我们详细介绍了一种利用平板文档扫描仪生成高分辨率时间序列电影的简单方法，用于观察铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）群体在噬菌体（phage）和抗生素胁迫下的群体迁移行为。该方法可快速、简便地监测群体运动动态，也可经适当调整后用于研究其他细菌物种的运动性与生长特性。
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摘要
摘要
群集运动是多种细菌物种中观察到的一种表面运动形式，包括Pseudomonas aeruginosa和Escherichia coli。在此过程中，高密度的细菌群体在数小时内以特征性的须状群落形式在表面长距离移动。群集运动对多种因素敏感，包括培养基湿度、环境湿度和营养成分。此外，集体应激反应——在受到抗生素或噬菌体（phage）胁迫的P. aeruginosa中可观察到——会排斥菌群向胁迫区域靠近。本文所述方法旨在控制影响群集运动的关键因素。我们介绍了一种利用平板文档扫描仪以高时间分辨率监测群集动态和集体应激反应的简便方法，并描述了如何整合数据并对菌群进行定量分析。这种简单且成本低廉的方法可实现对群集运动的精确且良好控制的量化，也可拓展应用于其他类型的基于平板的生长测定及其他细菌物种。
引言
群集运动是一种集体性的协调细菌运动形式，可增强细菌对抗生素的耐药性，并促进其在宿主中产生毒力因子1,2,3。这种多细胞行为通常发生在半固体表面，类似于覆盖在肺部上皮膜上的黏液层4,5。群集生长的细菌群体通常会产生生物表面活性剂，以克服表面张力，而这些表面活性剂的生成受到复杂的细胞间信号系统（即群体感应）的调控6,7,8。多种细菌均具备群集能力，包括Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus 和 Escherichia coli9,10,11,12。细菌形成的群集模式具有多样性，且受表面层的物理和....
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方案
1. 准备用于群集运动的琼脂平板 P. aeruginosa 群集运动延时成像
- 在玻璃瓶中加入 64 g Na2HPO4•7H2O、15 g KH2PO4 和 2.5 g NaCl 至 500 mL 去离子水（ddH2O）中，配制 1 L 的 5× M8 最小培养基。用额外的 ddH2O 定容至 1 L。经高压灭菌后，于室温下保存液体培养基。
- 在玻璃瓶中将 24.6 g MgSO4•7H2O 溶于 50 mL ddH2O 中，配制 100 mL 的 1 M MgSO4（硫酸镁）。用额外的 ddH2O 定容至 100 mL。经高压灭菌后，于室温下保存。
- 在玻璃瓶中将 20 g 酪蛋白氨基酸（casamino acids）溶于 50 mL ddH2O 中，配制 100 mL 的 20% 酪蛋白氨基酸溶液。用额外的 ddH2O 定容至 100 mL。经高压灭菌后，于室温下保存。
- 在玻璃瓶中将 20 g 葡萄糖溶于 50 mL ddH2O 中，配制 100 mL 的 20% 葡萄糖溶液。用额外的 ddH2....
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结果
培养P. aeruginosa、对细胞施加胁迫并成像群集运动琼脂平板的步骤如图1所示。我们将LB琼脂平板上的野生型P. aeruginosa UCBPP-PA14菌株单菌落接种于2 mL LB液体培养基中，在37 °C下过夜培养，并将5 µL菌液点样于群集运动琼脂平板的中心。对该平板进行延时成像，可观察到菌落在中心处初始生长，随后呈辐射状向外延伸出须状结构（视频1）。在进行群体胁迫响应检测时，除在中心点样P. aeruginosa外，还将30 µL相同过夜培养物与6 µL浓度为1 × 1012 pfu/mL的DMS3vir噬菌体或6 µL浓度为3 mg/mL的庆大霉素按5:1的比例混合，取6 µL混合液点样于卫星位置。菌群从群集运动琼脂平板的中心向边缘移动时，会受到被噬菌体感染（视频2，左上平板）或经庆大霉素处理（视频2，右上平板）的细菌所释放的胁迫信号的排斥。而仅在卫星位置点样噬菌体（视频2，.......
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讨论
本实验方案的重点是尽量减少群集运动琼脂平板中的变异性，并提供一种简单且低成本的方法，用于获取P. aeruginosa群集运动及其对胁迫响应的时间序列图像。通过调整培养基成分和生长条件，该方法可进一步扩展至其他细菌系统的成像研究。对于P. aeruginosa，尽管可使用M9或FAB最低培养基诱导其群集运动16,21，但本文所述方案采用含酪蛋白氨基酸、葡萄糖和硫酸镁的M8培养基6。P. aeruginosa的群集运动对培养基成分十分敏感，例如铁的可利用性以及包括氨基酸在内的营养来源22,23,24。因此，群集运动琼脂平板培养基的选择体现了群集运动能力检测中的一个重要环节。
在开放的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
J.-L.B.、A.S. 和 N.M.H-K. 撰写并修改了稿件。所有作者共同设计了实验。J.-L.B. 完成了实验与分析。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）授予 A.S. 的 K22AI112816 和 R21AI139968 项目资助，以及加州大学的支持。N.M.H-K. 获得了伦德贝克基金会（Lundbeck Fellowships）R220-2016-860 和 R251-2017-1070 的资助。资助方未参与决定提交本作品发表的相关事宜。我们无任何竞争利益需要声明。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 脱水琼脂（Bacto agar, dehydrated） | BD Difco | 214010 | 用于LB琼脂平板和群集运动琼脂平板 |
| 酪蛋白氨基酸（Casamino acids） | BD Difco | 223050 | 用于群集运动培养基 |
| D-葡萄糖（D-Glucose） | Fisher Chemical | D16500 | 右旋糖。用于群集运动培养基 |
| 磷霉素二钠盐（Fosfomycin disodium salt） | 东京化学工业株式会社（Tokyo Chemical Industry） | F0889 | 储存浓度：200 mg/mL。溶于ddH2O |
| 硫酸庆大霉素（Gentamycin sulfate） | Sigma-Aldrich | G1914 | 储存浓度：3 mg/mL。溶于ddH2O |
| 硫酸卡那霉素（Kanamycin sulfate） | Sigma-Aldrich | 60615 | 储存浓度：100 mg/mL。溶于ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | 用于LB肉汤和LB琼脂平板 |
| 七水合硫酸镁（Magnesium sulfate heptahydrate） | Sigma-Aldrich | 230391 | 用于群集运动培养基 |
| 磷酸二氢钾（Potassium phosphate monobasic） | Sigma-Aldrich | P0662 | 用于5x M8培养基 |
| 氯化钠（Sodium chloride） | Sigma-Aldrich | S9888 | 用于5x M8培养基 |
| 七水合磷酸氢二钠（Sodium phosphate dibasic heptahydrate） | Fisher Chemical | S373 | 用于5x M8培养基 |
| 菌株 | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn实验室 | AFS27E.118 | PA14菌株 |
| DMS3vir | O'Toole实验室 | DMS3vir20 | 噬菌体 |
| 耗材 | |||
| 氧化铝砂纸 | 3M | 150 Fine | 用于黑色盖子 |
| 黑色织物 | Joann | PRD7089 | 黑色织物 |
| 黑色喷漆 | Krylon | 5592 Matte Black | 用于黑色盖子 |
| 锥形瓶 | Kimax | 26500 | 250 mL |
| 玻璃储存瓶 | Pyrex | 13951L | 250 mL、500 mL、1,000 mL |
| 8英寸扎带 | Gardner Bender | E173770 | 用于固定哑光黑色织物 |
| 培养皿（100 mm × 15 mm） | Fisher | FB0875712 | 100 mm × 15 mm聚苯乙烯培养皿 |
| 木棒 | Fisher | 23-400-102 | 用于划线和接种细菌 |
| 设备 | |||
| 高压灭菌器 | Market Forge Industries | STM-E | 用于试剂灭菌 |
| 25 mL移液管 | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | 用于移取20 mL群集运动琼脂平板用培养基 |
| 除湿机 | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | 用于维持室温相对湿度约45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | 图像分析软件 |
| 培养箱 | VWR | 89032-092 | 用于在37 °C下培养细菌 |
| Isotemp水浴锅 | Fisher | 15-462-21Q | 用于将培养基冷却至55 °C |
| 层流罩 | The Baker Company | SG603A | 用于平板干燥 |
| P-20移液器 | Gilson | F123601 | 用于在群集运动琼脂平板上点样 |
| 移液控制器 | BrandTech | accu-jet | 用于移取20 mL群集运动琼脂平板用培养基 |
| 摇床滚筒（Roller Drum） | New Brunswick | TC-7 | 用于在100 rpm条件下培养细菌 |
| 扫描仪 | Epson | Epson Perfection V370 Photo | 用于平板成像 |
| 扫描仪自动化软件 | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | 用于每30分钟成像一次 |
| 扫描仪图像采集软件 | Epson | v9.9.2.5US | 用于平板成像的软件 |
参考文献
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E.
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重印与许可
