本方案描述了在生理条件下对心脏组织进行切片并培养6天的方法。该培养系统可作为测试新型心力衰竭治疗药物有效性的平台，也可用于在三维心脏模型中可靠地检测急性心脏毒性。
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本文内容
摘要
摘要
许多新药由于心脏毒性副作用而在临床研究中失败，因为目前可用的体外检测方法和体内动物模型难以准确预测人类心脏相关风险，给制药行业带来了数十亿美元的负担。因此，在开展耗资巨大且耗时漫长的首次人体试验之前，全球迫切需要更有效的方法来识别药物的心脏毒性。目前，仅使用不成熟的心脏细胞（人诱导多能干细胞来源的心肌细胞 [hiPSC-CMs]）来测试药物疗效和毒性，因为它们是唯一可长期培养以满足药物疗效和毒性测试需求的人类心脏细胞。然而，单一细胞类型无法模拟由多种细胞类型构成的复杂三维心脏组织的表型。尤为重要的是，药物效应需要在成人心肌细胞上进行测试，因为其特性及对毒性的反应与不成熟的 hiPSC-CMs 存在差异。培养人类心脏切片是一种有前景的完整人心肌模型。该技术提供了一个完整的多细胞系统，能够模拟人类心脏组织，并反映人心肌的生理或病理状态。近期，通过优化培养基成分以及培养条件，包括施加1.2 Hz的持续电刺激和对培养基进行间歇性供氧，我们开发出一种新的培养体系，可在体外维持人和猪心脏切片的活力与功能达6天之久。在本实验方案中，我们以猪心脏为例详细描述其切片与培养方法。该方案同样适用于人、狗、羊或猫心脏组织切片的培养。该培养体系有望成为一种强有力的、用于急性心脏毒性测试的预测性人源原位模型，从而弥合临床前与临床试验结果之间的差距。
引言
药物诱导的心脏毒性是导致药品退市的主要原因之一1在21世纪的最后一个十年th 世纪以来，有八种非心血管药物因导致心室心律失常引发的猝死而被撤出市场2此外，多种抗癌疗法（尽管在许多情况下有效）可能导致一系列心脏毒性效应，包括心肌病和心律失常。例如，传统的（如蒽环类药物和放射治疗）和靶向的（如曲妥珠单抗）乳腺癌治疗均可能在部分患者中引发心血管并发症。3心脏病学家与肿瘤学家之间的密切合作（通过新兴的 cardio-oncology 领域） "心脏肿瘤学") 有助于使这些并发症得到控制，确保患者能够得到有效治疗2较不明确的是新型药物（包括Her2抑制剂和PI3K抑制剂）的心血管效应，尤其是这些疗法联合使用时的情况。因此，在开展人体临床试验之前，迫切需要建立可靠的临床前筛查策略，以评估新兴抗癌疗法相关的心血管毒性。目前，可用于药物毒性检测的功能性和结构性均保持稳定超过24小时的人类心肌组织培养系统尚不可及，这限制了心脏毒性检测的可靠性。因此，亟需建立一种能够在生理条件下可靠培养人类心肌组织的系统，用于药物毒性测试。
近年来，在心脏毒性测试中使用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）在一定程度上缓解了这一问题；然而，hiPSC-CMs 的不成熟特性....
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方案
所有动物实验均遵循路易斯维尔大学的机构指南，并经机构动物护理和使用委员会批准。
1. 切片前准备（切片前一日）
- 振动切片机的准备
- 将陶瓷刀片放入刀架中，步骤如下：小心拆开刀片包装后，先将刀刃部分插入刀具槽内。然后，松开刀架臂上的两个螺丝，将刀片滑入每个垫圈下方，并用力向后推至后部限位挡块处。拧紧螺丝以固定刀片。
注意： 螺钉不应过度拧紧。 - 根据制造商的方案，使用校准协议和工具对刀片进行校准。
注意： 简而言之，为了便于刀片与运动轴对齐并最大限度减少Z轴偏转，振动切片机采用了一个可拆卸的校准装置。当校准装置插入仪器时，其存在将被自动检测，振动切片机会自动控制并调节刀片的振幅和频率至最适合调整刀片对准误差的数值。- 按压 切片 点击按钮启动对准程序，系统将自动移动刀片，使其刃口相对于校准装置处于最佳位置，以实现最精确的对准评估。根据屏幕上的提示，使用提供的螺丝刀调节刀片，确保Z轴对准精度在1 µm以内。
- 高压灭菌振动切片机的内槽及所有金属部件。
- 将陶瓷刀片放入刀架中，步骤如下：小心拆开刀片包装后，先将刀刃部分插入刀具槽内。然后，松开刀架臂上的两个螺丝，将刀片滑入每个垫圈下方，并用力向后推至后部限位挡块处。拧紧螺丝以固定刀片。
- 将大型金属托盘（用于收集切片和浸泡电刺激板盖）、所有玻璃容器、普通矩形刀片、....
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结果
使用一种可同时容纳八个6孔板的商用细胞培养电刺激仪，我们通过施加生理频率（1.2 Hz）的电刺激来模拟成年心脏的微环境，并筛选出可延长猪心脏切片在体外培养中功能维持时间的基本培养基成分13。由于猪心脏与人类心脏在大小和解剖结构上相似15，我们首先利用猪心脏开发了一种仿生心脏切片培养系统，随后在人源心脏切片中进行了验证。本文详细描述了猪心脏切片的实验方案，该方案与人源心脏切片的制备和培养流程完全相同。本研究所描述的新型仿生培养体系可通过MTT法评估证实，能够将猪心脏切片的存活状态维持达6天之久（图1A）。我们通过检测钙稳态和收缩力进一步确认了这些切片在6天内的功能性活力。在培养的前6天内，心肌细胞无自发性钙瞬变，且对体外电刺激以及β-肾上腺素能刺激的反应与新鲜心脏切片相似（图1B）。此外，培养的.......
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讨论
本文详细描述了我们近期发表的一种简化中等通量（每个装置可处理多达48个切片）视频实验方案，该方法能够将猪心脏切片在体外长期培养，足以用于急性心脏毒性测试13。所提出的培养条件模拟了心脏所处的生理环境，包括电刺激频率、营养物质供应以及间歇性供氧。我们认为，这种仿生刺激培养体系能够延长心脏切片的存活时间，关键在于尽可能重现完整心脏所处的生理环境。这一观点得到了我们的数据支持：单独进行电刺激而未提供必要营养成分时，不足以维持心脏切片的存活能力13。因此，培养基中新增的组分是延长心脏切片在体外存活和功能维持的主要因素。我们发现，在培养基中添加胎牛血清（FBS）对维持切片存活至关重要，这可能是由于心脏组织在体内通常依赖血清提供多种脂肪酸、微量元素、酶、蛋白质、大分子、化学成分以及激素17。此外，我们发现向培养基中添加成纤维细胞生长因子（FGF）和血管内皮生长因子（VEGF）有助于增强组织的存活能力。FGF和VEGF是已知的促血管生成因子，对维持体外培养的内皮细胞至关重要.......
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披露
TMAM 持有 Tenaya Therapeutics 的股权。其他作者报告无利益冲突。
致谢
TMAM 受美国国立卫生研究院（NIH）资助 P30GM127607 和美国心脏协会资助 16SDG29950012 支持。RB 受 P01HL78825 和 UM1HL113530 资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,000 mL，0.22 µm，真空过滤/储存系统 | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-丁二酮单肟（BDM） | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL，0.22 µm，真空过滤/储存系统 | VWR | 28199-788 | |
| 6孔C型培养皿盖（电刺激板盖） | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6孔板 | Fisher | 08-772-1B | |
| 琼脂糖 | Bioline USA | BIO-41025 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM（细胞培养电刺激仪） | Ion Optix | CEP100 | |
| 氯化钙（CaCl2） | Fisher | C79-500 | |
| 振动切片机用陶瓷刀片 | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley 胸部牵开器 | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-葡萄糖 | Fisher | D16-1 | |
| 一次性手术刀 #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon 细胞筛，无菌，Corning | VWR | 21008-952 | |
| 胎牛血清 | Thermo | A3160502 | |
| Graefe 镊子 | Fisher | NC9475675 | |
| 肝素钠盐 | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE 组织胶 | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| 虹膜弹簧剪 | Fisher | NC9019530 | |
| 虹膜直剪 | Fisher | 731210 | |
| 异氟烷，USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS 液体培养基添加剂 | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| 盐酸氯胺酮（500 mg/10 mL） | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| 氯化镁（MgCl2） | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut 外科剪刀 | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199，Earle's 盐 | Thermo | 11-150-059 | |
| 氧气调节器 | Praxair | ||
| 氧气瓶 - | Praxair | ||
| 塑料巴斯德吸管 | Fisher | 13-711-48 | |
| 氯化钾（KCl） | Fisher | AC193780010 | |
| 打印机同步带 | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| 矩形剃须刀片 | Fisher | 12-640 | |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| 重组人血管内皮生长因子 | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| 可伸缩手术刀 | Fisher | 22-079-716 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO3） | Fisher | AC217125000 | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher | AC327300010 | |
| 振动切片机 | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| 盐酸赛拉嗪（100 mg/mL） | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
参考文献
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10(2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A.
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重印与许可
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