利用驱动蛋白运动分析法构建多组分脂质纳米管网络

摘要

本方案描述了一种利用驱动蛋白滑动运动与巨大单层脂质囊泡相结合来制备脂质纳米管网络的方法。

摘要

脂质纳米管（LNT）网络是一种体外模型系统，可用于研究分子运输和脂质生物物理学，与真核细胞中广泛存在的脂质小管具有相关性。然而，体内LNT是高度非平衡结构，其组装、维持和重组需要化学能和分子马达的参与。此外，体内LNT的组成十分复杂，包含多种不同的脂质种类。传统的LNT挤出方法既耗时又费力，且需要借助光镊、微珠和微移液管等工具，从巨型脂质囊泡中强行拉出纳米管。本文介绍了一种滑动运动分析法（GMA）的操作方案，该方法利用驱动蛋白驱动的微管运动，可从巨型单层脂质囊泡（GUVs）快速生成大规模的LNT网络。使用该方法可由多种脂质配方形成LNT网络，模拟生物LNT的复杂性，使其在脂质生物物理学和膜相关运输的体外研究中具有更高的应用价值。此外，该方法可在短时间内（<30分钟）利用常规实验室设备可靠地生成LNT网络。通过调整用于构建网络的GUVs的脂质组成，还可调控LNT网络的长度、宽度及脂质分布等特性。

引言

脂质纳米管（LNT）网络的制备在体外研究非平衡态脂质结构方面正受到越来越多的关注^1,2,3。细胞利用脂质小管进行蛋白质⁴和核酸⁵的扩散性运输，以及细胞间的通讯^6,7。内质网和高尔基体尤其引人关注，因为这些膜结合细胞器是脂质和蛋白质合成的主要场所，也是这些重要生物分子在细胞质内运输的关键部位^8,9。这些细胞器的膜由多种脂质组成，包括鞘脂、胆固醇和磷脂¹⁰，这些成分最终决定了其功能特性。因此，为了更真实地模拟并研究这些细胞器，需要利用含有日益复杂脂质配方的囊泡在体外构建LNT¹¹。

巨大单层囊泡（GUVs）被广泛用于研究脂质膜行为，因为它们可以通过包含胆固醇、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇（PI）的复杂配方可靠地合成^12,13。本文描述了一种利用滑动运动测定法（GMA）从具有不同脂质配方的GUVs制备脂质纳米管（LNTs）的方法，在该方法中，LNTs的挤出依赖于驱动GUVs的驱动蛋白马达和微管丝所做功。在此系统中，吸附在表面的驱动蛋白马达推动生物素化的微管，将ATP水解产生的化学能转化为有用功（具体而言，即从生物素化囊泡中挤出LNTs）¹¹。所形成的LNT网络为研究脂质相差异对LNT形态变化的影响提供了一个模型平台。

简而言之，将驱动蛋白分子溶于含酪蛋白的溶液中并引入流动池，使驱动蛋白吸附在流动池的玻璃表面。随后，将含有ATP的生物素化微管溶液注入流动池，使其与驱动蛋白结合并启动运动。接着，向流动池中引入链霉亲和素溶液，使其非共价结合至微管上。最后，将含有生物素化脂质的GUVs（大单层囊泡）引入流动池，使其与链霉亲和素包被的微管结合，并在15–30分钟内延伸出脂纳米管（LNT），形成大规模网络结构。该方法利用常规实验室设备和试剂，以较低成本即可制备出大范围、具有分支结构的LNT网络¹¹。

方案

1. 储存微管溶液的制备

警告：在整个实验过程中，必须始终佩戴安全护目镜、手套和实验服。

1. 配制5× BRB80缓冲液：将24.19 g PIPES（哌嗪-N,N′-双[2-乙磺酸]）和0.38 g EGTA（乙二醇双[β-氨基乙醚]四乙酸）加入1 L玻璃瓶中。加入1 mL 1 M MgCl₂，用KOH调节pH至6.9，再加入去离子水定容至500 mL。
2. 配制100 mM GTP储备液：称取52 mg GTP，溶于1 mL蒸馏水中。将100 mM溶液分装为每份20 µL，于-20 °C保存。
3. 配制GPEM溶液：取200 µL 5× BRB80缓冲液、10 µL 100 mM GTP溶液、100 µL 100%甘油和600 µL去离子水混合均匀。将GPEM溶液分装为每份100 µL，于-20 °C保存。
4. 通过将市售冻干微管蛋白小瓶（分别含生物素标记、荧光标记和未标记微管蛋白各一瓶）用预冷（4 °C）的GPEM溶液重悬，配制成5 mg/mL的微管蛋白储备液，以制备微管溶液。
5. 进行微管聚合：取4 µL生物素标记微管蛋白、4 µL荧光标记微管蛋白和24 µL未标记微管蛋白（浓度均为5 mg/mL），混合得到终体积为32 µL、比例为1:1:6的混合液。将混合液置于冰上。将微管蛋白混合液分装为每份2 µL，于-80 °C保存备用。
   注意：高效的微管聚合要求微管蛋白浓度等于或高于临界浓度（5 mg/mL）¹⁴。此处选择的微管蛋白比例经过优化，可确保生物素化微管蛋白浓度足够高，以有效结合链霉亲和素和GUVs，同时荧光标记微管蛋白浓度也足够高，便于显微镜下表征。

2. 巨大单层囊泡（GUVs）的制备

1. 琼脂糖薄膜制备
   注意：本方案改编自 Greene 等人¹⁵。
   1. 在 250 mL 锥形瓶中，将 1 g 琼脂糖溶于 100 mL 去离子水中，配制成 1% w/v 溶液。使用标准微波炉加热琼脂糖溶液 1–2 分钟。
      注意：琼脂糖完全溶解后，溶液将变为半透明。使用前让溶液冷却至 65–75 °C。
   2. 使用剪切过的 1,000 µL 移液枪头，将 300–400 µL 琼脂糖溶液转移至 25 mm × 25 mm 玻璃盖玻片上。用戴手套的手指夹住盖玻片边缘，再用另一支 1,000 µL 移液枪头将熔化的琼脂糖均匀涂布于盖玻片表面。
      注意：保持琼脂糖温度在 65–75 °C 可使其在盖玻片表面更易均匀铺展。
   3. 将涂有琼脂糖的盖玻片置于 37 °C 培养箱中干燥至少 2 小时，直至琼脂糖变为透明。将盖玻片琼脂糖涂层面向上放置于洁净表面（如无尘纸或石蜡膜）上，在室温（RT）下保存。
2. 脂质配方
   1. 从 -20 °C 冰箱中取出溶解于氯仿中的脂质，置于化学通风橱中，使其恢复至室温（RT）。
   2. 使用以下公式计算配方中各组分脂质所需脂质储备液体积：
      
      其中：V_lipid 为所用脂质体积，mol% 为该脂质组分的摩尔百分比，n 为配方中脂质总摩尔数，M 为脂质储备液的摩尔浓度。
      注意：例如，若配方中含有 45 mol% 的 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DOPC），其储备液浓度为 12.72 mM，配方中总脂质为 1 微摩尔，则所需 DOPC 储备液体积为：
      
   3. 在化学通风橱中，将各脂质按计算出的比例混合于玻璃小瓶中。
   4. 将 30 µL 脂质溶液滴加到置于预热热板（温度设定高于配方中饱和脂质组分的熔点，例如，若脂质的 T_m 为 40 °C，则热板温度设为 50 °C）上的琼脂糖涂层盖玻片表面。
   5. 使用 18 G 针头的长边以环形运动方式将溶液在琼脂糖薄膜上铺展，直至氯仿完全挥发，形成均匀的脂质层。操作时用戴手套的手指夹住盖玻片边缘。
      注意：应小心操作，避免针头损伤琼脂糖层。
   6. 将带有琼脂糖层和脂质膜的盖玻片放入铝箔包裹的培养皿中，膜面朝上，并将培养皿置于真空干燥器中至少 2 小时，以去除残留溶剂。
3. 在此期间，通过将 1.92 g 蔗糖溶于 10 mL 去离子水中，配制 560 mM 蔗糖溶液。
   注意：蔗糖溶液的浓度取决于 GUVs 稀释所用缓冲液的渗透压。通常，蔗糖溶液的渗透压应比 GUVs 稀释所用缓冲液（特别是运动缓冲液，见步骤 3.11）高出不超过 10%。
4. GUV 形成
   1. 将粘附腔室轻轻按压在脂质膜朝上的脂质涂层盖玻片上，使粘附腔室与盖玻片紧密贴合，形成密封结构。
   2. 向腔室内加入 400 µL 560 mM 蔗糖溶液（在步骤 2.3 中配制）。
   3. 将盖玻片放入湿度培养室中，并盖上盖子。
   4. 将湿度培养室置于预热热板上，热板温度设定高于配方中饱和脂质组分的熔点。
   5. 让囊泡形成至少 1 小时后再进行回收。
      注意：可使用 40 倍空气物镜通过荧光显微镜观察囊泡形成情况。

3. 运动性检测储备液与试剂的制备

1. 酪蛋白母液的制备
   1. 将 3 g 干酪蛋白加入 50 mL 圆锥形离心管中，加入 30 mL 1x BRB80，旋转混匀直至溶液变黏稠。在 15,000 x g 条件下离心 30 分钟。
   2. 将上清液转移至另一支 50 mL 圆锥形离心管中，弃去沉淀。使用 1 µm 注射器滤器过滤溶液，收集至 50 mL 圆锥形离心管中。再用 0.2 µm 滤器过滤，收集至另一支 50 mL 圆锥形离心管中。
   3. 使用紫外-可见分光光度计和石英比色皿，在 280 nm 处测定吸光度，以确定蛋白浓度。
   4. 使用以下公式计算酪蛋白浓度（单位为 mg/mL）：
      
   5. 用 1x BRB80 将溶液稀释至 20 mg/mL，分装为 100 µL 每份，于 -20 °C 保存。
2. 通过将 2 mg 葡萄糖氧化酶与 1 mL 1x BRB80 混合，制备葡萄糖氧化酶（2 mg/mL）母液。分装为 100 µL 每份，于 -20 °C 保存。
3. 通过将 0.8 mg 过氧化氢酶与 1 mL 1x BRB80 混合，制备过氧化氢酶（0.8 mg/mL）母液。分装为 100 µL 每份，于 -20 °C 保存。
4. 将 0.3 g D-葡萄糖悬浮于 1 mL 去离子水中，制备 2 M 葡萄糖溶液。分装为 100 µL 每份，于 -20 °C 保存。
5. 将 0.015 g DTT 溶于 1 mL 去离子水中，制备 100 mM DTT 母液。分装为 100 µL 每份，于 -20 °C 保存。
6. 将 0.055 g 二钠 ATP 溶于 1 mL 100 mM MgCl₂ 溶液中，制备 100 mM Mg-ATP 母液。分装为 100 µL 每份，于 -20 °C 保存。
7. 将 0.055 g AMP-PNP 溶于 1 mL 100 mM MgCl₂ 溶液中，制备 100 mM Mg-AMP-PNP 溶液，分装为 100 µL 每份，于 -20 °C 保存。
8. 将 25.03 mg Trolox 加入 1 mL 甲醇中，制备 100 mM Trolox 溶液，于 -20 °C 保存。
9. 将 1 mg 链霉亲和素加入 100 µL BRB80 中，制备 10 mg/mL 链霉亲和素溶液，分装为 2 µL 每份，于 -80 °C 保存。
10. 将 200 µL 5x BRB80、20 µL 酪蛋白溶液、10 µL MgATP 溶液、10 µL Trolox、5 µL 紫杉醇溶液和 765 µL 去离子水混合，制备 BRB90CAT 溶液，于 4 °C 保存。
11. 将 192 µL BRB80CAT、2 µL D-葡萄糖溶液、2 µL 葡萄糖氧化酶溶液、2 µL DTT 溶液和 2 µL 过氧化氢酶溶液混合，制备运动缓冲液，于 4 °C 保存。
12. 将驱动蛋白母液用 BRB80CAT 稀释（例如，将 2 µL 50 mM 驱动蛋白溶液加入 98 µL BRB80CAT 中），制备 1 µM 驱动蛋白溶液，于 4 °C 保存。
13. 将 10 µL 稳定化微管加入 90 µL 室温 BRB80CAT 中，稀释制备 10 µg/mL 微管溶液，于室温保存。
14. 将 0.1 µL 10 mg/mL 链霉亲和素溶液加入 99.9 µL 运动缓冲液中，制备 10 µg/mL 链霉亲和素溶液，于 4 °C 保存。
15. 将 5 µL GUV 母液加入 55 µL 运动缓冲液中稀释，制备 12x GUV 溶液，于 4 °C 保存。
16. 微管蛋白聚合形成微管
    1. 从 -80 °C 冰箱中取出预先制备的 2 µL 微管蛋白样品（步骤 1.5 制备），置于 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。
    2. 将 1.71 mg 紫杉醇溶于 1 mL 无水 DMSO 中，制备 2 mM 紫杉醇溶液，分装为 10 µL 每份，于 -20 °C 保存。
    3. 将 99.5 µL 1x BRB80 与 0.5 µL 2 mM 紫杉醇混合，新鲜配制 BRB80T 溶液。将 100 µL BRB80T 预热至 37 °C 水浴中。
    4. 30 分钟后，将 100 µL BRB80T 加入微管蛋白样品中以稳定微管。于室温保存。

4. 菌体滑行运动检测（GMA）

1. 通过在载玻片上粘贴两条双面胶带（间距为 5 mm）来制备流动室。重复此过程，直至每条胶带均达到三层厚度。
2. 将盖玻片置于胶带上方，然后用镊子或笔轻轻按压盖玻片与胶带的接触面，以确保充分粘附。
   注意：通道尺寸应为宽 5 mm、长 25 mm、高 300 mm。
3. 将 30 µL 的 1 mm 驱动蛋白溶液（按步骤 3.12 制备）用移液器加入流动室中，孵育 5 分钟。
   注意：酪蛋白在盖玻片/载玻片表面形成双层结构，有助于驱动蛋白尾部与表面的结合。
4. 将 30 µL 的 10 µg/mL 微管溶液（按步骤 3.13 制备）用移液器加入流动室中，同时在流动通道的另一端轻轻按压实验室擦拭纸，以促进溶液置换。孵育 5 分钟。
5. 在室温下用 1× 运动缓冲液（按步骤 3.11 制备）清洗流动室 1–3 次。
   注意：此时可使用 40× 空气物镜进行荧光显微镜观察，以确认微管的附着及运动情况。微管表现为长度达数十微米的荧光细丝，在表面以约 0.5 μm/s 的速度移动（滑行）（图 1）。
6. 将 30 µL 的 10 µg/mL 链霉亲和素溶液（按步骤 3.14 制备）用移液器加入流动室中，同时在流动通道的另一端轻轻按压实验室擦拭纸，以促进溶液置换。孵育 10 分钟。
7. 将 30 µL 的 12× GUV 溶液（按步骤 3.15 制备）通过流动方式引入流动室，同时在流动通道的另一端轻轻按压实验室擦拭纸，以促进溶液置换。孵育 30 分钟。
8. 加入 2 µL 的 100 mM AMP-PNP 溶液（按步骤 3.7 制备）以终止运动，随后用密封剂密封流动室。

5. LNT 网络表征

1. 将流动腔室转移至倒置显微镜上进行成像。
2. 根据所用荧光脂质或微管蛋白的波长选择合适的滤光片组。例如，当使用Texas Red标记的脂质时，应采用560 nm/25 nm激发滤光片和607 nm/36 nm发射滤光片。
3. 使用100倍油镜聚焦于盖玻片表面。
4. 利用荧光显微镜对LNT网络进行成像。
   注意：LNT是从较大囊泡延伸出的线性结构。LNT远小于GUV，且荧光信号较弱。因此，必须相应调整曝光时间和对比度以清晰成像LNT。这些调整可能导致GUV过曝，因此建议独立表征GUV的膜层数和相分离情况。
5. 将显微镜聚焦于感兴趣的网络区域，并采集标准图像或拼接图像。
6. 调整曝光时间及中性密度滤光片，以实现对LNT的成像并尽量减少GUV的饱和曝光。分别在红色和绿色通道中采集图像。
   注意：此处红色通道用于观察Texas Red标记的脂质，绿色通道用于观察微管（例如Oregon Green标记的脂质和HiLyte488染料）。
7. 通过叠加红色和绿色通道生成复合图像（图1）。
8. LNT网络的表征：测量LNT长度
   1. 使用ImageJ等图像分析软件打开所采集的图像。
   2. 利用“设定标尺”功能对显微镜图像进行尺度校准，输入像素与毫米之间的换算系数，然后点击确定。
      注意：该换算系数取决于显微镜型号、物镜和相机，可通过显微镜校准载玻片获得，通常以像素/毫米表示。
   3. 使用多点直线工具从母体GUV开始测量纳米管的长度。按住Ctrl + M以记录长度。
   4. 继续按照上述步骤测量各个独立管状结构的长度。图像处理工具会将每次新测量的结果自动保存在结果窗口中。
   5. 每次绘制完线条后按住Ctrl + D，以便标记已测量的管状结构。
9. 测量LNT厚度（图2）
   1. 在ImageJ中打开图像，然后在图像选项卡下选择阈值功能。
   2. 点击应用以应用阈值。
   3. 在目标管状结构上绘制一个已知长度的矩形（黑色像素值为0，红色像素值为255）。
   4. 测量该区域的积分密度。
   5. 将密度除以LNT的长度（以像素为单位），得到厚度（以像素为单位）。
      注意：只有在成像参数和阈值设置完全一致的情况下，不同图像间的厚度测量结果才可相互比较。
10. 确定LNT节点中的脂质分布情况（图3）
    1. 在ImageJ中打开图像。
    2. 使用直线工具在目标节点上画一条线。
    3. 在Oregon Green和Texas Red两个通道中测量该节点的强度。
    4. 将直线移至LNT区域，并在Oregon Green和Texas Red两个通道中测量LNT的强度。

结果

使用所述方案制备了LNT网络（图4），该方案利用驱动蛋白介导的微管运输，使GUVs向外延伸形成LNT。简言之，采用蔗糖溶液通过琼脂糖凝胶再水化法制备GUVs，微管在GPEM溶液中聚合，并在BRB80T缓冲液中稳定。随后，将驱动蛋白引入流动池，在盖玻片表面形成一层具有活性的驱动蛋白层。接着引入微管，并加入链霉亲和素溶液，以促进生物素化脂质与GUVs之间的结合（GUVs随后被引入）。

在流动池中加入所有组分后，让LNT形成30分钟，随后引入AMP-PNP以终止运动。然后使用100倍油镜在落射荧光显微镜下对LNT进行成像。LNT可能相当大，因此也可使用较低倍数的物镜来捕获较大的LNT。LNT网络的特征是从GUV延伸并连接GUV的细长、网状突起。LNT的数量和分支程度取决于多种因素，包括表面微管的密度、链霉亲和素浓度以及存在的GUV数量。

该方法可生成由固相、液态无序相和液态有序相组成的GUVs和LNTs，以及在多种不同组分条件下呈现这些相共存的相分离囊泡（

讨论

LNT网络是用于体外研究膜特性和生物分子（如跨膜蛋白）转运的有用工具。此外，使用复杂的脂质配方构建LNT网络可实现更具生物学相关性的研究。以往的构建研究要么采用1）简单的脂质配方和多层囊泡，要么采用2）更为繁琐的运动技术，从含有复杂脂质配方的GUVs中构建网络。本文所述方法能够高效地利用复杂脂质配方和GUVs，结合廉价的试剂与设备，大规模制备LNT网络。因此，该方法可用于研究多种生物学过程，包括相分离和膜蛋白运输。本实验方案采用一种体外模型，其中LNT的组成可被最优调节，以模拟其生物学对应结构（例如高尔基体）。

本文所述方法中LNT网络的形成具有多种优势。例如，使用冻干微管蛋白可快速、简便地聚合微管，并且在紫杉醇稳定后，微管在室温下至少可稳定保持1–2周¹⁶。因此，微管可被便捷地用于驱动LNT的挤出及大规模网络的形成^1,2。此外，基于先前方案稍作修改后，可快速制备由多种脂质组分（即不饱和脂质、饱和脂质和胆固醇）组成的G...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100x/1.4 数值孔径油浸物镜	Olympus	1-U2B836	奥林巴斯 UPlanSApo 100x/1.40 油镜 无限远校正，RMS 螺纹 工作距离 0.12 mm
3.0 ND 滤光片	奥林巴斯		中性密度滤光片
AMP-PNP	Sigma-Aldrich	A2647	(β,γ-咪唑代腺苷5′三磷酸
ATP	Sigma-Aldrich	A7699	腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物 BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 滤光片组	Semrock	LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000	BrightLine Pinkel滤光片组，专为DAPI、FITC、TRITC、Cy5优化 &Cy7 及其他类似荧光染料，使用基于 LED 的光源照射
酪蛋白	Sigma-Aldrich	22090	微生物学用酪蛋白水解物
过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C9322	牛肝过氧化氢酶
氯仿	Sigma-Aldrich	288306	无水氯仿含有0.5–1.0%乙醇作为稳定剂
胆固醇	Avanti	700000P	胆固醇（绵羊毛， >98%）（粉末）
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021	D-(+)-葡萄糖粉末，BioReagent，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养，适用于植物细胞培养 ≥99.5%
DOPC	Avanti	850375C	1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（溶于氯仿）
DOPE-Biotin	Avanti	870282C	1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素基)（钠盐）
DPPC	Avanti	850355P	1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（粉末）
DPPE-生物素	Avanti	870285P	1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素基)（钠盐）
DTT	Sigma-Aldrich	43816	DL-二硫苏糖醇溶液 1 M
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，乙二胺四乙酸的乙二醇醚，乙二醇醚二胺四乙酸
葡萄糖氧化酶	Sigma-Aldrich	G6125	来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶 II型， ≥10,000 单位/克 固体（未添加氧气）
甘油	Fisher	G33	甘油（Certified ACS），Fisher Chemical
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	鸟苷-5′′三磷酸钠盐水合物
IX-81 奥林巴斯显微镜	Olympus	N/A	奥林巴斯IX81倒置显微镜
KOH	Sigma-Aldrich	1050121000	氢氧化钾
氯化镁	Sigma-Aldrich	M1028	1.00 M 氯化镁溶液
Orca Flash 4.0 数字相机	Hamamatsu	C13440-20CU	ORCA-Flash 4.0 V3 数字CMOS相机
俄勒冈绿-DHPE	Invitrogen	O12650	俄勒冈绿 488 1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺
紫杉醇	ThermoFisher	P3456	紫杉醇（Taxol 等效物）— 仅用于研究用途
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757	1,4-哌嗪二乙磺酸，哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)，哌嗪-N,N′-双(2-乙烷磺酸)
Texas Red-DHPE	Invitrogen	T1395MP	Texas Red 1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺， 三乙基铵盐
Trolox	Sigma-Aldrich	238813	(±6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸
微管蛋白，生物素	细胞骨架	T333P	微管蛋白（生物素标记）猪脑来源
微管蛋白，Hy-Lite 488	细胞骨架	TL488M	微管蛋白（荧光 HiLyte 488 标记）猪脑来源
微管蛋白，未标记	细胞骨架	T240	微管蛋白 猪脑