少突胶质细胞的生成及其条件培养基的制备用于共培养实验

摘要

本文展示了一种高效纯化少突胶质细胞并制备少突胶质细胞条件培养基的方法，该培养基可用于共培养实验。

摘要

在中枢神经系统中，少突胶质细胞以其在轴突髓鞘形成中的作用而著称，这种髓鞘可通过跳跃式传导加速动作电位的传播。此外，越来越多的研究表明，少突胶质细胞与神经元之间的相互作用不仅限于髓鞘形成，还通过分泌可溶性因子等方式实现。本文介绍了一种详细的实验方案，用于从包含星形胶质细胞和小胶质细胞的胶质细胞培养物中纯化少突胶质细胞系细胞。该方法依赖于在37 °C条件下过夜振荡，使上层的少突胶质细胞和小胶质细胞选择性脱落，并通过差异贴附法去除小胶质细胞。随后，我们描述了少突胶质细胞的培养以及少突胶质细胞条件培养基（OCM）的制备过程。此外，我们还提供了在共培养实验中，将OCM处理或添加少突胶质细胞至纯化海马神经元的时间动力学方案，用于研究少突胶质细胞与神经元之间的相互作用。

引言

少突胶质细胞（OLs）是中枢神经系统（CNS）中的胶质细胞，能够生成包裹轴突的髓鞘。OLs起源于少突胶质前体细胞（OPCs），OPCs在胚胎期CNS的室管膜区增殖，随后迁移并分化为完全成熟的OLs（即髓鞘形成细胞）¹。OPCs在早期发育阶段数量丰富，但在成年大脑中也持续存在，是成年脑内主要的增殖性细胞群体²。单个OL可在轴突的非兴奋性区段（即节间区）包裹多条轴突，每层髓鞘环的边缘与轴突相连，形成旁结区（paranodal domain），该结构对髓鞘的绝缘功能至关重要^1,3。在旁结区之间存在微小的无髓鞘间隙，称为郎飞结（nodes of Ranvier）。这些郎飞结富含电压门控钠通道（Nav），可实现动作电位的再生和通过跳跃式传导的快速传播⁴。这种紧密的相互作用还通过OLs向神经元提供乳酸，从而支持轴突的能量代谢^5,6。

少突胶质细胞系细胞的成熟及髓鞘形成过程受到其与神经元相互作用的严格调控⁷。事实上，少突胶质细胞（OLs）和少突胶质前体细胞（OPCs），后者也称为NG2细胞，表达多种神经递质受体，能够接收来自兴奋性和抑制性神经元的信号输入，从而感知神经元活动，并触发其增殖和/或分化为髓鞘形成细胞²。反过来，OPCs/OLs向细胞外空间分泌微囊泡和蛋白质，这些物质可单独或协同介导神经调节和神经保护功能^8,9,10,11,12。然而，调控少突胶质细胞系细胞与神经元之间多种相互作用模式的分子机制仍有待全面阐明。

此外，在多种中枢神经系统（CNS）病理状态下，少突胶质细胞（OLs）为主要受累细胞，从而干扰其与神经元之间的相互作用。例如，在多发性硬化症（MS）中，由于少突胶质细胞丢失导致中枢神经系统出现局灶性脱髓鞘，进而引发神经功能障碍，并可导致轴突损伤及相关残疾的累积。尽管在多数情况下可发生再髓鞘化，但其程度通常不足¹³。过去十年间，随着免疫疗法的发展，疾病的复发率已有所降低，但促进再髓鞘化至今仍是尚未满足的临床需求。因此，深入理解少突胶质细胞的作用、功能及其影响，对于开发针对广泛中枢神经系统疾病的新疗法具有重要意义。

本文介绍了少突胶质细胞（OLs）的纯化与培养方法。该方法可实现对调控其发育及生物学行为的内在机制进行精确研究。此外，这种高度富集的少突胶质细胞培养体系可用于制备少突胶质细胞条件培养基（OCM），后者可添加至纯化的神经元培养物中，以探究少突胶质细胞分泌因子对神经元生理功能和连接性的影响。同时，本文还描述了如何建立一种体外共培养系统，将纯化的少突胶质细胞与神经元共同培养，从而研究调控（再）髓鞘化过程的分子机制。

方案

本实验中大鼠的饲养和使用符合机构政策和指南（UPMC、INSERM 以及欧洲共同体理事会指令 86/609/EEC）。以下方案适用于标准窝仔数为 12 只幼鼠的情况。

1. 锥形瓶的准备（约5分钟）

注意：以下步骤需在解剖前一天于超净工作台中无菌条件下进行。

1. 使用5 mL聚乙烯亚胺（PEI，100 mg/L，见补充文件1中的方案），对带滤膜盖的150 cm²培养瓶（T150，每2只幼鼠使用1个培养瓶）进行包被。
2. 将包被后的培养瓶于4 °C过夜保存。
3. 在解剖当天，用无菌蒸馏水将包被的培养瓶冲洗3次。

2. 培养基的制备（约10分钟）

注意：在层流罩内无菌条件下进行以下步骤。

1. 准备 500 mL 培养基，包含添加了 10% 胎牛血清（FCS）和青霉素-链霉素（100 IU/mL）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
2. 在 50 mL 离心管中配制 20.6 mL 酶消化液，包含 20 mL DMEM、200 µL DNase（50 µg/mL）、200 µL 木瓜蛋白酶（30 U/mL）和 200 µL L-半胱氨酸（0.24 mg/mL）。
3. 使用 0.22 µm 滤器对培养基进行过滤除菌。
4. 将培养基置于室温（RT）下的超净工作台中，直至进行解剖操作。

3. 解剖前准备（约10分钟）

注意：在层流罩内无菌条件下进行以下步骤。

1. 配制 100 mL 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS；1x）。使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。
2. 配制 50 mL 冰冷的 1x PBS 溶液，并加入 750 µL 45% 葡萄糖。使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。
3. 用 1x PBS 填充一个 100 mm 培养皿用于清洗器械，用冰预冷的 PBS-葡萄糖溶液填充三个 60 mm 培养皿用于组织采集。将培养皿置于冰上，直至进行解剖操作。

4. 解剖

注意：解剖取材于出生后第 2 天（P2）的雄性和雌性 Wistar 大鼠幼鼠。

1. 为提供无菌环境，务必使用100%乙醇清洁实验台。所有手术器械也需用100%乙醇灭菌。
2. 用70%乙醇轻轻喷洒幼鼠颈部。
3. 使用大型手术剪剪下动物头部，并将头置于含有冰冻PBS-葡萄糖的100 mm培养皿中。
4. 使用弯头镊子将动物头部固定至视线水平。使用小型手术剪在颅骨基部做一小切口，并沿脑中线剪开颅骨。
5. 用镊子从正中线开始轻轻剥离颅骨的两部分。
6. 使用小型手术勺将脑组织从颅腔中取出，放入盛有冰冻PBS-葡萄糖并置于冰上的60 mm培养皿中。
7. 在体视显微镜下，使用精细镊子去除小脑、脑干和嗅球，保留大脑半球。
8. 使用精细镊子分离两个大脑半球。再用精细镊子剥离软脑膜。将大脑皮层组织放入冰上放置的60 mm培养皿中。
   注意：冰冻PBS对于正确去除脑膜至关重要。

5. 组织解离

注意：在层流罩内无菌条件下进行以下步骤。

1. 使用锋利的手术刀将大脑皮层精细切碎。将切碎的组织转移至含有酶消化液的 50 mL 离心管中。
2. 在 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 30 分钟。
3. 使用 1000 µL 移液器轻轻吸除酶消化液，同时确保皮层组织仍留在 50 mL 离心管底部。
4. 使用 1000 µL 移液器加入 1 mL DMEM-10% FCS，并轻轻吹打组织。
5. 使用 70 µm 滤膜和 1 mL 注射器的推杆将皮层组织过滤至 50 mL 离心管中。
   注意：可用 DMEM-10% FCS 多次冲洗离心管内壁上残留的组织。
6. 用 DMEM-10% FCS 补充 50 mL 离心管至满。在室温下以 423 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，并用 2 mL DMEM-10% FCS 重悬细胞沉淀。
7. 先用 1000 µL 移液器、再用 200 µL 移液器轻轻吹打细胞沉淀。用适量体积的 DMEM-10% FCS 稀释细胞悬液。
   注意：两个脑组织 = 一个 T150 培养瓶 = 5 mL DMEM-10% FCS。
8. 以 1 × 10⁵ 个细胞/cm² 的密度将 5 mL 细胞悬液接种至 T150 培养瓶中。每个 T150 培养瓶中加入 20 mL 预热的 DMEM-10% FCS。置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中培养。
9. 体外培养第 6 天（DIV 6）时，更换一半培养基，加入预热的 DMEM-10% FCS。

6. 振荡样品制备

1. 在摇瓶培养前一天，在超净工作台内无菌条件下进行摇瓶前准备。
2. 通过向培养瓶中加入新鲜的预温培养基更换一半培养基，并在37 °C、5% CO₂条件下继续培养。

7. 振荡

1. 用PEI包被三个100 mm的培养皿。于4 °C下保存过夜。
2. 用石蜡膜封住培养瓶瓶盖，并将培养瓶放入塑料袋中。在37 °C、250 rpm条件下振荡培养胶质细胞过夜。
   注意：首次振荡在8 DIV时进行，最多可进行三次不同的振荡（振荡时间参见图1）。

8. OL谱系细胞的收获与培养

注意：这些步骤应在层流罩内的无菌条件下进行。

1. 摇床振荡后的第二天，根据表1配制Bottenstein-Sato（BS）培养基。
2. 用无菌蒸馏水将包被的培养皿清洗3次。
3. 收集含有主要为少突胶质细胞系细胞以及部分小胶质细胞的培养瓶上清液，并将其接种至未包被的100 mm培养皿中。
   注意：此步骤可通过小胶质细胞在培养皿表面的快速贴壁特性将其去除。
4. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育15分钟。
5. 向每个T150培养瓶中加入25 mL温热的新鲜配制培养基，并在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育，直至第二次摇床振荡。
6. 将培养皿中的上清液转移至新的未包被的100 mm培养皿中，以使残留的小胶质细胞进一步贴壁。
7. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育15分钟。
8. 移除含有非贴壁的少突胶质细胞系细胞的上清液，并将其转移至50 mL离心管中（每2个培养皿的上清液合并至1个50 mL离心管）。弃去接种了小胶质细胞的培养皿。
9. 将上清液在423 × g条件下离心5分钟。小心吸除上清液，用1 mL BS培养基重悬细胞沉淀。将所有细胞沉淀合并至一个共同的50 mL离心管中，并用BS培养基调整总体积至10 mL。
10. 在显微镜下进行细胞计数以确定细胞密度。
    注意：细胞密度应达到3 × 10⁵/mL至5 × 10⁵/mL之间。
11. 若细胞密度大于或等于4 × 10⁵/mL，则加入20 mL BS培养基，使最终体积为30 mL；若细胞密度小于4 × 10⁵/mL，则仅加入10 mL BS培养基，使最终体积为20 mL。
12. 将10 mL细胞悬液接种至两到三个预先包被的100 mm培养皿中。置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育。
13. 2小时后更换全部BS培养基以清除碎片。
    注意：在清除碎片前后均应在显微镜下观察培养物，以确认细胞密度及碎片清除效率。
14. 在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中用BS培养基继续孵育2天。
    注意：在显微镜下观察培养物，细胞融合度应达到70%至80%。

9. OCM 的制备

注意：在层流罩内无菌条件下进行这些步骤。

1. 根据表2配制NB-B27low培养基。
2. 用10 mL预热的NB-B27low培养基更换培养液，在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养2天。
3. 收集OCM，即含有少突胶质细胞分泌因子的上清液。使用0.22 µm滤器过滤除菌。
   注意：OCM可在4 °C保存最多2个月。

10. 添加OCM

注意：所有步骤均应在层流罩内无菌条件下进行。OCM 可添加至根据以下方案制备的纯化海马神经元培养物中¹⁴，具体方法为：在细胞分离后 24 小时，加入抗有丝分裂试剂尿苷和 5-氟脱氧尿苷（5 µM），持续作用 36 小时。

1. 在3 DIV时，移除所有含有抗有丝分裂剂的神经元培养基，并加入500 µL新鲜预热的OCM。
2. 每隔3天更换一半培养基，使用新配制的预热NB-B27。
   注意：此类培养物可维持至21 DIV。

11. 向纯化的海马神经元培养物中添加OL

注意：以下步骤需在层流罩内无菌条件下进行。少突胶质细胞（OLs）可添加至采用上述相同方法获得的纯化海马神经元培养物中。

1. 根据表3配制共培养基。
2. 取70%至80%融合度的少突胶质细胞（OL）培养物，用2 mL预热的1×PBS洗涤一次。
3. 为消化细胞，向100 mm培养皿中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶溶液。
4. 在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育5分钟。
5. 加入2 mL DMEM-10% FCS以终止酶反应。收集含有少突胶质细胞系的上清液。
6. 在室温下以423 × g离心5分钟。小心弃去上清液，将细胞沉淀重悬于预热的共培养基中，调整细胞浓度至1.25 × 10⁵ 个细胞/mL。
7. 通过移除24孔板中每孔200 µL神经元培养基，并加入200 µL细胞悬液（每孔2.5 × 10⁴ 个细胞），将少突胶质细胞接种至纯化的海马神经元培养物中。
8. 每2至3天更换一半共培养基。
   注意：共培养体系可维持至24天体外培养（DIV）。

结果

在本实验方案中，通过振荡去除星形胶质细胞和小胶质细胞，从而从胶质细胞培养物中纯化少突胶质细胞系细胞。可通过使用胶质细胞标志物进行免疫染色来评估少突胶质细胞培养物的纯度和表型¹⁵。对不同标志物表达的分析表明，少突胶质细胞培养物主要为前少突胶质细胞（pre-OLs），其中O4⁺细胞占90% ± 4%，NG2⁺细胞占85% ± 7%，PLP⁺细胞占4.7% ± 2.1%；而GFAP⁺星形胶质细胞占7.2% ± 2.5%（均值 ± 标准差，n = 3；图2）。此外，CD11b⁺小胶质细胞占4.6% ± 0.7%（均值 ± 标准差，未显示）。

来自此类培养物的少突胶质细胞条件培养基（OCM）可在纯化的海马神经元培养物培养至第3天时加入。该处理可促进...

讨论

本文提供了一种详细的实验方案，用于从混合胶质细胞培养物中获得高度富集的少突胶质细胞系细胞培养物，并进一步制备少突胶质细胞条件培养基，该方法改编自先前发表的方法¹⁶。该振荡分离技术成本较低，可重复进行三次，是获得大量纯化少突胶质细胞（OL）的理想方法，因为在含有血小板源性生长因子α（PDGFα）的Bottenstein-Sato（BS）培养基中培养时，细胞能够增殖。胶质细胞来源于出生后第2天（P2）Wistar大鼠的大脑皮层，此时绝大多数少突胶质细胞系细胞为表达NG2和O4的前少突胶质细胞¹⁵。值得注意的是，小鼠与大鼠在P2时期的少突胶质细胞系成熟程度相似，因此本方案也可用于分离小鼠的前少突胶质细胞¹⁷。

震荡混合胶质细胞培养物后，脱落的细胞主要为少突胶质细胞系细胞，但也包含一些小胶质细胞和少量星形胶质细胞。通过未包被的培养皿进行差异性贴壁，可去除小胶质细胞。值得注意的是，通过增加一次贴壁步骤可进一步提高去除效率。然而，在富集的少突胶质细胞培...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氟脱氧尿苷	Sigma	F0503
B27添加剂	ThermoFisher	17504044
D-(+)-葡萄糖溶液	Sigma	G8769
脱氧核糖核酸酶I（DNase）	Worthington	LS002139
杜尔贝科改良伊格尔培养基	ThermoFisher	31966021
乙醇100%	Sigma	32221-M
乙醇70%	VWR Chemicals	83801.360
胎牛血清	ThermoFisher	10082147
L-半胱氨酸	Sigma	C7352
Neurobasal培养基	ThermoFisher	21103049
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003126
青霉素-链霉素	ThermoFisher	15140122
无钙镁磷酸盐缓冲液	ThermoFisher	A1285601
聚乙烯亚胺（PEI）	Sigma	P3143
十水合四硼酸钠	Sigma	B9876
胰蛋白酶	Sigma	Sigma
尿苷	Sigma	U3750
Bottenstein-Sato（BS）培养基
人脱铁转铁蛋白	Sigma	T1147
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A4161
杜尔贝科改良伊格尔培养基	ThermoFisher	31966021
胰岛素	Sigma	I5500
血小板源性生长因子（PDGF）	Peprotech	AF-100-13A
青霉素-链霉素	ThermoFisher	15140122
孕酮	Sigma	P8783
二盐酸亚精胺	Sigma	P5780
亚硒酸钠	Sigma	S5261
三碘甲腺原氨酸钠盐（T3, 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐）	Sigma	T6397
甲状腺素（T4, L-甲状腺素）	Sigma	T1775
共培养培养基
人脱铁转铁蛋白	Sigma	T1147
B27添加剂	ThermoFisher	17504044
生物素	Sigma	B4639
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A4161
铜蓝蛋白	Sigma	239799
杜尔贝科改良伊格尔培养基	ThermoFisher	31966021
氢化可的松	Sigma	H4001
胰岛素	Sigma	I5500
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma	A8199
Neurobasal培养基	ThermoFisher	21103049
青霉素-链霉素	ThermoFisher	15140122
孕酮	Sigma	P8783
亚精胺	Sigma	P5780
重组人CNTF	Sigma	450-13
亚硒酸钠	Sigma	S5261
三碘甲腺原氨酸钠盐（T3, 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐）	Sigma	T6397
维生素B12	Sigma	V6629
工具
0.22 µm 滤膜	Sartorius	514-7010
1 mL 注射器	Terumo	1611127
100 mm 培养皿	Dutscher	193100
15 mL 离心管	Corning Life Science	734-1867
50 mL 离心管	Corning Life Science	734-1869
60 mm 培养皿	Dutscher	067003
70 µm 滤网	Miltenyi Biotec	130-095-823
双目显微镜	Olympus	SZX7
弯头镊子	Fine Science Tools	11152-10
精细镊子	Fine Science Tools	91150-20
大型手术剪	Fine Science Tools	14008-14
手术刀	Swann-morton	233-5528
摇床	Infors HT
小型手术剪	Fine Science Tools	91460-11
小型手术勺	Bar Naor Ltd	BN2706
T150 cm2 带滤膜盖培养瓶	Dutscher	190151
动物
出生后第2天的Wistar大鼠	Janvier	RjHAn:WI