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方法文章

细菌群落的延时成像及其集体应激反应

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DOI：

10.3791/60915

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2020年5月23日

 ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 2Department of Physics & Astronomy, University of California, Irvine, 3Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen

本文内容

摘要

我们详细介绍了一种利用平板文档扫描仪生成高分辨率时间序列电影的简单方法，用于观察铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）群体在噬菌体（phage）和抗生素胁迫下的群体迁移行为。该方法可快速、简便地监测群体运动动态，也可经适当调整后用于研究其他细菌物种的运动性与生长特性。

摘要

群集运动是多种细菌物种中观察到的一种表面运动形式，包括Pseudomonas aeruginosa和Escherichia coli。在此过程中，高密度的细菌群体在数小时内以特征性的须状群落形式在表面长距离移动。群集运动对多种因素敏感，包括培养基湿度、环境湿度和营养成分。此外，集体应激反应——在受到抗生素或噬菌体（phage）胁迫的P. aeruginosa中可观察到——会排斥菌群向胁迫区域靠近。本文所述方法旨在控制影响群集运动的关键因素。我们介绍了一种利用平板文档扫描仪以高时间分辨率监测群集动态和集体应激反应的简便方法，并描述了如何整合数据并对菌群进行定量分析。这种简单且成本低廉的方法可实现对群集运动的精确且良好控制的量化，也可拓展应用于其他类型的基于平板的生长测定及其他细菌物种。

引言

群集运动是一种集体性的协调细菌运动形式，可增强细菌对抗生素的耐药性，并促进其在宿主中产生毒力因子1,2,3。这种多细胞行为通常发生在半固体表面，类似于覆盖在肺部上皮膜上的黏液层4,5。群集生长的细菌群体通常会产生生物表面活性剂，以克服表面张力，而这些表面活性剂的生成受到复杂的细胞间信号系统（即群体感应）的调控6,7,8。多种细菌均具备群集能力，包括Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus 和 Escherichia coli9,10,11,12。细菌形成的群集模式具有多样性，且受表面层的物理和化学性质影响，包括营养成分、孔隙度和湿度13,14。除表面特性外，生长温度和环境湿度也会影响群集动力学的多个方面，包括群集速度和模式形态12,13,14,15。影响群集生长的各种培养变量给实验的可重复性以及结果的解读带来了挑战。本文介绍了一种简单且标准化的方法，通过延时成像技术对细菌群集的动力学过程进行长期监测。该方法详细说明了如何控制显著影响群集进程的关键生长条件。与传统的群集分析方法相比，这种延时成像方法能够在长时间内以高分辨率同时追踪多个群集的运动行为。这些优势提升了群集监测所获得数据的深度，并有助于识别影响群集行为的各种因素。

P. aeruginosa 的群集运动通过合成并释放鼠李糖脂和3-(3-羟基脂肪酰氧基)烷酸至周围环境而得以实现6,16。亚致死浓度的抗生素或噬菌体病毒感染所引发的应激可影响群集的组织结构。特别是，这些应激会诱导P. aeruginosa释放群体感应分子2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮，也称为假单胞菌喹诺酮信号分子（PQS）17,18。在包含两个群集种群的群集实验中，受应激诱导的种群所产生的PQS会排斥未经处理的群集进入含有应激的区域（图1）。这种集体应激反应构成了一种危险信号通讯系统，可向P. aeruginosa警示附近的威胁18,19。利用本文所述的时间推移成像方法，可以观察应激对P. aeruginosa的影响、集体应激反应的激活以及群集的排斥现象。本方案详细说明了以下操作步骤：（1）制备用于群集运动的琼脂平板；（2）培养P. aeruginosa以进行两种类型的实验（传统群集实验或集体应激反应实验）（图1）；（3）获取时间推移图像；（4）使用ImageJ软件对图像进行整合与分析。

简而言之， P. aeruginosa 从过夜培养物中取菌液点种于群游琼脂平板中央，同时 P. aeruginosa 被噬菌体感染或经抗生素处理的菌株被点样于卫星位置。其进展过程 P. aeruginosa 在湿度可控的37 °C培养箱中放置一台商用平板扫描仪，用于监测群集运动。通过软件控制扫描仪，在群集生长期间（通常为16–20 h）以固定时间间隔自动扫描培养板。该方法可同时获得最多六块直径10 cm的群集培养板的时间序列图像。图像被合成为视频文件，并利用免费的ImageJ软件对胁迫诱导菌群引起的群集排斥现象进行定量分析。实验过程中特别关注不同群集实验之间的一致性与可重复性。

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方案

1. 准备用于群集运动的琼脂平板 P. aeruginosa 群集运动延时成像

  1. 在玻璃瓶中加入 64 g Na2HPO4•7H2O、15 g KH2PO4 和 2.5 g NaCl 至 500 mL 去离子水（ddH2O）中，配制 1 L 的 5× M8 最小培养基。用额外的 ddH2O 定容至 1 L。经高压灭菌后，于室温下保存液体培养基。
  2. 在玻璃瓶中将 24.6 g MgSO4•7H2O 溶于 50 mL ddH2O 中，配制 100 mL 的 1 M MgSO4（硫酸镁）。用额外的 ddH2O 定容至 100 mL。经高压灭菌后，于室温下保存。
  3. 在玻璃瓶中将 20 g 酪蛋白氨基酸（casamino acids）溶于 50 mL ddH2O 中，配制 100 mL 的 20% 酪蛋白氨基酸溶液。用额外的 ddH2O 定容至 100 mL。经高压灭菌后，于室温下保存。
  4. 在玻璃瓶中将 20 g 葡萄糖溶于 50 mL ddH2O 中，配制 100 mL 的 20% 葡萄糖溶液。用额外的 ddH2O 定容至 100 mL。使用 0.22 µm 滤膜过滤灭菌。于室温下保存。
  5. 为制备 10 块群集运动琼脂平板，在 250 mL 锥形瓶中加入 1 g 琼脂至 100 mL ddH2O 中，并用额外的 ddH2O 定容至 160 mL。通过高压灭菌进行灭菌。
    1. 高压灭菌后，立即将琼脂溶液置于 55 °C 水浴中 15 分钟。
    2. 从水浴中取出琼脂溶液，加入 40 mL 5× M8 最小培养基、200 µL 1 M MgSO4、2 mL 20% 葡萄糖和 5 mL 20% 酪蛋白氨基酸15。混合后立即进行步骤 1.6。
      注：最终浓度为 0.5% 琼脂、1 mM MgSO4、0.2% 葡萄糖和 0.5% 酪蛋白氨基酸。
  6. 使用 25 mL 移液管，确保每块直径 10 cm 的培养皿中加入 20 mL 群集运动琼脂溶液。
    注：琼脂溶液的固定体积至关重要，因为体积会影响琼脂的干燥时间和含水量。制备群集运动琼脂平板时应避免产生气泡。
  7. 将群集运动琼脂平板盖上皿盖，单层叠放，在室温下静置 1 小时，使琼脂完全凝固。在进行下一步操作前 1 小时开启除湿机，将室内相对湿度降至 40–50%。
  8. 将群集运动琼脂平板在室温、相对湿度 40–50%、风速 300 ft3/min 的超净工作台中敞盖干燥 30 分钟。将皿盖内面朝上放置于超净工作台中，使其内表面同步干燥。群集运动琼脂平板可在 4 °C 保存最多 24 小时。
  9. 为成像准备黑色 10 cm 培养皿皿盖：使用砂纸打磨皿盖内表面使其光滑。将皿盖放入包装盒中，并将包装盒置于化学通风橱下。使用黑色喷漆喷涂皿盖内部，待其自然干燥。
    注：黑色皿盖可重复用于后续实验。必须对皿盖进行喷涂处理，以确保其在扫描过程中不反光。

2. 生长 P. aeruginosa 和铺板条件

  1. 通过将10 g LB-Miller粉末混合物加入400 mL ddH2O中，制备400 mL的溶菌肉汤（LB）。若制备2% LB-琼脂培养皿，则额外加入8 g琼脂。经高压灭菌以实现灭菌。
  2. 将20 mL熔融的LB-琼脂培养基倒入直径为10 cm的培养皿中，于室温下静置过夜使其凝固。液体培养基在室温保存，琼脂平板则保存于4 °C。
  3. 使用无菌接种环或木棒，从-80 °C保存的冻存菌种中在LB-琼脂培养皿上划线接种P. aeruginosa。将培养皿倒置，在37 °C下培养过夜。LB-琼脂平板可在4 °C保存最多1周。
  4. 用无菌接种环或木棒挑取培养皿中的单个菌落，接种至2 mL LB液体培养基中，并在37 °C、100 rpm转速的摇床中培养至饱和（16–18 h）。
  5. 使用P20移液器吸取第2.4步的过夜培养物5 µL，从距离点样区域上方2.5 cm处以10–45°角度接近培养基表面，将移液器压至第一档，仅让液滴接触琼脂表面，在群游琼脂平板中心点样（图1B）。
    1. 避免移液器枪头接触琼脂表面，以免损伤琼脂。使用模板以确保在不同群游琼脂平板上点样位置一致（补充图S1）。
    2. 对于传统群游实验，仅使用中心点样，随后跳至第2.8步。对于集体应激反应实验，请继续进行第2.6步（用于噬菌体感染）或第2.7步（用于抗生素应激）。
  6. 进行噬菌体感染时，将第2.4步获得的30 µL P. aeruginosa过夜培养物与6 µL浓度为1 × 1012 pfu/mL的噬菌体DMS3vir20混合。立即进行下一步操作。
    1. 使用P20移液器吸取第2.6步的P. aeruginosa-噬菌体混合液6 µL，以距离点样区域上方2.5 cm处10–45°角度接近培养基表面，压至移液器第一档，仅让液滴接触琼脂，在以培养皿中心为圆心、半径2.8 cm的同心圆上等距点样6个卫星位点（图1C）。
    2. 避免移液器枪头接触琼脂表面，以免损伤琼脂。使用接种模板以确保一致性（补充图S1）。随后进行第2.8步。
  7. 进行抗生素处理时，将第2.4步获得的30 µL P. aeruginosa过夜培养物与以下任一种抗生素混合：6 µL 3 mg/mL庆大霉素、10 µL 100 mg/mL卡那霉素或7.5 µL 100 mg/mL磷霉素。立即进行下一步操作。
    1. 使用P20移液器吸取第2.7步经抗生素处理的P. aeruginosa菌液6 µL，以距离点样区域上方2.5 cm处10–45°角度接近培养基表面，压至移液器第一档，仅让液滴接触琼脂，在以培养皿中心为圆心、半径2.8 cm的同心圆上等距点样6个卫星位点（图1D）。
    2. 避免移液器枪头接触琼脂表面，以免损伤琼脂。使用接种模板以确保一致性（补充图S1）。随后进行第2.8步。
  8. 将透明培养皿盖替换为第1.9步制备的黑色盖子（图2A）。
  9. 将群游琼脂平板置于设定为37 °C的培养箱内的扫描仪上，并配备10 L水浴以维持75%的湿度（图1E，图2B）。
    注意：切勿扰动群游琼脂平板上的点样细胞。始终保持平板朝上放置。

3. 使用扫描仪进行图像采集

  1. 通过在平板式文档扫描仪上方 40–60 cm 处的支架上安装黑色哑光布料，降低培养皿周围的环境光照。使用扎带固定（图 2B）。
  2. 扫描仪将通过扫描软件和自动脚本软件进行控制。
    1. 在扫描软件中，选择 主页模式（图 3A）。在 图像类型 下选择 彩色 以采集彩色图像。为设置图像质量，在 目标 下选择 其他，并将 分辨率 调整为 300 dpi。在 目标尺寸 中选择 原始尺寸，以保持图像的标准大小。在 图像调整 下的所有选项均保持未勾选状态，以确保标准图像质量。
      注意：目标尺寸默认设置为原始尺寸。如需选择其他目标尺寸选项，需先点击 预览。
  3. 点击“扫描至”右侧的文件夹图标，打开文件保存设置，以设置图像的保存路径（图 3A）。
    1. 在 位置 下选择 其他，然后点击 浏览，选择用于保存图像的文件夹。
    2. 在 前缀 文本框中为图像命名。将 起始编号 设为 001，以开始图像的命名序列。在 图像格式 的 类型 中选择 JPEG (*.jpg)，将文件格式设置为 JPEG，并点击 选项 以调整 详细信息。通过将 压缩级别 调整为 16，编码 设置为标准，并勾选 嵌入 ICC 配置文件，来设定图像格式质量。点击 确定 关闭窗口（图 3B）。
    3. 保持第一个选项未勾选（"覆盖同名文件"），并勾选接下来的三个选项（"下次扫描前显示此对话框"、"扫描后打开图像文件夹" 和 "扫描后显示添加页面对话框"）。点击 确定 关闭窗口。
    4. 点击 预览 检查图像质量。预览窗口将出现，且 扫描 图标变为可操作状态（图 3C）。
  4. 使用脚本软件自动执行图像采集。所提供的脚本每隔 30 分钟点击一次扫描窗口中的“扫描”按钮和文件保存设置窗口中的“确定”按钮。
    1. 通过点击 任务 | 导入 导入脚本，并选择 Single_scan.tsk 和 Idle_scanning.tsk（TSK 文件作为 补充文件 1 和 2 提供）。参见 图 3D。
      注意：Single_scan.tsk 点击扫描窗口中的 扫描 按钮和文件保存设置窗口中的 确定 按钮。Idle_scanning.tsk 每 30 分钟激活一次 Single_scan.tsk。用户可通过修改 Idle_scanning.tsk 的激活频率来更改扫描间隔。
    2. 通过选择 Idle scanning (imported) 和 Single scan (imported)，右键点击 Idle scanning (imported)，然后左键点击 启用，以启用每 30 分钟一次的自动扫描（图 3D，补充图 S2）。
      注意：自动扫描将持续运行，直到用户手动停止脚本。要停止脚本，请选择 Idle scanning (imported)，右键点击 Idle scanning (imported)，然后左键点击 启用，勾选标记将被移除。

4. 汇编延时图像并测量群体排斥反应

  1. 使用 ImageJ 进行视频编辑和图像分析。
  2. 通过点击 文件 | 导入 | 图像序列 并选择图像，将所有扫描图像导入 ImageJ。在 序列选项 窗口中，勾选 转换为 RGB 以保持图像彩色。图像数量 表示所选图像的数量。
  3. 将 起始图像 保持为 1，以从文件夹中的第一张图像开始；将 缩放图像 设置为 100%，以保留图像原始尺寸。不要勾选 使用虚拟堆栈。点击 确定 并等待图像加载（图 4A）。
  4. 通过点击 编辑 | 选项 | 输入/输出…，将视频压缩级别设置为 100，并将 JPEG 质量 调整为 100。
  5. 通过点击 文件 | 另存为 | AVI 将文件保存为 .avi 格式。将 压缩 调整为 JPEG，将 帧速率 调整为 5 fps（图 4B）。将该 .avi 格式的延时视频保存至目标文件夹。
  6. 为量化群集排斥距离，在 ImageJ 中打开一张接近群集阶段末期的图像。点击 文件 | 打开 并选择图像。通过点击 分析 | 设置比例尺 进行比例调整，将 像素距离 设置为 118，已知距离 设置为 1，像素纵横比 设置为 1.0，长度单位 设置为 cm（图 4C）。不要勾选 全局。点击 确定 关闭窗口。
  7. 点击 直线图标，从卫星位置处菌落的中心测量至群集群体边缘。选择 分析 | 测量，将弹出一个显示测量结果（长度）的新窗口（图 4D）。
    注：使用 "+" 放大，使用 "-" 缩小。

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结果

培养P. aeruginosa、对细胞施加胁迫并成像群集运动琼脂平板的步骤如图1所示。我们将LB琼脂平板上的野生型P. aeruginosa UCBPP-PA14菌株单菌落接种于2 mL LB液体培养基中，在37 °C下过夜培养，并将5 µL菌液点样于群集运动琼脂平板的中心。对该平板进行延时成像，可观察到菌落在中心处初始生长，随后呈辐射状向外延伸出须状结构（视频1）。在进行群体胁迫响应检测时，除在中心点样P. aeruginosa外，还将30 µL相同过夜培养物与6 µL浓度为1 × 1012 pfu/mL的DMS3vir噬菌体或6 µL浓度为3 mg/mL的庆大霉素按5:1的比例混合，取6 µL混合液点样于卫星位置。菌群从群集运动琼脂平板的中心向边缘移动时，会受到被噬菌体感染（视频2，左上平板）或经庆大霉素处理（视频2，右上平板）的细菌所释放的胁迫信号的排斥。而仅在卫星位置点样噬菌体（视频2，...

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讨论

本实验方案的重点是尽量减少群集运动琼脂平板中的变异性，并提供一种简单且低成本的方法，用于获取P. aeruginosa群集运动及其对胁迫响应的时间序列图像。通过调整培养基成分和生长条件，该方法可进一步扩展至其他细菌系统的成像研究。对于P. aeruginosa，尽管可使用M9或FAB最低培养基诱导其群集运动16,21，但本文所述方案采用含酪蛋白氨基酸、葡萄糖和硫酸镁的M8培养基6。P. aeruginosa的群集运动对培养基成分十分敏感，例如铁的可利用性以及包括氨基酸在内的营养来源22,23,24。因此，群集运动琼脂平板培养基的选择体现了群集运动能力检测中的一个重要环节。

在开放的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

J.-L.B.、A.S. 和 N.M.H-K. 撰写并修改了稿件。所有作者共同设计了实验。J.-L.B. 完成了实验与分析。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）授予 A.S. 的 K22AI112816 和 R21AI139968 项目资助，以及加州大学的支持。N.M.H-K. 获得了伦德贝克基金会（Lundbeck Fellowships）R220-2016-860 和 R251-2017-1070 的资助。资助方未参与决定提交本作品发表的相关事宜。我们无任何竞争利益需要声明。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
脱水琼脂（Bacto agar, dehydrated）BD Difco214010用于LB琼脂平板和群集运动琼脂平板
酪蛋白氨基酸（Casamino acids）BD Difco223050用于群集运动培养基
D-葡萄糖（D-Glucose）Fisher ChemicalD16500右旋糖。用于群集运动培养基
磷霉素二钠盐（Fosfomycin disodium salt）东京化学工业株式会社（Tokyo Chemical Industry）F0889储存浓度：200 mg/mL。溶于ddH2O
硫酸庆大霉素（Gentamycin sulfate）Sigma-AldrichG1914储存浓度：3 mg/mL。溶于ddH2O
硫酸卡那霉素（Kanamycin sulfate）Sigma-Aldrich60615储存浓度：100 mg/mL。溶于ddH2O
LB-MillerBD Difco244620用于LB肉汤和LB琼脂平板
七水合硫酸镁（Magnesium sulfate heptahydrate）Sigma-Aldrich230391用于群集运动培养基
磷酸二氢钾（Potassium phosphate monobasic）Sigma-AldrichP0662用于5x M8培养基
氯化钠（Sodium chloride）Sigma-AldrichS9888用于5x M8培养基
七水合磷酸氢二钠（Sodium phosphate dibasic heptahydrate）Fisher ChemicalS373用于5x M8培养基
菌株
Pseudomonas aeruginosaSiryaporn实验室AFS27E.118PA14菌株
DMS3virO'Toole实验室DMS3vir20噬菌体
耗材
氧化铝砂纸3M150 Fine用于黑色盖子
黑色织物JoannPRD7089黑色织物
黑色喷漆Krylon5592 Matte Black用于黑色盖子
锥形瓶Kimax26500250 mL
玻璃储存瓶Pyrex13951L250 mL、500 mL、1,000 mL
8英寸扎带Gardner BenderE173770用于固定哑光黑色织物
培养皿（100 mm × 15 mm）FisherFB0875712100 mm × 15 mm聚苯乙烯培养皿
木棒Fisher23-400-102用于划线和接种细菌
设备
高压灭菌器Market Forge IndustriesSTM-E用于试剂灭菌
25 mL移液管USA Scientific, Inc.1072-5410用于移取20 mL群集运动琼脂平板用培养基
除湿机FrigidaireFAD704DWD 70-pint用于维持室温相对湿度约45%
ImageJNIHv1.52a图像分析软件
培养箱VWR89032-092用于在37 °C下培养细菌
Isotemp水浴锅Fisher15-462-21Q用于将培养基冷却至55 °C
层流罩The Baker CompanySG603A用于平板干燥
P-20移液器GilsonF123601用于在群集运动琼脂平板上点样
移液控制器BrandTechaccu-jet用于移取20 mL群集运动琼脂平板用培养基
摇床滚筒（Roller Drum）New BrunswickTC-7用于在100 rpm条件下培养细菌
扫描仪EpsonEpson Perfection V370 Photo用于平板成像
扫描仪自动化软件RoboTask Litev7.0.1.932用于每30分钟成像一次
扫描仪图像采集软件Epsonv9.9.2.5US用于平板成像的软件

参考文献

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