利用驱动蛋白运动分析法构建多组分脂质纳米管网络

摘要

本方案描述了一种利用驱动蛋白滑动运动与巨大单层脂质囊泡相结合来制备脂质纳米管网络的方法。

摘要

脂质纳米管（LNT）网络是一种体外模型系统，可用于研究分子运输和脂质生物物理学，与真核细胞中广泛存在的脂质小管具有相关性。然而，体内LNT是高度非平衡结构，其组装、维持和重组需要化学能和分子马达的参与。此外，体内LNT的组成十分复杂，包含多种不同的脂质种类。传统的LNT挤出方法既耗时又费力，且需要借助光镊、微珠和微移液管等工具，从巨型脂质囊泡中强行拉出纳米管。本文介绍了一种滑动运动分析法（GMA）的操作方案，该方法利用驱动蛋白驱动的微管运动，可从巨型单层脂质囊泡（GUVs）快速生成大规模的LNT网络。使用该方法可由多种脂质配方形成LNT网络，模拟生物LNT的复杂性，使其在脂质生物物理学和膜相关运输的体外研究中具有更高的应用价值。此外，该方法可在短时间内（<30分钟）利用常规实验室设备可靠地生成LNT网络。通过调整用于构建网络的GUVs的脂质组成，还可调控LNT网络的长度、宽度及脂质分布等特性。

引言

脂质纳米管（LNT）网络的制备在体外研究非平衡态脂质结构方面正受到越来越多的关注^1,2,3。细胞利用脂质小管进行蛋白质⁴和核酸⁵的扩散性运输，以及细胞间的通讯^6,7。内质网和高尔基体尤其引人关注，因为这些膜结合细胞器是脂质和蛋白质合成的主要场所，也是这些重要生物分子在细胞质内运输的关键部位^8,9。这些细胞器的膜由多种脂质组成，包括鞘脂、胆固醇和磷脂¹⁰，这些成分最终决定了其功能特性。因此，为了更真实地模拟并研究这些细胞器，需要利用含有日益复杂脂质配方的囊泡在体外构建LNT¹¹。

巨大单层囊泡（GUVs）被广泛用于研究脂质膜行为，因为它们可以通过包含胆固醇、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇（PI）的复杂配方可靠地合成

方案

1. 微管蛋白储备溶液的制备

注意：在整个实验过程中，应始终佩戴安全护目镜、手套和实验服。

1. 配制 5x BRB80 缓冲液：将 24.19 g PIPES（哌嗪-N,N′-双[2-乙磺酸]）和 0.38 g EGTA（乙二醇双[β-氨基乙醚]四乙酸）加入 1 L 玻璃瓶中。加入 1 mL 1 M MgCl₂，用 KOH 调节 pH 至 6.9，再加入去离子水定容至 500 mL。
2. 配制 100 mM GTP 储存液：称取 52 mg GTP，溶于 1 mL 蒸馏水中。将 100 mM 溶液分装为每份 20 µL，于 -20 °C 保存。
3. 配制 GPEM 溶液：取 200 µL 5x BRB80、10 µL 100 mM GTP 溶液、100 µL 100% 甘油和 600 µL 去离子水混合。将 GPEM 溶液分装为每份 100 µL，于 -20 °C 保存。
4. 通过将市售的冻干微管蛋白小瓶（分别含生物素标记、荧光标记和未标记微管蛋白各一瓶）用预冷（4 °C）的 GPEM 溶液重悬，配制微管溶液，使其储存浓度为 5 mg/mL。
5. 通过混合 4 µL 生物素标记微管蛋白、4 µL 荧光标记微管蛋白和 24 µL 未标记微管蛋白（浓度均为 5 mg/mL），以 1:1:6 的比例在终体积 32 mL 中进行微管聚合。将混合物置于冰上。将微管蛋白混合液分装为每....

结果

使用所述方案制备了LNT网络（图4），该方案利用驱动蛋白介导的微管运输，从GUV中挤出LNT。简言之，采用蔗糖溶液通过琼脂糖凝胶再水化法制备GUV，微管在GPEM溶液中聚合，并在BRB80T缓冲液中稳定。随后，将驱动蛋白引入流动池，在盖玻片表面形成一层具有活性的驱动蛋白层。接着引入微管，并加入链霉亲和素溶液，以促进生物素化脂质与GUV之间的结合（GUV随后被引入）。

在流动池中加入所有组分后，允许 LNTs 形成 30 分钟，随后引入 AMP-PNP 以终止运动。然后使用 100 倍油镜在落射荧光显微镜下对 LNTs 进行成像。由于 LNTs 可能较大，也可使用较低倍率的物镜以捕获更大的 LNTs。LNT 网络的特征是由 GUVs 延伸出的细长、网状突起相互连接而成。LNTs 的数量和分支程度受多种因素影响，包括微管在表面的密度、链霉亲和素浓度以及存在的 GUVs 数量。

该方法可生成由固相、液态无序相和液态有序相组成的GUVs和LNTs，以及在多种不同组分条件下呈现.......

讨论

LNT网络是用于体外研究膜特性和生物分子（如跨膜蛋白）转运的有用工具。此外，使用复杂的脂质配方构建LNT网络可实现更具生物学相关性的研究。以往的构建研究要么采用1）简单的脂质配方和多层囊泡，要么采用2）更为繁琐的运动技术，从含有复杂脂质配方的GUVs中构建网络。本文所述方法能够高效地利用复杂脂质配方和GUVs，结合廉价的试剂与设备，大规模制备LNT网络。因此，该方法可用于研究多种生物学过程，包括相分离和膜蛋白运输。本实验方案采用一种体外模型，其中LNT的组成可被最优调节，以模拟其生物学对应结构（例如高尔基体）。

本文所述方法中LNT网络的形成具有多种优势。例如，使用冻干微管蛋白可快速、简便地聚合微管，并且在紫杉醇稳定后，微管在室温下至少可稳定保持1–2周¹⁶。因此，微管可被便捷地用于驱动LNT的挤出及大规模网络的形成^1,2。此外，基于先前方案稍作修改后，可快速制备由多种脂质组分（即不饱和脂质、饱和脂质和胆固醇）组成的G.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100x/1.4 数值孔径油浸物镜	Olympus	1-U2B836	奥林巴斯 UPlanSApo 100x/1.40 油镜 无限远校正，RMS 螺纹 工作距离 0.12 mm
3.0 ND 滤光片	奥林巴斯		中性密度滤光片
AMP-PNP	Sigma-Aldrich	A2647	(β,γ-咪唑代腺苷5′三磷酸
ATP	Sigma-Aldrich	A7699	腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物 BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 滤光片组	Semrock	LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000	BrightLine Pinkel滤光片组，专为DAPI、FITC、TRITC、Cy5优化 &Cy7 及其他类似荧光染料，使用基于 LED 的光源照射
酪蛋白	Sigma-Aldrich	22090	微生物学用酪蛋白水解物
过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C9322	牛肝过氧化氢酶
氯仿	Sigma-Aldrich	288306	无水氯仿含有0.5–1.0%乙醇作为稳定剂
胆固醇	Avanti	700000P	胆固醇（绵羊毛， >98%）（粉末）
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021	D-(+)-葡萄糖粉末，BioReagent，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养，适用于植物细胞培养 ≥99.5%
DOPC	Avanti	850375C	1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（溶于氯仿）
DOPE-Biotin	Avanti	870282C	1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素基)（钠盐）
DPPC	Avanti	850355P	1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（粉末）
DPPE-生物素	Avanti	870285P	1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素基)（钠盐）
DTT	Sigma-Aldrich	43816	DL-二硫苏糖醇溶液 1 M
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，乙二胺四乙酸的乙二醇醚，乙二醇醚二胺四乙酸
葡萄糖氧化酶	Sigma-Aldrich	G6125	来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶 II型， ≥10,000 单位/克 固体（未添加氧气）
甘油	Fisher	G33	甘油（Certified ACS），Fisher Chemical
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	鸟苷-5′′三磷酸钠盐水合物
IX-81 奥林巴斯显微镜	Olympus	N/A	奥林巴斯IX81倒置显微镜
KOH	Sigma-Aldrich	1050121000	氢氧化钾
氯化镁	Sigma-Aldrich	M1028	1.00 M 氯化镁溶液
Orca Flash 4.0 数字相机	Hamamatsu	C13440-20CU	ORCA-Flash 4.0 V3 数字CMOS相机
俄勒冈绿-DHPE	Invitrogen	O12650	俄勒冈绿 488 1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺
紫杉醇	ThermoFisher	P3456	紫杉醇（Taxol 等效物）— 仅用于研究用途
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757	1,4-哌嗪二乙磺酸，哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)，哌嗪-N,N′-双(2-乙烷磺酸)
Texas Red-DHPE	Invitrogen	T1395MP	Texas Red 1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺， 三乙基铵盐
Trolox	Sigma-Aldrich	238813	(±6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸
微管蛋白，生物素	细胞骨架	T333P	微管蛋白（生物素标记）猪脑来源
微管蛋白，Hy-Lite 488	细胞骨架	TL488M	微管蛋白（荧光 HiLyte 488 标记）猪脑来源
微管蛋白，未标记	细胞骨架	T240	微管蛋白 猪脑