能关系，甚至在某些情况下的结构-性能-功能关系，来解决这一问题^7,25,26,27。这些研究中呈现出两个一致的主题：一是必须建立严格可控且可重复的PCM组装方案，二是应采用多种技术手段对所得纳米颗粒进行表征。聚电解质（尤其是像核酸这类电荷密度较高的分子）之间相互作用非常强烈，混合时似乎极易陷入动力学捕获状态，导致PCM制备物对实验操作中的微小变化高度敏感，并表现出较高的多分散性和批次间重复性差的问题。此外，研究表明PCM会因其组分在原子级构型上的差异而呈现出多种多样的形状和尺寸，而单一的表征技术很难全面捕捉这种多样性；特别是某些常用技术（如动态光散射，DLS）在数据解析时还需对粒子形状作出假设，进一步增加了表征难度。

本文讨论了用于PCM的材料设计与选择，重点关注寡核苷酸和阳离子-中性嵌段共聚物。随后，我们描述了一种盐退火方案，该方法先使用高盐浓度，再通过缓慢透析以避免PCM组装过程中的动力学捕获。在高盐条件下混合聚电解质，此时静电吸引力被屏蔽，然后缓慢降低盐浓度，使聚电解质逐步达到能量上最有利的构型，这一过程类似于热退火中的缓慢冷却。采用该方案，我们通常能够实现寡核苷酸PCM极低的多分散性和高度的可重复性^7,26。最后，我们介绍了如何利用四种不同的测量技术，在从外部形貌到内部结构的极宽尺度范围内对PCM进行表征：动态光散射（DLS）、多角度光散射（MALS）、小角X射线散射（SAXS）以及透射电子显微镜（TEM）。我们希望这些实验方案能够帮助更多研究人员有效探索这类有趣纳米粒子的性能。

聚合物的选择与制备
相变材料（PCM）的性质在很大程度上受到其组成聚合物的物理和化学特性的影响，因此聚合物的选择是设计过程中的关键步骤。目前研究最为充分的用于核酸相变材料的嵌段共聚物是线性二嵌段共聚物，例如聚赖氨酸-聚乙二醇（pLys-PEG），但相变材料也可在聚电解质与多种亲水性中性-带电聚合物之间形成，且可实现高通量制备²⁸。所选带电基团的类型会显著影响离子配对的稳定性及胶束的形态²⁶，并且已有研究表明，相变材料的尺寸随带电嵌段长度的增加而增大^5,7,26（图2），从而使得相变材料的性质可根据特定应用需求进行调控。对于线性二嵌段共聚物，我们发现带电嵌段应至少含有10个电荷，并在目标pH条件下具有较强的电荷密度。较长的带电嵌段更有利于与寡核苷酸（如siRNA）形成相变材料，因为较短的嵌段难以有效复合这类分子²¹。我们已成功观察到嵌段长度达200的相变材料形成，文献中亦有报道更长聚合物的情况。中性嵌段的选择具有更大的灵活性²⁴，但实践经验表明，过短的中性嵌段易导致聚集而非纳米颗粒的形成，且中性嵌段的最小长度随带电嵌段长度的增加而提高。对于pLys-PEG体系，当pLys长度低于约50时，PEG的分子量至少需达到3,000–5,000；随着带电嵌段长度进一步增加，所需的中性嵌段长度也相应增加。中性嵌段长度的增加会导致相变材料尺寸增大，尤其是壳层厚度的增加，这是由于中性聚合物的空间位阻效应所致。

本论文介绍了一种利用冻干的高纯度pLys-PEG和已知量的寡核苷酸制备聚电解质复合物（PCM）的实验方案，该方案也可轻松适用于其他体系。我们已成功将其应用于多种带电多肽，包括聚精氨酸和聚谷氨酸，以及多种合成聚电解质，如聚丙烯酸和聚（苯乙烯基三甲基氯化铵）。我们还描述了如何以聚电解质电荷的化学计量比制备PCM，但该比例易于调整。我们发现使用电荷浓度单位（c.c.）进行操作最为简便，该单位也可自然适用于未完全带电的聚合物。如果任一聚合物的特性不明确，则需谨慎准确测定其链长或质量，并确保除透析过程中为电荷中和所必需的盐分外，不存在过量盐分。在计算浓度时，也应考虑任何残留水分的影响。核酸浓度可通过在260 nm处的吸光度方便地定量，且在计算电荷浓度（c.c.）时应考虑其末端是否存在磷酸基团。

使用寡核苷酸作为多聚阴离子时，其杂交状态和化学结构有助于决定自组装的倾向性以及所形成 PCM 的特性^5,7,26。在利用 PCM 进行递送时，若需满足生物学功效的要求，则优化这些因素将提高形成目标结构的可能性。用于分析杂交特性的有用工具包括用于核酸的 MATLAB 函数、NUPACK²⁹ 和 IDT OligoAnalyzer。我们建议对候选序列进行分析，以了解其与以下三种对象结合的强度：1）自身形成的发夹结构；2）同一序列的另一拷贝（自二聚体）；3）系统中存在的其他寡核苷酸。特定序列的 DNA 和 RNA 熔解温度也可通过最近邻法^30,31进行计算。核酸的热退火（步骤 2.3）可使单个核苷酸中残留的任何二级结构发生变性，并促进达到平衡状态的折叠。

相变材料的表征与分析
目前有多种技术可用于纳米颗粒的表征，包括静态光散射和动态光散射、电子或中子的小角散射以及电子显微技术。本文中，我们提供了两种光散射技术——小角X射线散射，以及两种电子显微技术的实验方案。

DLS 通过测量样品布朗运动引起的散射光强度在单一角度上的时间波动自相关性来进行分析。对这些数据进行拟合可获得球形胶束的流体动力学半径和多分散性（图3）。多角度光散射（MALS）则测量多个角度下的静态散射光强度。这种角度依赖性可反映纳米粒子的形状，但由于可见光的检测极限约为50 nm以上，因此对较小的纳米粒子效果有限。这两种技术均基于折射率差异，主要描述纳米粒子的外部尺寸。

小角X射线散射（SAXS）使用X射线作为散射探针，其较短的波长使得可在约0.1–100 nm的范围内进行测量。通过拟合观测到的散射强度与散射角的关系（通常以动量转移q表示），可以获得关于PCM形貌（即尺寸和形状）以及内部结构的信息。如果具备绝对强度校准，并且散射强度可外推至零角度，则还可估算PCM的质量和聚集数³²，这使得SAXS成为一种极为多用途且有价值的方法。小角中子散射（SANS）在相似的长度尺度范围内具有灵敏性，但仅在专用设施中可用，因此本文将不对其进行详细讨论^33,34,35。

近年来，台式SAXS仪器已经问世，但我们发现，对于PCM表征而言，同步辐射光源更为合适，因为其更高的强度使得对这些低对比度样品的数据采集速度显著加快。我们从用户的角度，提供了一份在先进光子源（美国阿贡国家实验室）12-ID-B光束线上采集PCM SAXS数据的简要方案。该方案应适用于大多数同步辐射光源，但在提出实验计划前，强烈建议咨询当地工作人员。我们还提供了一套使用Irena³⁶的数据归约与分析方案，Irena是一组为Igor Pro编写的免费宏工具。Irena包含多种灵活的形状因子，可用于建模SAXS数据，并支持构建多组分模型，以描述PCM复杂的散射谱（见代表性结果部分的图4）。Irena还提供全面的在线文档和教程。在尝试以下操作之前，我们建议先熟悉这些资料，尤其是教程"使用两个主要散射体群体对SAXS数据进行建模"。

X射线散射实验中，辐射损伤是一个需要关注的问题，但可采取多种措施将其降至最低。特别是，我们建议使用带有注射泵和流动样品的流动池装置，而非密封毛细管。这种方法还能显著简化背景扣除。此外，建议对流动样品进行多次短时间曝光，而不是一次长时间曝光，以限制样品中任一体积所承受的辐射通量，并可通过比较各次曝光数据来识别可能的损伤。

与通常需要通过拟合来解析的散射技术不同，透射电子显微镜（TEM）通过将电子束穿过样品并在闪烁屏上投射图像，直接提供纳米颗粒在实空间中的可视化图像（图5）。本文介绍了两种TEM技术的操作方案。冷冻透射电镜（Cryo TEM）将胶束样品快速冷冻成一层薄的非晶态冰，以最少的外来物质保持其结构构象，适用于半径约为10–100 nm的胶束。负染透射电镜（Negative stain TEM）则是在样品干燥于载网表面后，用重金属盐（如铀）包围样品；由于染色剂密度较高，其对电子的散射强于样品本身，从而增强对比度，形成样品的负像。推荐使用冷冻透射电镜获取高质量图像，但该方法成本较高、耗时较长，且可能对比度不足。当存在此类限制时，应采用负染样品。各类示例见于图5。

这些技术各自报告了纳米颗粒的不同方面，具有不同的优势和局限性。光散射技术易于获得，通常是最快的方法，但在尺寸和形貌分辨率方面存在显著限制。小角X射线散射（SAXS）可在较宽的长度尺度范围内提供信息，并具有相对较高的通量，但需要专用设备采集数据，同时需要建模来解析结果。透射电子显微镜（TEM）图像易于解释，但可能存在对比度不足的问题，且本质上通量较低。我们的经验表明，结合多种表征技术可显著增加对相变材料（PCM）特性的了解，并简化单独使用任一技术所获得数据集的解释。例如，SAXS和TEM主要检测PCM的致密核心，而光散射则反映纳米颗粒的整体尺寸。因此，结合这些方法可实现对核心和冠层尺寸的同时测量。TEM获取实空间图像的能力可提供真实数据，有助于为建模SAXS数据选择合适的形态因子，从而解决原本可能存在的歧义。本文描述了这四种技术的实验方案，并在讨论部分给出了利用这些技术表征未知样品的示例流程。

方案

1. 材料准备

1. 称取冻干的嵌段共聚物，加入水至接近配制终浓度为 10 mg/mL 储存液所需的体积。在最大转速下涡旋振荡 2 分钟。
2. 超声处理 5 分钟。较长的嵌段共聚物可能需要额外的超声处理。储存液应完全透明且均匀。
3. 根据需要使用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.4，然后加水至最终体积。pLys-PEG 溶液相对稳定，但长期储存时应冷藏，并在使用前检查 pH。优先选择冻干保存而非冷冻。
4. 将冻干的寡核苷酸重悬于所需储存浓度，通常对于长度不超过 50 nt 的寡核苷酸，分子浓度为 2–5 mM。充分涡旋以确保完全溶解。
5. 根据引言中所述方法，利用分子量或长度计算摩尔浓度。
6. 计算摩尔电荷浓度（c.c.），其中

聚电解质的电荷数是指带电单体的数量，而核酸的电荷数则等于碱基数目减1（假设未发生磷酸化）。需要注意的是，双链DNA每分子所带电荷数是单链DNA的两倍。

7. 为每种聚合物配制 20 mM c.c. 的稀释储备液。

2. 核酸聚电解质胶束的制备

1. 在1.5 mL微量离心管中，将以下组分混合至总体积为280 μL：
   1. 200 μL无核酸酶水（不含核酸的超纯水）。
   2. 40 μL 10×磷酸盐缓冲液（PBS，稀释至1×时含137 mM氯化钠、10 mM磷酸盐，pH 7.4）或其他合适的缓冲液³⁷。
   3. 40 μL 20 mM c.c. 寡核苷酸。对于双链寡核苷酸，分别加入20 μL每条链（浓度均为20 mM c.c.）。
2. 将寡核苷酸溶液在70 °C孵育5分钟。如果计算出的寡核苷酸熔解温度更高，则应相应提高温度。注意RNA在高温下会降解，因此若存在RNA或其他敏感组分，此步骤不应延长。
3. 冷却15分钟。加入40 μL 20 mM c.c. 双嵌段共聚物，立即在最大转速下涡旋振荡20秒。室温（RT）孵育5分钟。
4. 进行盐梯度退火。
   1. 加入80 μL 5 M氯化钠，使终浓度为1 M NaCl，终体积为400 μL。在最大转速下涡旋振荡10秒。
   2. 室温孵育10分钟，然后将样品装入透析盒。请注意，所列的分子量截留值是针对球状蛋白确定的，对于线性聚合物并不准确。我们发现使用2k MWCO透析盒可避免样品损失，并实现离子强度的逐步变化。
   3. 准备透析液。
      1. 计算所需透析液体积：
         
      2. 将10×PBS（或其他所需缓冲液）、5 M NaCl和超纯水混合，配制成终浓度为1×PBS和0.5 M NaCl的溶液，以及两份1×PBS溶液。
   4. 装载透析盒。
      1. 用永久性记号笔标记透析盒。将透析盒浸泡在缓冲液中至少2分钟，以充分水化膜。
      2. 逆时针旋转取下盖帽。使用加样枪头将样品加入。轻轻挤压膜以去除多余空气。重新盖上盖帽。
      3. 将透析盒放入含1×PBS和0.5 M氯化钠的透析液中。透析盒应漂浮，且两面膜均暴露于透析液中。必要时可使用泡沫浮子辅助。
   5. 透析
      1. 在磁力搅拌器上缓慢搅拌，孵育24小时。
      2. 将透析盒转移至新的1×PBS或其他所需工作缓冲液中。继续在磁力搅拌器上缓慢搅拌，孵育24小时。重复此步骤一次。
   6. 回收样品。
      1. 从透析液中取出透析盒。取下盖帽，使用加样枪头回收样品。注意由于膜的溶胀，回收体积可能高于初始的400 μL。若对轻微稀释敏感，应记录回收体积。
      2. 将样品转移至洁净的1.5 mL微量离心管中。以本方法制备的PCM在避免核酸酶污染的前提下，冷藏条件下可稳定保存数月。

3. 动态光散射

1. 为确保无尘环境，缓冲液应仔细过滤（使用0.22 μm注射器或真空滤器过滤3次），样品间应彻底清洗玻璃器皿。此外，在进行测量前，必须确保样品已达到热平衡状态。
2. 将PCM样品用所需的缓冲液稀释至0.2 mM c.c.（若采用上述方案，则稀释10倍），并加入合适的比色皿中。我们使用小体积比色皿，稀释后约需200 μL样品。
3. 将DLS检测器位置设置为90°。
4. 调节激光功率和/或衰减器，使计数率尽可能达到每秒100,000–200,000计数（cps）。计数率低至10 kcps也可使用，但可能需要延长测量时间以获得良好的统计结果（步骤4.1）。应避免使用更高的计数率，因为多重散射会干扰测量。
5. 采集数据1分钟。在整个采集时间内，计数率应保持恒定；若不恒定，则表明样品或仪器的某个组分尚未达到平衡。
6. 检查自相关数据。长时间基线应非常平坦，自相关曲线应平滑，散射最小，如图所示 图3A基线漂移表明系统未达到平衡，通过采集更多数据可改善数据中的噪声。
7. 拟合自相关函数。
   1. 使用 REPES^38,39 进行正则化逆拉普拉斯变换，以获得弛豫时间分布和扩散系数， D。该方法随后计算流体动力学半径， R_h，使用斯托克斯-爱因斯坦方程：
      
      图1B 显示了R的示意图_h 和 图3B 显示了REPES的结果。
   2. 或者，使用其他方法，包括 CONTIN^40,41 （一种替代的正则化算法）或非负最小二乘拟合（NNLS）。多种拟合方法得到一致的结果是高质量数据的标志。需注意，矩量法分析（许多仪器上的标准方法）在多峰尺寸/长度分布情况下会给出非物理意义的数值。

4. 多角度光散射

注意：可以使用多种仪器测量光散射强度随角度的变化。我们采用基于测角仪的仪器和多检测器仪器在批量模式下运行，均获得了良好的结果。

1. 调整 PCM 的浓度和光照强度，以确保在所有角度下相对于仅含缓冲液的样品具有足够的信噪比，同时避免任何检测器饱和。可通过制备不同稀释倍数的样品并检查散射强度与浓度之间的线性关系来验证后者（假设 PCM 之间相互作用可忽略）。
2. 记录样品在 15° 至 135° 范围内每个角度下持续 1 分钟的光散射速率。若样品和仪器已充分平衡，散射速率在测量时间内将保持恒定。
3. 绘制归一化的散射速率 Isin(θ) 随 q 的变化曲线，其中 I 为散射速率，q 为散射矢量（光子动量转移），其定义如下：

其中，η 为溶剂的折射率，θ 为测量角度，λ 为光源的波长。图 4 展示了多角度光散射（MALS）散射强度的曲线图。

5. 小角X射线散射

1. 数据采集
   1. 按照上述方法制备寡核苷酸PCM样品，寡核苷酸PCM的电荷浓度为2 mM，以确保散射信号显著高于背景。对于不含重原子（例如核酸中的磷）的PCM，可能需要更高的浓度。散射长度密度可使用SASSIE等计算器进行估算⁴².
   2. 为了通过清除自由基以尽量减少辐射损伤，从浓缩的（例如50%）储备液中加入甘油，使胶束溶液中含有1%（v/v）甘油。注意，纯甘油黏度较高，难以准确量取，强烈建议用水或缓冲液稀释后使用。
   3. 加入1%甘油制备大量工作缓冲液，用于作为背景监测。
   4. 准备特定光束线的流动池装置并校准探测器。该方案使用一根直径为3 mm的石英毛细管，通过小直径且长度最短的聚乙烯管连接至计算机控制的注射泵。此装置每个样品所需最小体积约为140 μL。
   5. 确定样品曝光参数。最佳曝光条件取决于光束强度、探测器灵敏度以及样品的浓度、散射能力与损伤敏感性，但目标是使样品暴露于获得足够散射强度所需的最低通量下 q 感兴趣区域
   6. 对于寡核苷酸/pLys-PEG 相变微球，以1 Hz重复频率进行30次、每次0.2秒的照射，可获得良好的数据质量，且无明显损伤。对于新样品，以下步骤可能有所帮助：
      1. 制备一系列浓度的PCM样品（例如，10–10,000 μM c.c.）。
      2. 从中间浓度开始，交替使用相变材料（PCM）和仅缓冲液的样品，并设置不同的暴露时间。数据采集与处理步骤见下文。样品信号应具有良好的统计性（较小的统计误差，或在跨区间平滑变化） q如果统计结果不理想，可适当延长曝光时间。
      3. 样品信号也应明显区别于背景 q 感兴趣区域。计算并绘制（信号－背景）/背景 比值随 q 以确定信噪比。如果信噪比较低，应增加样品浓度。
      4. 通过在较高和较低浓度下采集数据（必要时调整曝光时间）并验证散射强度（相对于浓度归一化）是否与样品浓度无关，以确认其独立性。粒子间相互作用（导致浓度依赖性的最可能原因）在低角度区域表现最为显著。 q 范围
   7. 采集PCM样品及背景（即含甘油的缓冲液）的数据。
      1. 启动注射泵，使样品通过毛细管。可采用双向或单次通过的运动方式，但应注意隔离每个样品（例如，在样品之间插入气泡）。若未观察到辐射损伤，样品可回收并重复使用。
      2. 一旦流动开始，立即启动上述X射线曝光与数据采集程序。应注意确保射线曝光在流体流动结束前终止。
   8. 每次样品测试后，进行方位角平均并绘制一维曲线图（即强度随散射矢量大小的变化）。 q每次曝光的信号应合并处理。在统计误差范围内，它们应保持一致。信号随时间的变化可能表明存在辐射损伤。
      1. 孤立的异常曲线可能提示存在微气泡。若频繁观察到气泡，降低流速可能有所帮助。
   9. 对一维散射谱图进行平均。
   10. 频繁获取仅缓冲液样品的数据（每检测4–5个PCM样品后进行一次），并随时间比较这些数据。仅缓冲液样品信号增强表明毛细管可能被辐射损伤的样品污染。
       1. 当发现污染时，用漂白剂清洗毛细管，并在可能的情况下考虑缩短暴露时间。
2. 使用 Irena 进行数据降维与分析
   1. 导入胶束和背景ASCII数据集（SAS/数据导入 & 导出/导入 ASCII SAS 数据).
   2. 从样品数据中扣除背景散射。通常，最高 q 值（例如 q > 0.5）显示溶剂的非相干散射主导了信号。将该区域的背景数据进行缩放，以匹配样品数据 q 范围消除了由于光束强度变化和样品浓度差异引起的任何变异。
      1. 在双对数坐标系中同时绘制样品和背景曲线。验证高角度处强度是否平坦 q (SAS/数据处理/数据处理 I）。计算样品与背景的比值（数据1/数据2），在半对数坐标系中绘图，并验证其高q 渐近线
      2. 计算此范围内的平均（样本/背景）比值 q 范围（使用自定义宏或从数据浏览器复制/粘贴到电子表格中）。
      3. 使用 数据处理 宏观，调整背景（例如， 修改数据 2) 使用上述计算的比值，绘制背景扣除信号与背景的比值图 vs. q ([数据1-数据2]/数据2），验证其在高浓度下现趋于零 q记录该比值；其应为 <每个样本偏离1.0约1–2%。
      4. 绘制扣除背景后的信号（数据1-数据2）与（ q 并以新名称保存数据，切勿覆盖原始数据。
      5. 如果高-q 数据不可用，背景扣除时使用1作为缩放因子，但需注意可能引入的误差 q 信号/背景比值较小的范围。
   3. 打开 建模 宏观，（SAS/建模），然后加载并绘制扣除背景后的数据（数据控制/添加数据）。在此宏中请勿缩放。
   4. 首先，确定PCM（胶束尺寸/形状）外表面的近似模型：
      1. 在 数据对照，选择低至中等 q 范围（例如，~0.003 Å）^-1 < q < ~0.1 Å^-1）。如果可见振荡现象，则需将其包含在内。
      2. 选择适合数据的形态因子。在低值处的斜率 q 可指示纳米颗粒的形状，该结果也可通过透射电子显微镜（TEM）和/或多角度光散射（MALS）进行验证。使用Schulz-Zimm球状模型（q⁰），圆柱体（q^-1），或柔性圆柱体（q^-2）模型。Irena 提供了拟合幂律的工具（SAS/绘图与制表支持工具).
      3. 在 模型对照组，选择第一个散射群体（1P）并确保它是唯一正在使用的（选择 使用？ 复选框
      4. 选择 粒径分布 用于 模型 并选择所需的 分布类型 和 形态因子. 通过在字段中输入数值来设置搜索的初始参数 比例尺, 平均大小，以及 宽度 字段并单击 计算模型 绘制出最终的形状因子。
         注意：柔性圆柱形制式可作为用户自定义制式添加，并可从中下载 https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena参数1和参数2分别对应圆柱体的长度和库恩长度。
      5. 找到合理参数后，单击 拟合模型 对数据进行非线性最小二乘法拟合。该 粒径分布 模型给出平均半径和宽度。
         计算多分散性指数（PDI）时使用
         
         与任何非线性拟合过程一样，可能需要调整数据范围（q 区域）和起始参数，以获得稳定且符合物理规律的拟合结果。
      6. 当获得合理的拟合结果后，保存该结果（保存至笔记本/存入文件夹).
   5. 接下来，对相变材料核心内单个聚合物的散射行为进行建模。这可以通过幂律模型（例如，q）来描述。^-2 对于理想链，q^-5/3 对于溶胀链等情形，Irena 通过 Beaucage 模型实现此功能⁴³:
      
      其中P为幂律，G和B为前置因子。
      1. 调整数据控件以覆盖整个范围 q 范围并重新绘制模型（计算模型）。通常，在中等到高角度范围内会观察到过量的散射 q 范围（例如， q > ~0.1 Å^-1).
      2. 使用数据控件选择 q 散射过强的范围（>观察到十倍的外形尺寸模型。
      3. 添加第二个散射群体（2P）并确保它是唯一正在使用的（取消选择 使用？ 用于 1P).
      4. 选择 统一水平 对于该模型，B 和 P 是相关参数。使用绘图辅助工具或 csrs 之间的拟合 P/B 宏以获取这些参数的初始估计值，并调整Guinier因子G和R_g 以确保模型不会在低角度时预测出过强的散射 q.
      5. 关于形状因子，进行非线性拟合，并记录拟合参数与模型。
   6. 接下来，如果存在衍射峰，如在 图4，为衍射峰添加第三个模型 q 感兴趣区域 (q ≈ 0.22 Å^-1 在此情况下）。
   7. 在获得各个散射群体的近似拟合值后，同时开启全部三个群体（选择 使用？ （每个）并优化联合拟合。
   8. 检查每个数值是否保持在物理上合理的范围内。该步骤的结果应得到一个复合模型，能够很好地描述大尺度范围内的SAXS数据，如图所示。 图4. 使用以下方法保存拟合结果 存入文件夹 按钮，用于在 Igor 中存储。

6. 透射电子显微镜（TEM）

1. 冷冻透射电镜
   1. 选择载网。推荐使用带有孔状碳支持膜的标准透射电镜载网，或以 lacey 碳膜作为替代。无论哪种情况，碳膜之间的孔洞将提供纯玻璃态冰和样品的成像区域，无支持膜干扰。
   2. 将载网碳膜面朝上放置于清洁的玻璃载片上的辉光放电装置中。用实验室薄膜包裹载片有助于载网的操作。避免用镊子接触载网中心，始终夹持载网边缘附近。
   3. 对载网进行 30 秒的辉光放电处理。
   4. 准备用于样品沉积的玻璃化机器人。
      1. 设置环境为 100% 湿度和室温，并添加吸水纸。在机器底部准备好液态乙烷和液氮浴。有关玻璃化机器人的准备与使用，可参考在线教程和视频以获得进一步帮助。
   5. 将样品稀释 5 倍。
   6. 使用玻璃化机器人配套的负作用力镊子夹取载网，然后将镊子安装到机器人上，并将镊子移入腔室。
   7. 在机器人内部，通过机器侧面的孔洞，用移液器将 4 μL 样品加至载网的碳膜面。
   8. 孵育 4 分钟。
   9. 使用机器人，用滤纸 blot 3–5 秒。
   10. 玻璃化机器人将把载网迅速浸入液态乙烷中。
   11. 取下镊子，将载网转移至液氮中，并放入储存容器（该容器也应处于液氮环境中）。此过程使样品固定在一层薄的玻璃态冰中。在此步骤中，应尽量减少载网暴露于液态乙烷或液氮之外的时间。
   12. 使用液氮冷却冷冻样品 holder。保持杜瓦瓶和储液罐充满。
   13. 准备成像时，将载网装载到冷冻样品 holder 上。保持样品处于液氮中，或短暂置于液面正上方极冷的氮气蒸气中。
   14. 在 120 kV 下，以 75,000× 至 150,000× 的放大倍数对薄冰和厚冰区域进行成像，因为不同大小的胶束可能偏好特定的冰层厚度。
       1. 限制电子束照射时间，以避免冰层融化和样品损伤。不要在计划成像的区域直接聚焦；应在附近区域聚焦。仅在采集图像时暴露目标区域。
       2. 观察图像时，务必区分液态乙烷液滴与样品（见 图 5）。
2. 采用负染色法的传统透射电镜
   1. 制备染色液。
      1. 煮沸约 10 mL 超纯水。称取 0.1 g 甲酸铀酰（UFo）至 15 mL 圆锥管中。
      2. 加入 5 mL 热水，配制成 2% 溶液。盖紧管盖，并用铝箔包裹以避光。1% 醋酸铀酰染色液也常被使用。
      3. 涡旋或剧烈震荡 5 分钟。将管子固定在涡旋仪上有助于混合。通过 0.2 μm 注射器滤器过滤至洁净的圆锥管中。
      4. 室温冷却 10 分钟。加入 25 μL 5 M NaOH，并立即涡旋 2 分钟。
         1. 替代方法：将 2% UFo 溶液分装为每份 200 μL 并冷冻保存。使用时取出一份解冻，加入 1 μL 5 M NaOH，涡旋 2 分钟。
      5. 染色液需用铝箔包裹或避光保存。
   2. 用 1× PBS（或所需缓冲液）将样品稀释 10 倍。
   3. 选择载网。推荐使用铜网支撑的碳膜载网。载网颜色较深、较亮的一面为碳膜涂层面，样品将在此面沉积并染色。
   4. 将载网碳膜面朝上放置于清洁玻璃载片上的辉光放电装置中。参见步骤 6.1.2。
   5. 对载网进行 30 秒的辉光放电处理。
   6. 用镊子夹取载网，保持碳膜面朝上，夹持载网边缘以防止中心成像区域撕裂。将夹有载网的镊子平稳放置，确保碳膜面仍朝上。
   7. 用移液器将 4 μL 样品液滴加至载网顶部（碳膜面）。
   8. 孵育 4 分钟。
   9. 剩余约 1 分钟时，用移液器将 10 μL 和 20 μL 的 UFo 溶液分别滴加至一块洁净的实验室薄膜上。
   10. 使用滤纸从载网边缘以垂直接触方式吸去样品液，避免接触成像表面。
   11. 用镊子（仍夹持载网）立即将载网的样品面朝下接触 10 μL UFo 液滴，随后立即吸去液体（洗涤步骤）。此过程中切勿让载网干燥，各步骤之间不得中断。
   12. 以类似方式，将 20 μL UFo 液滴作用于载网。保持载网与 UFo 接触 40 秒。吸去液体后让载网自然干燥。
   13. 在 120 kV 下，以 20,000× 至 100,000× 的放大倍数对干燥载网进行成像。
   14. 务必按照机构放射性废物安全处理服务的要求，妥善处置所有被 UFo 污染的材料。
   15. 必要时，可在 ImageJ 中对透射电镜图像进行亮度/对比度增强和中值滤波处理，以降低背景噪声。后处理应统一应用于所有非用于定量测量（如强度分析）的图像，并须在文中明确说明。

结果

为了说明上述表征方法，我们展示了由不同长度和化学组成的寡核苷酸与嵌段共聚物组装而成的 PCM 的典型结果（图1）。图2 提供了一个示例，显示 PCM 核心尺寸（根据 SAXS 和 TEM 测定结果，见 图4 和 图5）随带电嵌段长度变化的情况。图3 展示了由相对较长的嵌段共聚物和较短的单链寡核苷酸形成的球形 PCM 的动态光散射（DLS）数据及其拟合结果。图4 说明了如何通过结合多种空间相关性模型（包括外表面、核内散射和螺旋间有序结构）准确拟合复杂的 SAXS 强度谱，并展示了多角度光散射（MALS）如何将散射测量扩展到更长的长度尺度。最后，图5 展示了不同形貌 PCM 的代表性电子显微镜数据。

讨论

如上所述，本文所述方案主要针对以寡核苷酸作为聚阴离子组分、pLys-PEG 作为阳离子-中性嵌段共聚物的情况而编写，但我们已使用多种其他聚合物（如聚丙烯酸、聚谷氨酸和 PEG-聚（苯乙烯基苄基三甲基铵））进行了测试，认为这些方案通常适用于大多数聚电解质组合。其中一个可能需要优化的参数是退火过程中所用的盐浓度，因为盐浓度应足够高，以确保在退火初期不会形成聚电解质复合物微粒（PCMs）。这一点可通过动态光散射（DLS）实验进行验证，或通过与仅含聚电解质（不含中性嵌段）时的相分离现象进行比较来判断。如果不宜采用盐退火，也可使用热退火，但所得产物的多分散性较大⁷。用于表征的样品浓度也可能需要优化，因为较大的纳米颗粒比小颗粒散射更多的光，而由于核酸骨架中含有电子密度较高的磷原子，其对 X 射线的散射效率也高于许多其他聚合物。此外，如果任一聚电解质的 pKa 接近工作条件下的 pH 值，则可能需要更严格地控制缓冲液的 pH。

本文介绍了两种光散射技术（即多角度/静态光散射和动态光散射）、小角X射线散射，以及冷冻和常规负染透射电子显微镜技术的实验方...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70 mm 圆形滤纸	Whatman	1001-070	制网过程中用于吸液的滤纸
碳膜透射电镜载网	Electron Microscopy Sciences	CF200-Cu	透射电镜载网
DAWN	Wyatt Technology	DAWN	多角度激光散射仪（MALS）
DNA 寡核苷酸	Integrated DNA Nanotechnologies Inc		定制寡核苷酸
带网格碳膜透射电镜载网	Electron Microscopy Sciences	LC200-Cu	透射电镜载网
甲氧基-聚（乙二醇）-嵌段-聚（L-赖氨酸盐酸盐） PEG5k - PLKC50	Alamanda Polymers Inc	mPEG5K-b-PLKC50	示例嵌段共聚物
Milli-Q	Millipore Sigma		超纯水
NanoDrop	Thermo Scientific		用于测定核酸浓度
负作用镊子	Dumont	N7	用于载网制备的镊子
Parafilm "M"	Bemis Company Inc	PM996	实验室封口膜
Quantifoil 多孔碳膜透射电镜载网	Electron Microscopy Sciences	Q210CR1.3	透射电镜载网
研究级测角仪与激光散射系统	Brookhaven Instruments	BI-200SM	动态光散射/多角度激光散射仪（DLS/MALS）
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL	Thermo Scientific Pierce Protein Biology	87723	透析盒
小体积比色皿	Brookhaven Instruments	BI-SVC	用于 DLS/MALS 的比色皿
Solarus 950 高级等离子体系统	Gatan	Solarus 950	用于透射电镜载网处理的等离子体系统
Talos 透射电镜	FEI	Talos	用于冷冻样品的透射电镜
Tecnai Spirit 透射电镜	FEI	Spirit	用于干燥样品的透射电镜
甲酸铀酰	SPI-Chem	16984-59-1	用于透射电镜样品的负染色
Vitrobot	FEI	Vitrobot	用于冷冻载网制备的玻璃化机器人