利用细胞内快速光化学氧化蛋白质法表征细胞蛋白质

摘要

本文利用一种称为细胞内快速光化学蛋白质氧化（IC-FPOP）的蛋白质足迹技术，在活细胞中表征蛋白质结构及相互作用位点。

摘要

快速蛋白质光化学氧化（FPOP）是一种羟基自由基蛋白质足迹技术，用于表征蛋白质结构及其相互作用。FPOP 利用波长为 248 nm 的准分子激光器光解过氧化氢，产生羟基自由基。这些自由基可对 20 种氨基酸中的 19 种溶剂暴露的侧链进行氧化修饰。近年来，该方法已被应用于活细胞中（IC-FPOP），以研究蛋白质在其天然环境中的相互作用。在细胞内研究蛋白质能够反映分子间拥挤效应以及多种蛋白质相互作用，而这些在体外实验中往往会被破坏。为此，研究人员设计了一种定制的单细胞流动系统，以减少 IC-FPOP 过程中细胞的聚集和堵塞。该流动系统使细胞逐个通过准分子激光照射区域，从而确保照射条件的一致性。通过将 FPOP 产生的氧化程度与基于晶体结构计算得到的蛋白质溶剂可及性进行比较，IC-FPOP 能够精确探测蛋白质中溶剂可及的侧链区域。

引言

羟基自由基蛋白质足迹法（HRPF）是一种通过羟基自由基产生的共价修饰来探测蛋白质溶剂可及性的方法。当蛋白质结构或蛋白质相互作用发生变化时，氨基酸的溶剂暴露程度会随之改变，从而影响残基被修饰的程度。利用HRPF，已成功在体外研究了蛋白质相互作用^1,2,3以及蛋白质构象变化^4,5,6。目前有多种方法可用于生成HRPF实验所需的羟基自由基，其中之一是快速光化学氧化蛋白质法（FPOP）。FPOP由Hambly和Gross于2005年开发，利用248 nm准分子激光通过光解过氧化氢（H₂O₂）产生羟基自由基⁷。

最近，Espino 等人将FPOP技术的应用扩展至活细胞内的蛋白质结构研究，该方法被称为细胞内FPOP（in-cell FPOP，IC-FPOP）⁸。与体外研究相比，在细胞环境中研究蛋白质能够考虑分子拥挤效应以及多种可能影响蛋白质结构的蛋白质相互作用。此外，该技术具有提供整个蛋白质组快照的优势，可同时获得多个系统的结构信息，从而实现全蛋白质组水平的结构生物学研究。 Furthermore，该技术特别适用于在体外难以研究的蛋白质，例如膜蛋白。

早期对IC-FPOP的研究成功检测了105种在丰度和细胞定位上各不相同的蛋白质。为了改进IC-FPOP方法，Rinas等人开发了一种用于单细胞流动的微流系统⁹。该改进后的流动系统可减少细胞聚集，并提高可用于辐照的H₂O₂量。在最初的流动系统中，细胞在石英管内发生团聚，导致堵塞和辐照不均。通过引入两股鞘液缓冲液流，利用流体动力学原理将细胞聚焦，使其能够单独通过激光照射区域。此外，采用独立的注射泵输送H₂O₂，可更精确地控制并优化暴露时间，从而在无不良影响的情况下使用更高浓度的H₂O₂。同时，缩短孵育时间也有助于限制内源性过氧化氢酶对H₂O₂的降解。通过采用这一新型流动系统，检测到发生FPOP修饰的蛋白质数量增加了13倍，显著拓展了该方法在活细胞中研究多种蛋白质的能力。本实验方案重点描述了一般性的IC-FPOP实验流程，特别是IC-FPOP流动系统的组装过程。

方案

1. 建立IC-FPOP流动系统

1. 开始组装流路系统时，使用切割石将熔融石英管切割至所需尺寸。IC-FPOP 流路系统需要四根 12 cm 和一根 17 cm 的熔融石英管，内径（ID）为 450 µm，外径（OD）为 670 µm；两根 24 cm 和一根 40 cm 的熔融石英管，内径为 75 µm，外径为 360 µm；最后还需要两根 57 cm 的熔融石英管，内径为 150 µm，外径为 360 µm。
   注意：切割石英管时，应轻轻刮去聚酰亚胺涂层，并进行弯折以获得最平整的切口。检查切口是否平直（这是确保不发生堵塞或泄漏的必要条件）。
2. 使用纳米密封套管（适用于外径 360 µm 石英管的套管规格为 0.0155" 内径 × 1/16" 外径，适用于外径 670 µm 石英管的套管规格为 0.027" 内径 × 1/16" 外径），配合 1/16" 外径的超无法兰 PEEK 螺母（1/4-28 平底）和带不锈钢环的超无法兰卡套（Tefzel，ETFE，1/4-28 平底），共设置 15 个连接点。按照制造商的操作说明进行连接组装（图 1）。
3. 将 6 个小圆柱形磁子放入一支 500 µL 注射器中。将该注射器与另一支 500 µL 注射器以及两支 5 mL 注射器用缓冲液充满并排除空气。按照 图 2A 所示位置安装在注射泵上。
   注意：5 mL 注射器比 500 µL 注射器更大，因此需要使用垫片，以便同时固定所有注射器（图 2B）。
4. 调节注射泵推杆，使电机停止时细胞注射器内大约剩余 50 µL 体积，为磁力搅拌子留出空间（图 2C-D）。
   警告：若注射泵对磁子施加压力，可能导致磁子卡住注射器，甚至造成注射器破裂。
5. 使用鲁尔接头，将手动阀连接至每支注射器。按照 图 3 所示方式组装石英管路。
   注意：将含有细胞和 H₂O₂ 的管路从十字接口一侧完全穿至另一侧，然后插入 450 µm 内径的石英管中。5 mL 注射器中的鞘液流速将高于细胞和 H₂O₂ 的流速。通过两侧鞘液的作用，细胞将在流体动力作用下被聚焦成一条单线，以便进行辐照。
6. 将流路系统置于激光器旁。使用打火机烧除 450 µm 内径石英管上的涂层，形成用于激光辐照的观察窗口。
7. 在装有六个磁子的细胞注射器上方放置一个磁力搅拌器。
8. 将注射泵流速设为 492.4 µL/min，以实现最终总流速为 1,083.3 µL/min。用缓冲液冲洗系统三次，以清洗系统并检测是否存在泄漏。
9. 使用凸透镜将准分子激光聚焦到石英管上。聚焦完成后，将一小片纸张置于石英管后方并开启激光，测试辐照窗口。测量纸张被烧蚀的区域。利用辐照窗口尺寸和流速计算所需的激光频率，以获得零排除分数。
   注意：IC-FPOP 实验推荐的激光能量应 ≥120 mJ。当辐照窗口为 2.58 mm、流速为 1083.3 µL/min 时，若要实现零排除分数，频率需设为 44 Hz。以下为已知辐照窗口、流速和排除分数时，计算激光频率所需公式：
   
   其中 w 为体积（单位：nL），x 为激光光斑宽度（单位：mm），y 为石英管内径（单位：µm），v 为总体积（单位：µL），b 为排除分数，a 为流速（单位：µL/min），f 为频率（单位：Hz）。

2. 配制淬灭剂和 H₂O₂

1. 配制淬灭液，其中含 100 mM N-叔丁基-α-苯基亚硝基化合物（PBN）和 100 mM N,N'-二甲基硫脲（DMTU）。将 11 mL 淬灭液分装至每份样品，置于 50 mL 锥形管中。
2. 将 H₂O₂ 稀释至 200 mM。每份样品需 500 µL H₂O₂。
   注意：淬灭液可于实验前一天配制，避光保存于 4 °C 过夜。H₂O₂ 应在实验当天新鲜配制。

3. 收集细胞

1. 将细胞在T175培养瓶中培养至约70-90%汇合度。
2. 移除培养基，并用缓冲液冲洗。
   注意：常用的缓冲液包括细胞培养级的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）或亨克氏平衡盐溶液（HBSS）。
3. 使用胰蛋白酶-EDTA或细胞刮刀使细胞脱离培养表面。
4. 细胞脱落后，用10 mL缓冲液重悬并进行细胞计数。
5. 离心沉淀细胞，弃去上清液（包括缓冲液和胰蛋白酶-EDTA），再重悬于缓冲液中，调整细胞浓度至2 × 10⁶ 个细胞/mL。
6. 每份样品分装500 µL细胞悬液。
   注意：每个实验条件至少制备3份激光处理样品和3份无激光对照样品。

4. 执行IC-FPOP

1. 用缓冲液填充两个 5 mL 注射器，用含细胞的磁珠填充 500 µL 注射器，用 H₂O₂ 填充最后一个 500 µL 注射器。开启磁力搅拌器。
2. 向一份淬灭液中加入 220 µL 二甲基亚砜（DMSO），轻轻混匀，并置于流动系统后方用于收集辐照后的样品。添加 DMSO 可抑制内源性甲硫氨酸亚砜还原酶的活性。
3. 开启激光器，等待 7 秒后，启动流动系统。
4. 当样品流动完成后，关闭激光器，将收集到的样品与淬灭液轻轻混合。在执行步骤 4.5 和 4.6 期间将该样品暂时放置一旁。
5. 用细胞所悬浮的缓冲液填充全部四个注射器，并通过流动系统进行冲洗。
6. 系统冲洗完成后，重复步骤 4.1 和 4.2。启动流动系统但不进行辐照。此为无激光对照组，用于评估细胞中背景氧化水平。
7. 在运行下一个样品的同时，将前一个样品在 450–800 × g 条件下离心 5 分钟，去除上清液，并用 100 µL 细胞裂解缓冲液（如放射免疫沉淀分析缓冲液，RIPA 缓冲液）重悬沉淀。
8. 将样品转移至微量离心管中，并在液氮中迅速冷冻。
9. 当所有样品运行结束后，拆卸流动系统进行清洗。丢弃使用过的石英毛细管，并将所有其他连接部件在 50% 水：50% 甲醇溶液中超声清洗 1 小时。按照制造商说明清洗注射器。

5. 消化

1. 消化全细胞裂解液。首先将样品解冻，并在 95 °C 下加热 10 分钟。
2. 加热后，将裂解液置于冰上冷却 15 分钟。
3. 加入 25 单位核酸酶以消化 DNA 和 RNA，并在室温下孵育 15 分钟。
4. 使用台式离心机在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 10 分钟。
5. 收集上清液并转移至新的洁净微量离心管中。
6. 使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
7. 取 20–100 µg 样品转移至洁净微量离心管中，并用缓冲液补足至 100 µL。
8. 加入 20 mM 二硫苏糖醇（DTT）进行还原反应，在 50 °C 下孵育 45 分钟。
9. 将样品在室温下冷却 15 分钟。
10. 在避光条件下，加入 20 mM 碘乙酰胺（IAA）于室温孵育 20 分钟进行烷基化。
11. 按 1:4 的蛋白:丙酮比例加入预冷丙酮，混匀样品后于 -20 °C 放置过夜。
12. 次日早晨，在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 10 分钟。
13. 弃去上清液，加入 50 µL 预冷的 90% 丙酮，混匀后在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 5 分钟。
14. 去除丙酮，将微量离心管管盖打开，顶部用无尘纸覆盖，使样品自然干燥。样品完全干燥后，用 10 mM Tris 缓冲液（pH 8）重悬蛋白沉淀。
15. 将 20 µg 胰蛋白酶溶解于 40 µL 10 mM Tris 缓冲液（pH 8）中，向样品中加入 2 µg 胰蛋白酶（酶与样品质量比为 1:50），于 37 °C 孵育过夜。
16. 次日早晨，使用肽定量试剂盒检测肽浓度。在取样完成肽浓度测定后，向样品中加入甲酸终止胰蛋白酶消化反应（终浓度为 5% 甲酸）。
17. 确定最终肽浓度后，将每份样品各取 10 µg 转移至洁净微量离心管中，以确保各样品分析量一致。使用真空离心浓缩仪将样品干燥。干燥后，用 20 µL 质谱级 0.1% 甲酸溶液重悬，随后转移至自动进样瓶中。

6. 液相色谱-串联质谱法

1. 为定位FPOP修饰，使用LC-MS/MS分析对消化后的细胞裂解液进行分析。
2. 使用含0.1%甲酸的水溶液（A）和含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）作为流动相。
3. 将0.5 µg样品加载至180 µm × 20 mm C18（5 µm，100 Å）捕获柱，并用99%（A）和1%（B）的流动相洗涤样品15分钟。
4. 使用75 µm × 30 cm C18（5 µm，125 Å）分析柱，以0.300 µL/min的流速进行分析分离：起始条件为3%（B）维持1分钟，随后在1–2分钟内线性梯度升至10%（B），接着在2–100分钟内升至45%（B），再在100–110分钟内升至100%（B）。通过在110–115分钟维持100%（B）清洗色谱柱。然后在115–116分钟内线性梯度降至3%（B），并在116–130分钟维持3%（B）以重新平衡色谱柱。
5. 设置质谱采集参数：分辨率设为60,000，m/z扫描范围为375–1500，自动增益控制（AGC）目标值设为5.0 × 10⁵，最大离子注入时间设为50 ms。
6. 在质谱采集过程中，通过数据依赖性采集（DDA）选择电荷态为2–6的前体离子，隔离窗口设为1.2 m/z，循环时间设为4秒。选择强度阈值高于5.0 × 10⁴的肽段进行HCD碎裂，归一化碎裂能量设为32%。肽段在经历一次MS/MS采集后，在60秒内被排除再次选择。MS/MS扫描的分辨率设为15,000，AGC目标值设为5.0 × 10⁴，最大离子注入时间设为35 ms。

7. 数据处理

1. 使用可用的蛋白质分析软件，针对相关的蛋白质数据库和相应的消化酶对 RAW 文件进行搜索。此处使用 Swiss-Prot Homo Sapiens 数据库和胰蛋白酶（trypsin）。
2. 设置前体离子质量搜索范围为 350 至 5,000 Da，质量容差为 10 ppm。允许最多 1 个漏切位点，肽段长度范围为 6 至 144 个氨基酸残基。这些限制条件有助于提高数据库搜索效率。
3. 设置碎片离子最大质量容差为 0.02 Da，以羧氨甲基化（+57.021）作为固定修饰，17 种氨基酸的所有 FPOP 修饰作为动态修饰（图 4 为用于检测 FPOP 修饰的蛋白质分析工作流程示例）。
   注意：由于丝氨酸和苏氨酸与羟基自由基的反应活性较低，因此在搜索中不包含这两种氨基酸的 FPOP 修饰。
4. 使用诱饵数据库进行搜索，设定错误发现率分别为 1% 和 5%。
5. 文件完成搜索后，计算 FPOP 修饰的程度。打开 Proteome Discoverer 2.2，导出序列、修饰位点、蛋白质登录号、谱图文件、前体离子丰度以及保留时间信息。根据公式 4 计算修饰程度：
   
   其中，“修饰的 EIC 面积”指特定肽段带有羟基自由基修饰的色谱峰面积，“总 EIC 面积”指该特定肽段修饰与未修饰形式的总色谱峰面积。在有和无辐照的样品中分别计算氧化程度。未进行辐照的样品（对照组）用于评估细胞在 H₂O₂ 暴露前后可能存在的背景氧化水平。通过从辐照样品中扣除对照组数据，有助于分离出特异性的 FPOP 修饰信号。

结果

IC-FPOP 是一种用于研究活细胞中蛋白质相互作用的足迹分析方法。在 IC-FPOP 流动系统中，H₂O₂ 的暴露时间被限制在约 3 秒，因此可在不对细胞造成不利影响的情况下使用较高的 H₂O₂ 浓度。该流动系统还包含两股鞘液缓冲液流，通过流体动力聚焦将细胞集中到管路中心，形成单一的细胞流，从而实现均匀辐照（图 5）⁹。正交 YZ 层析荧光成像图（图 5A）清晰显示了含有 FITC 荧光染料的鞘液缓冲液与含有 TMRM 荧光染料的细胞溶液之间的分离。为突出这种分离效果，图 5B 和 图 5C 分别展示了鞘液缓冲液和细胞溶液的三维平均热图，表明两种溶液之间的混合极少。

单细胞流动系统的使用使氧化修饰蛋白的数量增加了13倍（图6A)⁹该方法中，细胞多个区室中的蛋白质均被标记，其中以膜蛋白、细胞质蛋白和细胞核内的蛋白质最为丰富。^8,9为确保蛋白质在完整细胞内发生修饰，对经CellROX处理的细胞进行荧光成像观察₂O₂ 治疗与照射（图6B)⁸在整个标记过程中细胞的稳定性进一步证实了IC-FPOP在天然细胞环境中探测蛋白质的有效性。通过使用串联质谱法，可将这些修饰定位到蛋白质的特定氨基酸上。 图7 代表在IC-FPOP过程中发生的一种修饰及其对应的提取离子色谱图。提取离子色谱图中观察到的偏移反映了修饰肽中甲硫氨酸氧化所引起的疏水性变化。

为了验证FPOP修饰是否能够探测细胞内蛋白的溶剂可及性，将细胞内标记的肌动蛋白与体外足迹分析研究以及多种肌动蛋白晶体结构进行了比较（图8）⁸。细胞内标记的肌动蛋白如图8A所示，其氧化程度与Guan等人¹⁰的体外研究结果（图8B）具有可比性，表明肌动蛋白在细胞内和体外实验中具有相似的溶剂可及性。为进一步确认IC-FPOP确实探测了肌动蛋白的溶剂可及性，将FPOP修饰的程度与根据两种肌动蛋白晶体结构计算得到的标记残基的溶剂可及性进行了比较（图8C）。该相关性表明，IC-FPOP能够很好地探测单体蛋白的溶剂可及性。

图1：如何正确组装卡套。（A）在拧紧前，将卡套、石英管和套管一并放置到位。（B）将所有组件一起拧紧。（C）最终产品为卡套已牢固压紧在套管上的结构。请点击此处查看此图的放大版本。

图2：IC-FPOP 流动系统的搭建。（A）完全组装好的 IC-FPOP 流动系统放置在激光器旁的照片。（B）为增大500 µL 注射器的外径，使其能够同时牢固固定，所需使用的垫片示例。（C）代表性图片，显示磁力搅拌器所需的空间。（D）需要使用堵头，以在不损坏注射器的情况下停止注射泵的运行。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：为IC-FPOP开发的流动系统示意图。 蓝色管道代表内径450 µm、外径670 µm的石英毛细管，红色管道内径为150 µm、外径360 µm，橙色管道内径为75 µm、外径360 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：用于检测 FPOP 修饰的蛋白质分析软件。 典型的工作流程及在每个节点中搜索的相应修饰。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：单细胞流动系统通过流体动力学将细胞聚焦为单一液流。（A）正交 YZ 叠层图像，展示细胞分析物（红色，TMRM 荧光染料）被鞘液缓冲液（绿色，FITC 荧光染料）包围时的三维聚焦情况。鞘液缓冲液的三维平均强度热图（B）和细胞分析物的三维平均强度热图（C）。强度较低区域显示为蓝色，最高强度区域为红色（B-C）。本图经 Rinas 等人⁹ 修改。 请点击此处查看此图的高清版本。

图6：使用IC-FPOP流式系统显著增加了进样细胞中发生FPOP修饰的蛋白质数量。（A）比较使用与不使用流式系统所鉴定到的氧化蛋白质。流式系统共鉴定出1391种FPOP修饰蛋白，而不使用流式系统仅鉴定出105种修饰蛋白，两者之间有58种修饰蛋白重叠。该图经Rinas等⁹修改。（B）IC-FPOP处理后经CellROX染色的细胞荧光成像结果显示，细胞在氧化标记后仍保持完整。细胞使用Olympus Fluoview FV1000 MPE多光子显微镜在665 nm波长下成像，图中显示为单层切片图像。该图经Espino等⁸修改。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：IC-FPOP过程中产生的串联质谱（MS/MS）谱图示例。 （A）未修饰肽段和（B）在该肽段第8位甲硫氨酸（M8）残基上检测到氧化修饰的产物离子（MS/MS）谱图。代表性提取离子色谱图（EIC）显示（C）未修饰肽段和（D）修饰肽段。 请点击此处查看该图的高清版本。

图8：IC-FPOP 在探测蛋白质溶剂可及性方面具有有效性。（A）肌动蛋白中9个氧化修饰肽段的修饰程度。数值以平均值±标准差表示（n = 3）。（B）Guan 等人通过同步辐射辐射在体外氧化的肌动蛋白肽段的修饰情况¹⁰。（C）FPOP 修饰程度与肌动蛋白在紧密态（三角形，虚线趋势线）和开放态（圆形，实线趋势线）中残基溶剂可及表面积（SASA）的相关性。该图已根据 Espino 等人⁸ 的内容修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

已开发出多种基于质谱的技术，用于在全细胞或细胞裂解物中以蛋白质组范围的方式研究蛋白质结构及蛋白质-配体复合物。这些技术包括但不限于蛋白质氧化速率稳定性分析（SPROX）、热蛋白质组分析（TPP）、化学交联（XL-MS）和羟基自由基蛋白质足迹法（HRPF）。每种技术相比其他方法均有其独特的局限性和优势，已有大量综述对此进行了详细讨论¹²。这些方法均已应用于全蛋白质组水平的结构生物学研究，以阐明复杂细胞环境中蛋白质的结构及其最终功能。IC-FPOP 是一种HRPF技术，利用羟基自由基对氨基酸中溶剂可及的侧链进行氧化修饰，从而探测活细胞内蛋白质的结构及蛋白质-配体相互作用¹³。IC-FPOP 是对早期在活细胞中使用芬顿化学反应在分钟级时间尺度上产生活性自由基的HRPF方法的改进¹⁴。在本研究中，通过在整个蛋白范围内实现良好的氧化覆盖率，成功表征了跨膜蛋白在缓冲液pH值或离子强度降低条件下的结构变化。与芬顿化学反应相比，IC-FPOP 的反应速度快得多，可在微秒级时间尺度上对蛋白质进行修饰，从而能够研究蛋白质的天然构象。

对IC-FPOP的一项关键测试是确认细胞在暴露于H₂O₂后的存活能力。使用40 cm的混合管线时，细胞在辐照前会与H₂O₂孵育约3秒。通过改变该石英管的长度可调节此孵育时间。值得注意的是，尽管使用台盼蓝检测细胞活力可证明细胞在H₂O₂孵育后仍保持完整，但细胞可能仍处于应激状态，从而影响与H₂O₂相互作用的信号通路。幸运的是，该孵育时间极短，短于蛋白质合成所需时间，因此可以确信所检测的蛋白质并非由H₂O₂诱导产生。

下一步重要操作是确认流路系统的正确组装。组装完成后，在用目标缓冲液冲洗系统后，应确保系统无泄漏。若发现泄漏，需检查石英管是否被正确切割，并确保其与卡套紧密贴合，以便在拧紧时形成良好密封。所有部件均为手动拧紧，无需使用工具。在每次IC-FPOP实验过程中，需确保细胞注射器内的磁力搅拌子持续转动。这种轻微搅拌可减少细胞在注射器底部的沉降，又不会剧烈到造成细胞剪切损伤。一次运行后，注射器中约残留50 µL细胞悬液。每次实验后务必通过冲洗步骤将其稀释，以减少残留细胞对下一次实验的交叉污染。若需比较多种细胞处理条件，建议使用新的细胞注射器。此外，为待测细胞选择合适的缓冲液也至关重要。某些缓冲液会淬灭羟基自由基，导致蛋白质修饰减少。Xu等人的研究显示，一些常用缓冲液会缩短羟基自由基的寿命¹¹。DPBS和HBSS是IC-FPOP实验中常用的缓冲液。

在完成IC-FPOP后，应根据所需参数优化消化方案。由于FPOP会产生不可逆的共价修饰，因此有充足的时间进行彻底的消化和纯化，而不会丢失标记覆盖率。务必对蛋白质浓度进行检测和归一化，以确保加载到串联质谱中的肽段浓度一致。最后需注意，免疫沉淀不能与IC-FPOP联合使用。如果FPOP修饰发生在相互作用区域，抗体的亲和力将降低。为了提高FPOP修饰的鉴定率，二维色谱分离步骤已被证明可使检测到的氧化肽段数量增加两倍以上¹⁵。

任何FPOP实验的一个挑战是由于可能产生的氧化产物而导致数据分析层面的复杂性。这一点无论是在细胞内还是体外实验中均成立，而在分析细胞裂解液时，其复杂性则显著增加。随着IC-FPOP技术的进一步优化，出现的蛋白质数量及其修饰覆盖率不断提高，使得数据分析迅速变得更加困难。单次IC-FPOP实验所产生的海量数据限制了人工验证的可行性，迫使研究人员更加依赖软件工具。为此，Rinas等人开发了一种基于Proteome Discoverer（PD）的HRPF定量策略¹⁶。该方法在PD中采用多搜索节点工作流程，并结合电子表格中的定量平台进行分析。目前，IC-FPOP平台的进一步改进工作正在进行中，旨在提高可鉴定的FPOP修饰肽段数量，同时增强实验的可重复性与定量准确性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-53A	任何品牌均可
5 mL 气密型注射器，可拆卸鲁尔锁头	SGE Analytical Science	008760
50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-432-22	任何品牌均可
500 µL型气密式注射器：固定式鲁尔锁型号	Fisher Scientific	SG-00723
丙酮，HPLC 级	Fisher Scientific	A929-4	4 L 的量并非必需
乙腈（含0.1%甲酸，v/v），液相色谱/质谱级	Fisher Scientific	LS120-500
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 捕获柱，100 Å, 5 µ米，180 µm × 20 mm，2G，V/M，1/包	沃特斯	186007496
ACQUITY UPLC M-Class 系统	沃特斯	ACQUITY UPLC M-Class 系统
铝箔	Fisher Scientific	01-213-100	任何品牌均可
Aqua 5 µm C18 125 Å 填充材料	Phenomenex	04A-4299
离心	Eppendorf	022625501
精密任务擦拭纸	Fisher Scientific	06-666A
二硫苏糖醇（DTT）	AmericanBio	AB00490-00005
DMSO，无水	Invitrogen	D12345
EX350 准分子激光器	GAM 激光器	EX350 准分子激光器
FEP 管道 1/16" OD × 0.020" ID	IDEX Health &与科学	1548L
甲酸，LC/MS 级	Fisher Scientific	A117-50
HV3-2 阀门	Hamilton	86728
过氧化氢	Fisher Scientific	H325-100	任何30%的过氧化氢均可满足要求
碘乙酰胺（IAA）	ACROS Organics	122270050
Legato 210 注射泵	KD Scientific	788212	任何能够容纳 4、5 mL 注射器，具备吸液和排液功能，并可通过某种方式锁定电机的注射泵均可使用
鲁尔接头 母鲁尔接头转1/4-28公制聚丙烯	IDEX Health &与科学	P-618L
甲醇，LC/MS级	Fisher Scientific	A454SK-4	4 L 的量并非必需
微型离心机	赛默飞世尔科技	75002436
N,N'-二甲基硫脲（DMTU）	ACROS Organics	116891000
NanoTight 套管绿色 1/16" ID x .0155" ID × 1.6"	IDEX Health &科学	F-242X
NanoTight 套管 黄色 1/16" OD × 0.027" ID × 1.6"	IDEX Health &与科学	F-246
N-叔丁基-α苯基叔丁基硝酮（PBN）	ACROS Organics	177350250
Orbitrap Fusion Lumos 三合一质谱仪	赛默飞世尔科技	Orbitrap Fusion Lumos 三合一质谱仪	其他高分辨率仪器（例如 Q exactive Orbitrap 或 Orbitrap Fusion）可以使用
PE50-C 热释电能量计	Ophir Optronics	7Z02936
Pierce 定量比色法肽测定	赛默飞世尔科技	23275
Pierce Rapid Gold BCA 蛋白质定量检测试剂盒	赛默飞世尔科技	A53225
Pierce 胰蛋白酶蛋白酶，质谱级	赛默飞世尔科技	90058
用于细胞裂解的 Pierce 通用核酸酶	Fisher Scientific	88702
Polymicro切割石，1" × 1" x 1/32"	Molex	1068680064	任何毛细管切割器均可满足要求
Polymicro 柔性熔融石英毛细管，内径 150 µm，外径 360 µm，TSP150350	Polymicro Technologies	1068150024
Polymicro 柔性熔融石英毛细管，内径 450 µm，外径 670 µm, TSP450670	Polymicro Technologies	1068150025
Polymicro 柔性熔融石英毛细管，内径 75 µm，外径 360 µm, TSP075375	Polymicro Technologies	1068150019
磷酸二氢钾	Fisher Scientific	P382-500
Proteome Discover 2.2（自下而上蛋白质组学软件）	赛默飞世尔科技	OPTON-30799
旋转磁力滚转搅拌器	V&P Scientific, Inc.	VP 710D3
旋转磁力滚轴搅拌器，用于注射泵的配件套装	V&P Scientific, Inc.	VP 710D3-4
超大无法兰卡套，含SST环，Tefzel材质™ （ETFE），1/4-28 平底，适用于 1/16" 光密度	IDEX Health &与科学	P-259X
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 平底，适用于 1/16" &和 1/32" 光密度	IDEX Health &与科学	P-255X
超级翻转搅拌盘，直径 3.35 mm，厚 0.61 mm	V&P Scientific, Inc.	VP 722F
Thermo Scientific Pierce RIPA 裂解液	Fisher Scientific	PI89900
Tris碱	Fisher Scientific	BP152-500
Upchurch Scientific 低压接头：PEEK	Fisher Scientific	05-700-182
Upchurch Scientific 低压三通接头：PEEK	Fisher Scientific	05-700-178
紫外级熔融石英平凸球面透镜	THORLABS	LA4052
V&P Scientific 公司供应商多样性合作伙伴 TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000	V&P Scientific, Inc.	VP724F
VHP MicroTight 360 用接头µm OD	IDEX Health &与科学	UH-436
含0.1%甲酸（v/v）的液相色谱-质谱级水	Fisher Scientific	LS118-500
水，LC/MS级	Fisher Scientific	W6-4