获得成纤维细胞的纯种群体对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。本文详细描述了一种从正常和损伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，并通过免疫荧光、逆转录PCR（RTPCR）、荧光辅助细胞分选以及胶原凝胶收缩实验对细胞的纯度和功能特性进行表征。
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本文内容
摘要
摘要
心脏在受到损伤后发生的心肌纤维化是一种参与伤口愈合的生理反应。目前已有研究致力于探索并靶向能够减轻纤维化的成纤维细胞亚群。然而，由于缺乏普遍认可的可用于鉴定静息态和活化态成纤维细胞的特异性标志物，成纤维细胞的相关研究仍受到限制。成纤维细胞是一类异质性细胞群体，这使其难以被分离和鉴定。本方案介绍了三种不同的方法，用于从小鼠未受损和受损心脏中富集成纤维细胞和肌成纤维细胞。采用标准化且可靠的成纤维细胞分离方案，将有助于深入研究其在稳态维持以及纤维化调控中的作用。
引言
心脏成纤维细胞是一类起源于间充质的细胞，在维持心脏电传导和机械力方面发挥重要作用，同时在稳态条件下维持心脏结构1。在心脏损伤后，这些细胞被激活、增殖，并产生细胞外基质（ECM）蛋白2。许多临床前研究揭示，成纤维细胞是维持受损心脏结构完整性的关键细胞调节者3，同时也是导致细胞外基质蛋白不受控制地生成和沉积的主要效应细胞，最终引起僵硬瘢痕形成和心力衰竭4。成纤维细胞是一类异质性细胞群体，这使得区分其修复性功能与促纤维化的不良适应特性变得具有挑战性。近期研究已明确心肌损伤后两种不同成纤维细胞亚型的功能异质性，提示有可能分离出不同的成纤维细胞亚型，并研究其在伤口愈合中的作用5。
获得纯的成纤维细胞群体对于明确其在修复和纤维化中的功能作用至关重要。然而，由于多种成纤维细胞标志物也会识别其他细胞类型，因此难以分离出高度纯化的成纤维细胞群体6。已有若干精巧的研究设计出有效方法，用于从无损伤和受损心肌组织中分离心脏成纤维细胞。其中最常用且最为成熟的方法是通过酶消化组织后，利用选择性贴壁法富集成纤维细胞7。
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方案
本研究严格遵守美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议。范德堡大学机构动物护理和使用委员会已批准该实验方案（方案编号：M1600076-01）。
1. 心脏解剖
- 溶液配制
- KHB缓冲液
- 使用磁力搅拌器，将9.4 g Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）粉末缓慢溶解于900 mL去离子水（DDI水）中。
注意：若搅拌过快或时间过长，缓冲液可能发生沉淀。在成纤维细胞分离过程中，KHB缓冲液必须保持低温。 - 加入2.9 mM CaCl2和24 mM NaHCO3。用dH2O定容至1 L，并调节pH至7.2–7.3。
- 使用无菌滤器（0.22 µm）过滤后，于4 °C保存，最长可保存4周。在分离过程中需保持冰上或4 °C保存。
- 使用磁力搅拌器，将9.4 g Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）粉末缓慢溶解于900 mL去离子水（DDI水）中。
- 胶原酶消化液
- 在成纤维细胞分离当天配制消化液。根据心脏数量确定所需消化液体积，每1个心脏需5 mL消化液。
- 按照生产商说明书配制胶原酶混合物（见材料表）和DNase I。
- 配制20 mL总消化液体积时，向一个空的50 mL锥形管中加入17.5 ....
- KHB缓冲液
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结果
利用αSMA-GFP报告小鼠展示肌成纤维细胞分离的流式设门方案
在αSMA-GFP报告小鼠模型中，未受伤心脏未检测到可识别的GFP+细胞；因此，这些样本被用于在补偿后建立GFP通道背景信号的设门依据（图2）。αSMA+细胞根据心肌梗死（MI）后10天损伤左心室中GFP表达的存在情况进行分选。在损伤后的αSMA-GFP小鼠心脏中，少量内皮细胞（GFP+/CD31+细胞；SD = 3.8% ± 0.0164；n = 5）和造血系细胞（GFP+/CD45+细胞；SD = 3.18% ± 0.0112；n = 5）也表达GFP（图2A）。然而，GFP+/CD31-/CD45-细胞不表达周细胞标志物AN2。
未受伤（静息）和受伤（激活，αSMA+GFP+）细胞均表达成纤维细胞标志物
通过免疫荧.......
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讨论
成纤维细胞是一类具有异质性的细胞，可通过多种标志物进行鉴定。已用于鉴定成纤维细胞的蛋白标志物包括盘状结构域受体2（DDR2）、纤连蛋白、波形蛋白、I型和III型胶原以及Thy115,16,17,18,19,20。其中，波形蛋白可用于鉴定未受损状态下静息的心脏成纤维细胞，而成纤维细胞特异性蛋白1、αSMA和periostin则可用于识别损伤诱导的活化成纤维细胞，其中αSMA是检测活化成纤维细胞最常用的标志物6,12,21。此外，Tcf21和MEF2K4蛋白近年来也.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Ivo Kalajzic 博士提供 αSMA-GFP 小鼠。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家普通医学科学研究所资助（资助号 R01GM118300，S.S.），美国国立卫生研究院下属的国家生物医学成像与生物工程研究所资助（资助号 R21EB019509，P.P.Y.），以及美国心脏协会科学家发展奖资助（资助号 17SDG33630187，S.S.）。流式细胞术分析在范德堡大学医学中心（VUMC）流式细胞术共享资源平台完成，该平台由范德堡英格拉姆癌症中心（P30 CA68485）和范德堡消化疾病研究中心（DK058404）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 丙酮 | |||
| 抗真菌剂（两性霉素B溶解型；Fungizone） | Sigma Aldrich | A9528 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | 9048-46-8 | |
| 氯化钙 | |||
| 柠檬酸盐缓冲液 | |||
| 胶原酶混合液（Liberase Blendzyme 3 TH） | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| 双蒸水（DDI water） | |||
| 去离子水（DI water） | |||
| 含L-谷氨酰胺和HEPES的DMEM-F12培养基 | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I（20U/mL） | BioRad | 7326828 | |
| 不含Ca²⁺和Mg²⁺的杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS） | Gibco | 13190-144 | |
| 70%乙醇 | |||
| FC阻断剂（纯化抗小鼠CD16/CD32） | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| 胎牛血清（FBS） | Life technologies | 16000044 | |
| 10%山羊血清 | |||
| 含Ca²⁺和Mg²⁺的Hank's平衡盐溶液（HBSS） | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit缓冲液粉末 | Sigma | K3753 | |
| 支原体预防剂（Plasmocin） | Invivogen | ant-mpp | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1×磷酸盐缓冲液（PBS） | |||
| 10×红细胞裂解缓冲液 | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade封片剂 | |||
| 叠氮化钠 | |||
| 碳酸氢钠 | |||
| TGFβ | |||
| 台盼蓝染液（0.4%） | Gibco | 15250-061 | |
| Ⅰ型大鼠胶原蛋白 | |||
| 抗体 | |||
| 7AAD（储备液：DMSO中1 mg/mL溶液） | Molecular Probes | A1310 | 稀释比例 = 1:1000；RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | 稀释比例 = 1:200；RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | 稀释比例 = 1:200；RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | 稀释比例 = 1:250；RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | 稀释比例 = 1:250；RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | 稀释比例 = 1:1000；RRID = |
| Ghost dye violet 510（配制：DMSO中1 μL/测试） | Tonbo Biosciences | 13-0870 | 稀释比例 = 1:1000；RRID = |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | 稀释比例 = 1:200；RRID = AB_138404 |
| 山羊抗兔Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | 稀释比例 = 1:200；RRID = AB_2795952 |
| 山羊抗兔FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | 稀释比例 = 1:200；RRID = AB_2307443 |
| 山羊抗大鼠Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 稀释比例 = 1:200；RRID = AB_2534074 |
| 山羊抗大鼠Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | 稀释比例 = 1:200；RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | 稀释比例 = 1:100；RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | 稀释比例 = 1:200；RRID = AB_261856 |
| α-平滑肌肌动蛋白（αSMA） | Sigma Aldrich | A2547 | 稀释比例 = 1:1000；RRID = AB_476701 |
| 成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1） | Millipore 07-2274 | 07-2274 | 稀释比例 = 1:100；RRID = AB_10807552 |
| CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| 抗饲养细胞-APC（MEFSK4） | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | 稀释比例 = 1:100；RRID = AB_2660619 |
| 抗-APC磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| 大鼠IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | 稀释比例 = 1:100；RRID = AB_2661598 |
| 驴抗大鼠Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | 稀释比例 = 1:100 |
| 抗-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | 稀释比例 = 1:11；RRID = AB_2651235 |
| 其他材料 | |||
| 0.22 µm滤器 | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm²细胞培养皿 | Corning | 430167 | |
| 10 mL移液管 | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm细胞筛 | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL移液管 | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL锥形管 | Falcon | 352070 | |
| 6孔板 | Corning | 3506 | |
| 流式细胞术管 | Falcon | 352058 | |
| 镊子 | |||
| 摇床 | |||
| 单刃刀片 | PAL | 62-0177 | |
| 手术剪 | |||
| GFP-αSMA报告基因小鼠 | |||
| MACS分选仪磁铁 | |||
| MACS分离柱 | |||
| 盖玻片 | |||
| Qaigen RNeasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA合成试剂盒 | BioRad | 1708891 | |
| 48孔板 | |||
| 30G针头 | |||
| 三激光流式细胞仪（BD LSRFortessa） | BD Biosciences | ||
| 四激光流式细胞仪（BD FACSAria III） | BD Biosciences | ||
| 流式数据采集软件（BD FACSDiva Software v8.0a） | BD Biosciences | ||
| 流式数据分析软件（FlowJo Software） | BD Biosciences |
参考文献
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Rese....
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