少突胶质细胞的生成及其条件培养基的制备用于共培养实验

摘要

本文展示了一种高效纯化少突胶质细胞并制备少突胶质细胞条件培养基的方法，该培养基可用于共培养实验。

摘要

在中枢神经系统中，少突胶质细胞以其在轴突髓鞘形成中的作用而著称，这种髓鞘可通过跳跃式传导加速动作电位的传播。此外，越来越多的研究表明，少突胶质细胞与神经元之间的相互作用不仅限于髓鞘形成，还通过分泌可溶性因子等方式实现。本文介绍了一种详细的实验方案，用于从包含星形胶质细胞和小胶质细胞的胶质细胞培养物中纯化少突胶质细胞系细胞。该方法依赖于在37 °C条件下过夜振荡，使上层的少突胶质细胞和小胶质细胞选择性脱落，并通过差异贴附法去除小胶质细胞。随后，我们描述了少突胶质细胞的培养以及少突胶质细胞条件培养基（OCM）的制备过程。此外，我们还提供了在共培养实验中，将OCM处理或添加少突胶质细胞至纯化海马神经元的时间动力学方案，用于研究少突胶质细胞与神经元之间的相互作用。

引言

少突胶质细胞（OLs）是中枢神经系统（CNS）中的胶质细胞，能够生成包裹轴突的髓鞘。OLs起源于少突胶质前体细胞（OPCs），OPCs在胚胎期CNS的室管膜区增殖，随后迁移并分化为完全成熟的OLs（即髓鞘形成细胞）¹。OPCs在早期发育阶段数量丰富，但在成年大脑中也持续存在，是成年脑内主要的增殖性细胞群体²。单个OL可在轴突的非兴奋性区段（即节间区）包裹多条轴突，每层髓鞘环的边缘与轴突相连，形成旁结区（paranodal domain），该结构对髓鞘的绝缘功能至关重要^1,3。在旁结区之间存在微小的无髓鞘间隙，称为郎飞结（nodes of Ranvier）。这些郎飞结富含电压门控钠通道（Nav），可实现动作电位的再生和通过跳跃式传导的快速传播⁴。这种紧密的相互作用还通过OLs向神经元提供乳酸，从而支持轴突的能量代谢^5,6。

少突胶质细胞系细胞的成熟及髓鞘形成过程受到其与神经元相互作用的严格调控⁷。事实上，少突胶质细胞（OLs）和少突胶质前体细胞（OPCs），....

方案

本实验中大鼠的饲养和使用符合机构政策和指南（UPMC、INSERM 以及欧洲共同体理事会指令 86/609/EEC）。以下方案适用于标准窝仔数为 12 只幼鼠的情况。

1. 锥形瓶的准备（约5分钟）

注意：以下步骤需在解剖前一天于超净工作台中无菌条件下进行。

1. 使用5 mL聚乙烯亚胺（PEI，100 mg/L，见补充文件1中的方案），对带滤膜盖的150 cm²培养瓶（T150，每2只幼鼠使用1个培养瓶）进行包被。
2. 将包被后的培养瓶于4 °C过夜保存。
3. 在解剖当天，用无菌蒸馏水将包被的培养瓶冲洗3次。

2. 培养基的制备（约10分钟）

注意：在层流罩内无菌条件下进行以下步骤。

1. 准备 500 mL 培养基，包含添加了 10% 胎牛血清（FCS）和青霉素-链霉素（100 IU/mL）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
2. 在 50 mL 离心管中配制 20.6 mL 酶消化液，包含 20 mL DMEM、200 µL DNase（50 µg/mL）、200 µL 木瓜蛋白酶（30 U/mL）和 200 µL L-半胱氨酸（0.24 mg/mL）。....

结果

在本实验方案中，通过振荡去除星形胶质细胞和小胶质细胞，从而从胶质细胞培养物中纯化少突胶质细胞系细胞。可通过使用胶质细胞标志物进行免疫染色来评估少突胶质细胞培养物的纯度和表型¹⁵。对不同标志物表达的分析表明，少突胶质细胞培养物主要为前少突胶质细胞（pre-OLs），其中O4⁺细胞占90% ± 4%，NG2⁺细胞占85% ± 7%，PLP⁺细胞占4.7% ± 2.1%；而GFAP⁺星形胶质细胞占7.2% ± 2.5%（均值 ± 标准差，n = 3；图2）。此外，CD11b⁺小胶质细胞占4.6% ± 0.7%（均值 ± 标准差，未显示）。

来自此类培养物的少突胶质细胞条件培养基（OCM）可在纯化的海马神经元培养物培养至第3天时加入。该处理可促进.......

讨论

本文提供了一种详细的实验方案，用于从混合胶质细胞培养物中获得高度富集的少突胶质细胞系细胞培养物，并进一步制备少突胶质细胞条件培养基，该方法改编自先前发表的方法¹⁶。该振荡分离技术成本较低，可重复进行三次，是获得大量纯化少突胶质细胞（OL）的理想方法，因为在含有血小板源性生长因子α（PDGFα）的Bottenstein-Sato（BS）培养基中培养时，细胞能够增殖。胶质细胞来源于出生后第2天（P2）Wistar大鼠的大脑皮层，此时绝大多数少突胶质细胞系细胞为表达NG2和O4的前少突胶质细胞¹⁵。值得注意的是，小鼠与大鼠在P2时期的少突胶质细胞系成熟程度相似，因此本方案也可用于分离小鼠的前少突胶质细胞¹⁷。

震荡混合胶质细胞培养物后，脱落的细胞主要为少突胶质细胞系细胞，但也包含一些小胶质细胞和少量星形胶质细胞。通过未包被的培养皿进行差异性贴壁，可去除小胶质细胞。值得注意的是，通过增加一次贴壁步骤可进一步提高去除效率。然而，在富集的少突胶质细胞培.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氟脱氧尿苷	Sigma	F0503
B27添加剂	ThermoFisher	17504044
D-(+)-葡萄糖溶液	Sigma	G8769
脱氧核糖核酸酶I（DNase）	Worthington	LS002139
杜尔贝科改良伊格尔培养基	ThermoFisher	31966021
乙醇100%	Sigma	32221-M
乙醇70%	VWR Chemicals	83801.360
胎牛血清	ThermoFisher	10082147
L-半胱氨酸	Sigma	C7352
Neurobasal培养基	ThermoFisher	21103049
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003126
青霉素-链霉素	ThermoFisher	15140122
无钙镁磷酸盐缓冲液	ThermoFisher	A1285601
聚乙烯亚胺（PEI）	Sigma	P3143
十水合四硼酸钠	Sigma	B9876
胰蛋白酶	Sigma	Sigma
尿苷	Sigma	U3750
Bottenstein-Sato（BS）培养基
人脱铁转铁蛋白	Sigma	T1147
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A4161
杜尔贝科改良伊格尔培养基	ThermoFisher	31966021
胰岛素	Sigma	I5500
血小板源性生长因子（PDGF）	Peprotech	AF-100-13A
青霉素-链霉素	ThermoFisher	15140122
孕酮	Sigma	P8783
二盐酸亚精胺	Sigma	P5780
亚硒酸钠	Sigma	S5261
三碘甲腺原氨酸钠盐（T3, 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐）	Sigma	T6397
甲状腺素（T4, L-甲状腺素）	Sigma	T1775
共培养培养基
人脱铁转铁蛋白	Sigma	T1147
B27添加剂	ThermoFisher	17504044
生物素	Sigma	B4639
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A4161
铜蓝蛋白	Sigma	239799
杜尔贝科改良伊格尔培养基	ThermoFisher	31966021
氢化可的松	Sigma	H4001
胰岛素	Sigma	I5500
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma	A8199
Neurobasal培养基	ThermoFisher	21103049
青霉素-链霉素	ThermoFisher	15140122
孕酮	Sigma	P8783
亚精胺	Sigma	P5780
重组人CNTF	Sigma	450-13
亚硒酸钠	Sigma	S5261
三碘甲腺原氨酸钠盐（T3, 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐）	Sigma	T6397
维生素B12	Sigma	V6629
工具
0.22 µm 滤膜	Sartorius	514-7010
1 mL 注射器	Terumo	1611127
100 mm 培养皿	Dutscher	193100
15 mL 离心管	Corning Life Science	734-1867
50 mL 离心管	Corning Life Science	734-1869
60 mm 培养皿	Dutscher	067003
70 µm 滤网	Miltenyi Biotec	130-095-823
双目显微镜	Olympus	SZX7
弯头镊子	Fine Science Tools	11152-10
精细镊子	Fine Science Tools	91150-20
大型手术剪	Fine Science Tools	14008-14
手术刀	Swann-morton	233-5528
摇床	Infors HT
小型手术剪	Fine Science Tools	91460-11
小型手术勺	Bar Naor Ltd	BN2706
T150 cm2 带滤膜盖培养瓶	Dutscher	190151
动物
出生后第2天的Wistar大鼠	Janvier	RjHAn:WI