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方法文章

细胞类型特异性尺度下研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）根发育的核糖体亲和纯化（TRAP）技术转化应用

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DOI：

10.3791/60919

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2020年5月14日

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1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

本文内容

摘要

核糖体亲和纯化（TRAP）技术能够在对器官和组织进行最少处理的情况下，解析发育过程。该方案可从表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的核糖体亚基的靶向细胞中提取高质量RNA。通过qRT-PCR或RNA-seq等下游分析工具，可揭示组织和细胞类型特异性的基因表达谱。

摘要

本文中，我们提供了通过核糖体亲和纯化（TRAP）方法及后续优化的低起始量文库制备技术，从不同Arabidopsis thaliana根部细胞类型中获取转译组数据的详细实验操作指南。

我们采用表达GFP标记的核糖体蛋白RPL18的植物品系作为起始材料，该表达通过使用适当的启动子实现细胞类型特异性。在免疫纯化和RNA提取之前，组织被迅速冷冻，以保持组织完整性，同时允许进行具有高时间分辨率的时间序列研究。值得注意的是，细胞壁结构保持完整，这是其他方法（如基于荧光激活细胞分选的技术）的主要缺陷，后者依赖于原生质体化来分离特定细胞群体。此外，与基于激光捕获显微切割的技术不同，本方法无需组织固定，因而能够获得高质量的RNA。

然而，从细胞亚群中取样并仅分离与多聚核糖体结合的RNA会严重限制RNA的得率。因此，有必要采用足够灵敏的文库制备方法，以确保通过RNA测序成功获取数据。

TRAP 为植物研究提供了一种理想的工具，因为许多发育过程都涉及细胞壁相关和机械信号通路。利用启动子靶向特定细胞群体，能够弥补器官水平与单细胞水平研究之间的空白，而这些传统方法往往分别受限于分辨率不足或成本过高。在此，我们应用 TRAP 技术研究侧根形成过程中的细胞间通讯。

引言

随着新一代测序技术应用的日益广泛，发育生物学中的空间分辨率得以提升。近年来的研究致力于将组织解析至特定的细胞类型，甚至达到单细胞水平1,2,3,4。为此，过去五十年中已开发出大量不同的方法（见图1A）5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。

植物科学中的许多工具都是对动物研究中首创的技术进行改造而来的。但我们在此详细介绍的方法却并非如此。2005年，Bailey-Serres实验室凭借其在蛋白质翻译领域的深厚背景，着手对核糖体蛋白进行改造，以实现后续的亲和纯化16。这样便可避免耗时且劳动强度大的多聚核糖体分析技术——该技术依赖于蔗糖梯度超速离心，自20世纪60年代以来一直用于评估正在翻译的核糖体17,18。该方法此后被称为翻译核糖体亲和纯化（translational ribosome affinity purification, TRAP）16。在植物中成功开展转译组研究后，Heiman等人将TRAP技术改造用于动物19，随后其他研究者又将其应用扩展至酵母20、Drosophila21、Xenopus22以及斑马鱼23,24。

尽管对模式系统进行遗传改造是 TRAP 技术的前提条件，这限制了其在易于遗传转化的物种之外的应用，但这一限制也可被同时利用，以靶向那些特别感兴趣且在完整组织/器官中原本极难分离的特定细胞亚群25（例如小鼠大脑中高度分支的树突细胞或受感染植物组织中的真菌菌丝）。在植物中，所有细胞均通过细胞壁固定在原位，而细胞壁构成了静水骨架的基础26。为了从该基质中释放植物细胞，科学家要么通过激光捕获显微切割（LCM）27将细胞从周围组织中物理切割出来，要么对细胞壁进行酶解消化28。在后一类方法获得的细胞（即所谓的原生质体）中，目标细胞群体可通过荧光激活细胞分选（FACS）7进行荧光标记并分离。LCM 通常需要将样品固定并包埋于石蜡中，这最终会降低其 RNA 的质量29。基于 FACS 的方法可获得高质量的 RNA，但原生质体制备过程本身会引入基因表达的差异30，且具有修饰化和厚的次生细胞壁的组织难以处理。此外，人们认为植物中的许多发育过程依赖于机械传导的信号，因此细胞壁的完整性至关重要31。有两种方法通过在细胞核水平上操作，绕过了细胞分离的步骤，即荧光激活核分选（FANS）和特定细胞类型中标记细胞核的分离（INTACT）。与 TRAP 类似，这些方法利用细胞类型特异性的启动子标记细胞核，随后分别通过分选或免疫沉淀富集标记的细胞核8,15。所有这些方法面临的一个主要挑战是从组织中的细胞亚群中获取足够量的 RNA 材料。由于 TRAP 仅捕获细胞内 RNA 的一小部分，样本收集成为显著的瓶颈。因此，需要特别灵敏的文库制备方案，以从极低输入量的样本中获得高质量的数据。

自从建立以来，TRAP 技术要么与 DNA 微阵列联用，要么随着近年来测序成本显著降低，与 RNA-seq10,32,33联用。大量研究问题已得到阐明，如 Sablok 等人所综述34。我们相信，随着该技术在结合不同启动子以靶向特定细胞类型方面表现出的高度灵活性，未来几年将会有更多相关报道出现。最终，该技术还将实现可诱导的方式，并可能与探究植物对多种生物和非生物胁迫因素反应的方法相结合。此外，在无法获得稳定转基因株系的情况下，毛状根表达系统也已成功用于番茄和苜蓿中的 TRAP 分析35,36。

RNA测序方法示意图；展示了细胞转录组分析的工作流程，包括RNA提取、流式细胞分选（FACS）以及TRAP测序，并包含可视化数据采集阶段。
图1：核糖体亲和纯化（TRAP）技术补充了“组学”分析工具集。 A. 通过多种方法或其组合，可实现越来越高的分析精度，达到单细胞甚至亚细胞分辨率。该示意图概述了目前在植物和动物领域可用的技术工具。通过LCM或FACS等方案可在细胞分辨率下采集组织样本，并进一步结合标准转录组或核糖体谱型/翻译组分析。TRAP和INTACT将组织捕获与RNA提取整合于一体，其原理基于表位标记。然而，INTACT仅针对细胞核进行采样，因此属于转录组分析的一种特殊情况。图中以小兔子图标标注了动物领域新近开发的方法：SLAM-ITseq和Flura-seq依赖于在表达许可酶的细胞中利用修饰的尿嘧啶碱基对新生RNA进行代谢标记，而Slide-seq则使用带有DNA条形码的包被玻片，以提供细胞尺度的空间位置信息。APEX-seq采用邻近标记策略，用于特异性地捕获特定亚细胞区室中的RNA。值得注意的是，分辨率的提升通常需要构建转基因材料（星号标注），因此这些方法主要应用于模式物种。TRAP特别适用于涉及细胞壁（CW）或机械信号传导的研究，以及那些难以从细胞壁基质中分离的细胞类型。 B. TRAP实验的详细湿实验步骤：在特定细胞类型（例如根内皮层）中表达GFP标记核糖体蛋白的幼苗，在培养皿中生长七天后，通过速冻法收集根组织材料。在通过离心去除碎片前，从匀浆粗提物中收集一份总RNA对照样品。向澄清的提取液中加入磁性抗GFP微珠，进行免疫沉淀。经过孵育及三次洗涤步骤后，直接通过苯酚-氯仿抽提法获得与多聚核糖体结合的RNA（TRAP/多聚核糖体RNA）。LCM：激光捕获显微切割，FACS/FANS：荧光激活的细胞/细胞核分选，APEX-seq：基于工程化抗坏血酸过氧化物酶的方法，INTACT：特定细胞类型中标记细胞核的分离，SLAM-ITseq：组织中RNA代谢测序的巯基（SH）连接烷基化法，Flura-seq：氟尿嘧啶标记RNA测序（使用Biorender.com创建） 请点击此处查看该图的放大版本。

本文的目的是详细介绍TRAP方法，强调关键步骤，并为可能的文库制备方法提供指导。

一个通用的 TRAP 实验基本包含以下步骤（另见图1B）：（1）植物材料的准备，包括核糖体标记载体的克隆、转基因株系的构建与筛选、种子的扩繁、种子的灭菌与点板、施加/处理胁迫（可选）以及组织取材；（2）免疫纯化，包括组织匀浆与粗提物澄清、磁珠洗涤与免疫纯化，以及洗涤步骤；（3）RNA 提取与质量评估；以及（4）文库构建。

的 拟南芥 根自被引入作为模式植物以来，一直是研究植物发育的模式系统37,38在此，展示了TRAP技术在植物侧根发育研究中的应用。在植物中，整个根系的形成依赖于该程序的执行，因此对生物体的生存至关重要。39。在 拟南芥，侧根起源于位于木质部导管旁的中柱鞘组织，因此被称为木质部极中柱鞘（XPP；参见 图 2C)40一些位于根部内部较深处的XPP细胞获得起始细胞特性，并在局部激素信号的诱导下，通过膨大和垂周分裂开始增殖。41然而，由于存在刚性的细胞壁基质，该过程会对周围组织施加机械应力。特别是覆盖其上方的内皮层会受到影响，因其位于侧根生长轴的路径上42,43,44确实，新形成的原基必须穿过其上方的内皮层细胞生长。图 2C2而皮层和表皮细胞则被推向两侧，以便原基最终突出形成45,46最近，我们实验室的研究表明，内皮层在主动促进中柱鞘细胞增殖过程中发挥重要作用。特异性阻断内皮层的激素信号通路，足以抑制初生木质部原形成层（XPP）细胞的首次分裂。47因此，中柱鞘-内皮层间的通讯构成了侧根发育的早期重要检查点 拟南芥然而，目前尚不清楚这种串扰是如何实现的。为了揭示这一机制，我们采用了TRAP-seq方法来靶向XPP和内胚层细胞。为了富集处于侧根发育程序中的细胞，我们通过外源施加生长素类似物（1-萘乙酸，NAA）来模拟激素诱导。48同时能够对侧根形成的初始阶段进行时间上的解析。

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方案

1. 转基因的克隆、转基因品系的构建与筛选

  1. 将选定的启动子克隆至合适的入门载体中。使用基于重组的克隆方法（材料表），并将启动子重组至pDONRP4-P1r中。使用基于重组的克隆方法将RPL18（携带选定的亲和标签或荧光蛋白）克隆至pDONRP1-P249中。
  2. 将含有RPL18的入门载体与含有启动子的入门载体通过双片段重组反应，共同重组至含有FAST-red筛选盒的相应目的载体中50，以实现对转基因种子的直接筛选。
  3. 通过测序验证重组载体的正确性，并将其转化至合适的感受态农杆菌中。对拟南芥（Arabidopsis）植株进行花序浸染法转化，3-4周后收获并筛选T1代种子51。
  4. 利用显微镜观察以鉴定表达良好的株系，并在多个独立株系中根据已报道的启动子活性验证其表达模式。选择具有代表性表达模式且仅含单个T-DNA插入的株系。这有助于减少基因沉默现象，并有利于后续的遗传杂交实验。
  5. 筛选标记基因纯合的T3代后代植株。

2. 扩增与灭菌

  1. 细胞类型特异性的TRAP技术可从每条根中有限数量的靶细胞分离RNA。为获得所需的起始材料，需扩增纯合品系。为此，应采用标准培养条件，并特别注意真菌生长的控制。
    注意：如果无法获得单插入位点的株系，可通过在大群体中繁殖少数几代来避免T-DNA引起的跨代表观沉默。
  2. 大量灭菌 拟南芥 用氯气处理一轮，再用70%乙醇处理一轮。
    1. 将种子均匀铺在12 cm × 12 cm的方形培养皿中（每皿种子体积少于0.3 mL），然后叠放于干燥器或其他合适的容器内。避免种子结块或堆积，以确保种子可充分接触气体。使用报道量的次氯酸钠和HCl进行过夜气体灭菌处理52在60 L干燥器中，将100 mL漂白剂（13%）与6 mL浓盐酸混合。在无菌容器中收集种子前，至少熏蒸1小时。
      警告：37% 盐酸具有强腐蚀性，需小心操作。氯气有毒，应使用通风橱。
    2. 取0.1 mL干燥且经气体灭菌的种子放入每块培养皿中，加入灭菌溶液（70% EtOH，0.01% Tween），于室温下混合。孵育20分钟，倾去乙醇，用无菌H₂O洗涤种子3–4次。2O.
    3. 将浸泡过的种子转移至50 mL离心管中，用无菌0.1%琼脂稀释，每板加入1 mL吸胀种子悬液（0.1 mL种子/1 mL悬液）。
      注意：由于转基因整合事件，植物品系可能对不同的消毒方法敏感；尤其是乙醇孵育时间被发现至关重要。在我们的实验中，双重消毒步骤对于避免实验过程中的真菌污染是必要的。这一点在进行时间序列实验时尤为重要，因为单个时间点的污染会影响整个实验。根据当地的生长条件，双重消毒可能并非在所有情况下都是必需的。

3. 涂布

  1. 提前准备以下步骤。根据实验所需数量（每个样品/时间点约 20-30 个），制备含 1% 琼脂的 ½ MS 培养基平板（pH 5.8）。使用剃刀刀片将 1 mL 移液器吸头前端切开，使其直径扩大至约 3-4 mm。对吸头进行高压灭菌。使用方形培养皿盖制作一个模板支架，用于在每个平板上排列三排种子。准备超净工作台以提供无菌操作环境，并对将要处理的平板进行标记。
    注意：若同时处理大量平板，可使用彩色标签以加快标记速度。
  2. 将空的琼脂平板放入模板支架中，将 1 mL 吸胀后的种子均匀分配至三个排。将处理好的平板叠放于超净台内，直至种子完全干燥（即牢固附着于琼脂表面）。切勿放置过久，以免琼脂脱水干裂。
  3. 待种子充分干燥后，盖上皿盖，并用微孔胶带密封每个平板。将种子在 4 °C 黑暗条件下春化处理两天，随后转移至生长室中培养。

4. 组织处理（可选）

注意：在本方案中，我们概述了外源性处理 拟南芥 根据具体实验问题，可对使用合成生长素类似物NAA处理根系的部分进行调整，或完全省略。

  1. 准备高度为 1.5 - 2 cm、长度为 10 cm 的滤纸条。若需延长孵育时间，使用前须将滤纸条进行高压灭菌处理。
  2. 取下所有需进行激素处理的培养皿上的微孔胶带。将 1 mL 10 mM NAA（溶于 DMSO）加入 1 L 液体高压灭菌的 ½ MS 溶液（pH 5.8）中稀释，使终浓度为 10 µM NAA，并将滤纸条浸入该溶液中。
  3. 用镊子将滤纸条贴附于每排根上，轻轻用手指去除气泡。倒出培养皿中多余的液体，盖上皿盖，并标记处理时间。若需延长孵育时间，将培养皿放回生长培养箱中。

5. 收获

  1. 取出每个生物学重复/时间点/处理组的培养板。用干净的杜瓦瓶收集液氮，并为不同组织样本标记好试管（15 或 50 mL）。准备一个泡沫塑料支架。
    注意：请熟悉液氮操作规程（通风、冻伤风险以及试管可能爆炸的危险）。
  2. 打开培养板，用镊子小心取出滤纸，注意不要将根从琼脂表面剥离。使用手术刀，在每一行的茎-根连接处果断地单次切割。在样品之间清洁刀片，并频繁更换以确保锋利。
  3. 用镊子沿每行根部刮取，将根分为三束收集。抓取根系并迅速转移至装有液氮的 50 mL 离心管中，进行速冻。
    注意：不要试图将根系聚集成紧密结构（如球状），否则下一步研磨时会困难。
  4. 按培养时间顺序处理构成同一样品的所有培养板，倒掉多余的液氮。用离心管盖防止根系洒出，然后盖紧管盖，将所有试管收集到杜瓦瓶中。将根组织在 -80 °C 下保存。

6. 免疫纯化

注意：此步骤旨在获得高质量的 TRAP/多聚核糖体 RNA。因此，必须严格遵守 RNA 操作的良好实践建议。本节所有步骤均需在无菌操作台中进行，并使用去除 RNase 的溶液清洁所有设备和实验器皿（材料表）。佩戴手套，并在手套被样品、冰或其他未经清洁的物质污染后立即更换。由于此环节极为关键，本文还特别包含有关设备重复使用及废物处理的建议部分。

  1. 缓冲液配制
    1. 根据表1配制储备液，并进行高压灭菌（A）或过滤除菌（₳）。除非另有说明，溶剂均为无RNase水。
    2. 按照表1所示溶剂分别溶解二硫苏糖醇（DTT）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、环己酰亚胺（CHX）和氯霉素（CAM），分装后于-20 °C保存。其余储备液可室温保存。
    3. 提前将储备液预混：洗涤缓冲液（WB）预混成分1-4，多聚核糖体提取缓冲液（PEB）预混成分1-6，以避免每次提取前耗时的缓冲液配制步骤。因此，在提取当天仅需加入水和冷冻保存的成分（7-10）。将预混的储备液和无RNase水置于4 °C保存。
      注意：DTT浓度为Zanetti等2005年报道浓度的1/5，因为纳米抗体与GFP的相互作用对高浓度DTT敏感。
成分储存浓度配制 50 mL WB* 所需添加体积（mL）配制 50 mL PEB* 所需添加体积（mL）
1Tris, pH 9A2 M55
2KClA2 M55
3EGTAA0.5 M2.52.5
4MgCl2A1 M1.751.75
5PTEA20% (v/v)02.5
6去垢剂混合物A02.5
Tween 2020% (v/v)
Triton-X 10020% (v/v)
Brij-3520% (w/v)
Igepal20% (v/v)
7DTT₳0.5 M0.10.1
8PMSF₳0.1 M (isopropanol)0.50.5
9Cycloheximide₳25 mg/mL (EtOH)0.10.1
10Chloramphenicol₳50 mg/mL (EtOH)0.050.05

表1：缓冲液成分及混合建议。 按照所示储存浓度和添加量混合以下试剂，可得到50 mL的WB或PEB缓冲液。Tris：三（羟甲基）氨基甲烷，EGTA：乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸，PTE：聚氧乙烯（10）十三醚，A：高压灭菌，₳：过滤除菌；*用无RNase的水定容至50 mL。

  1. 组织匀浆/研磨
    1. 预冷离心机，并将匀浆器和离心管置于冰上。解冻DTT、PMSF、CHX和CAM的分装液。根据当天所需样本数量，在50 mL离心管中按需混合PEB和WB的储存液，并置于冰上冷却。
      注意：PMSF应在使用前短时间内加入，因其在水中的半衰期仅为30分钟。
    2. 准备足量液氮并置于杜瓦瓶中，从-80 °C冰箱中取出组织样本。在标准实验手套内佩戴棉质手套，以防被低温研钵冻伤。向研钵和研杵中倒入液氮，直至其充分冷却至可进行研磨。建议建立一套区分不同研钵的系统（如贴标签或按固定顺序摆放）。
    3. 将组织样本倒入研钵中，小心研磨至全部材料呈白色粉末状。必要时可添加液氮以保持组织冷冻状态或促进更充分的研磨。
    4. 向样本中加入5 mL PEB缓冲液，并在缓冲液冻结前迅速与粉末混合。在该样本解冻过程中（期间可不时混匀），可同时处理下一个样本。
    5. 一旦混合物可转移，立即将匀浆液倒入玻璃匀浆器中并保持在冰上。再用2 mL PEB缓冲液冲洗研钵和研杵，并将冲洗液一并加入匀浆器中的样本中。
      注意：应避免样本完全液化，否则可能导致RNA降解。
    6. 手动研磨匀浆液，直至提取物均匀一致。建议至少进行4至5次上下抽动。
      注意：可能需要额外等待一段时间，使匀浆液进一步解冻。操作匀浆器时需格外谨慎，避免使用蛮力，并注意吸力影响。若未妥善处理，可能导致液体溢出、污染或匀浆器损坏。
    7. 将粗根提取物倒入50 mL离心管中（保持在冰上）。
      注意：通常可在转移前连续研磨多个样本。需并行处理研磨、转移和匀浆步骤。操作应迅速但不慌乱，保持冷静。所有匀浆后的样本始终置于冰上。
  2. 总RNA样本收集
    1. 将每份粗提样本的200 µL分装至已预先标记并冷却的洁净微量离心管中。
    2. 按照第7.1和7.2节中TRAP样本的详细步骤进行RNA提取。这些步骤可在样本离心澄清的同时进行。
    3. 对重悬的总RNA进行DNase处理，以去除DNA污染，并使用商业试剂盒（材料表）纯化反应产物。
      注意：总RNA提取通常获得较高浓度，样本需大幅稀释。建议采用灵敏的Qubit方法在稀释后测定浓度。
  3. 澄清粗提物
    1. 取第6.2.7步中冰桶内的样本，在4 °C条件下以16,000 x g离心15分钟。
      注意：为平衡离心机，应合理配对样本。若无法完全配对，可通过添加PEB调整其中一个样本的体积。
    2. 将上清液转移至新的离心管中（预先冷却于冰上），并重复离心（15分钟，16,000 x g，4 °C）。此转移操作可在离心机旁快速完成。
    3. 在粗提物澄清过程中，启动GFP磁珠的洗涤步骤（第6.6节）。
      注意：该冰桶可用于摇床上振荡，但不得放回无菌操作台，以防污染。
  4. 磁珠洗涤
    1. 将磁性GFP磁珠按每样本60 µL分装至1.5 mL离心管中（样本数 × 60 µL，材料表）。置于磁力架上，待磁珠聚集后弃去上清液。
    2. 加入1 mL冷WB缓冲液，重悬磁珠后再次收集，弃去洗涤液。再用1 mL WB缓冲液重复洗涤一次。
    3. 最后，将磁珠重悬于与第6.5.1步初始体积相同的WB缓冲液中。
  5. 免疫纯化（IP）
    1. 离心结束后立即把澄清的上清液转移至已标记的15 mL离心管中，并为每个样本加入60 µL已洗涤的磁珠。
    2. 将所有样本水平放入冰桶中，并置于摇床上。让混合物孵育2小时，使GFP标记的多聚体核糖体结合到磁珠上。
    3. 将磁珠置于适用于15 mL离心管的磁力架上（保持在冰上），并向剩余的PEB缓冲液中加入PMSF。弃去上清液。向磁珠中加入约5 mL PEB缓冲液，通过倾斜混匀。在与第6.6.2节相同的装置中振荡15分钟。
    4. 使用WB缓冲液再洗涤两次，共完成三次洗涤（1次PEB，2次WB）。每次更换缓冲液前均需加入PMSF。
    5. 将磁珠最终重悬于1 mL WB缓冲液中，并转移至1.5 mL离心管。最后一次在磁力架上收集磁珠，并彻底去除所有液体。盖紧管盖，置于冰上，直至所有样本处理完毕。
    6. 将样本转移至通风橱中进行RNA提取。
  6. 废弃物处理及实验用品再处理
    1. 若按照良好实验室规范操作（参见第2.2.1节），灭菌程序将产生氯化钠水溶液。让氯气以及残留的HCl和次氯酸钠在通风橱中充分排气。
    2. PEB和WB的废弃处理：由于CHX在高pH条件下会分解，应收集所有液体并调节pH>9。将液体废料作为卤代有机化学废料处理。所有固体（组织、移液管、手套等）均应作为化学废弃物处理。
    3. 含苯酚的液体应单独收集，苯酚污染的材料（枪头、离心管、手套等）也应单独收集。
    4. 使用肥皂手洗研钵、研杵和匀浆器（使用海绵和刷子），并彻底冲洗。随后在>220 °C条件下过夜烘烤。处理前可选择用锡箔纸包裹，或放入耐热且带盖的容器中。
    5. 用洗涤剂刷洗离心管，然后在通风橱中进行焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。具体操作为：将液体DEPC加入去离子水中（每1 L H2O加入1 mL DEPC），通过震荡混匀。将离心管放置于可高压灭菌的托盘上（用于承接溢出的DEPC水溶液），将配制好的溶液倒入离心管中，静置3小时或过夜。后续高压灭菌过程中DEPC会分解。
      警告：DEPC具有高毒性。

7. RNA 提取与质量控制

  1. RNA 提取
    1. 将台式离心机预冷至 4 °C。
    2. 向每个样品中加入 1 mL 基于酸性胍-苯酚的试剂（材料表），颠倒混匀以重悬珠粒或总 RNA 浆液，并在冰上孵育 5 分钟。切勿涡旋振荡！
    3. 加入 200 µL 氯仿，在冰上孵育 3 分钟，然后充分涡旋振荡样品。
    4. 为促进相分离，在 4 °C 条件下以最大转速离心 10–15 分钟。
    5. 标记 1.5 mL 低吸附离心管（材料表），并向每管中分装 650 µL 异丙醇。
    6. 小心吸取上层水相（约 650 µL），转移至预先加入异丙醇的离心管中。避免接触粉红色的有机相。
    7. 在 -20 °C 下过夜沉淀 RNA。
      注意：建议将样品保存在 -20 °C 或 -80 °C 的异丙醇中，仅在需要时用无 RNase 水溶解。即使在 -80 °C 下长期（数周至数月）储存，水溶液中的 RNA 也会降解。
  2. RNA 沉淀
    1. 将台式离心机预冷至 4 °C。
    2. 使用无 RNase 水配制新鲜的 80% 乙醇，并在 -20 °C 预冷（在 -80 °C 放置 5 分钟可加快冷却过程）。
    3. 以最大转速（约 13,000 × g）离心 30 分钟，弃去上清液。沉淀通常不可见，因此移液时需谨慎操作，假设有沉淀存在。加入 1 mL 冷的 80% 乙醇，轻轻颠倒离心管一至两次。
    4. 再次以最大转速离心 30 分钟，并重复洗涤一次，共洗涤两次。
    5. 以 2 分钟短离心去除残留乙醇，使用 10 µL 吸头彻底吸除所有残余乙醇。将沉淀在室温下干燥 3–5 分钟（不可过久），然后用 20 µL 无 RNase 水重悬。
    6. 将样品置于冰上，并尽快进行质量控制。随后将样品储存于 -80 °C。避免反复冻融。
  3. 使用专用设备（材料表）按照制造商推荐方法进行质量控制。

8. 文库构建

  1. 使用 SMARTer v4 Ultra Low Input RNA Kit 进行 cDNA 合成与扩增
    1. 计算各样本的稀释比例，使 4.75 µL 体积中含有 1.5 ng 的 TRAP-RNA 或总 RNA。所有反应均在 PCR 管中进行，并使用无 RNase 水的新鲜分装液稀释样本。
    2. 按照制造商推荐的操作步骤进行，使用 ½ 反应体积。采用 12–13 个 PCR 循环扩增 cDNA。
    3. 通过加入 0.5 µL 的 10x 裂解缓冲液和 25 µL SPRI 磁珠（材料表）对 PCR 产物进行纯化。若处理多个样本，可预先混合裂解缓冲液和磁珠。移液前确保磁珠均匀分散。
    4. 后续步骤按完整反应体积进行（加入 17 µL 洗脱缓冲液）。磁珠干燥时间不得超过 3 分钟。若样本过度干燥，可通过延长孵育时间尝试挽救。
    5. 使用 Qubit HS DNA 试剂盒测定样本浓度。
      注意：SMARTer v4 试剂盒可耐受低至 200 pg 的起始量。在某些情况下，即使 Qubit 无法检测到浓度（低于 250 pg，检测限），通过 16 个 PCR 循环仍可获得文库。然而，起始材料过少可能导致文库复杂度降低。
  2. 使用 Nextera XT DNA 文库制备试剂盒进行片段化与接头连接 PCR
    1. 用无 RNase 水稀释 cDNA，使其浓度达到 200 pg/µL，并移取 1.25 µL 至 PCR 管中。
    2. 按照制造商说明书操作，使用 ¼ 反应体积。采用 12 个 PCR 循环对 cDNA 进行扩增，并为属于同一次测序池的样本使用兼容的接头。使用 Illumina 的 Index Kit A 和 D 最多可实现 384 个样本的多重测序。
    3. PCR 纯化时加入 12.5 µL 重悬缓冲液和 22.5 µL SPRI 磁珠（0.9x 比例）。用 22 µL 洗脱缓冲液洗脱样本。
      注意：质控与文库混合由测序公司（材料表）完成，因此无需基于磁珠的标准化。酶促片段化反应（tagmentation）对投入材料量极为敏感，因为每个酶仅切割一次。因此，切勿超过推荐的浓度。

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结果

为进行质量评估，应对上述流程的多个中间步骤进行检测：包括在植株中验证表达模式、对分离的多聚核糖体RNA以及最终文库进行质量控制。此外，还可通过已知标记基因进行qRT-PCR，以确认对处理条件的响应或优化实验条件。

共聚焦分析 GFP 信号分布
为了检测内胚层和 XPP 的表达模式，我们通过共聚焦显微镜分析了 pELTP::GFP-RPL18 和 pXPP::GFP-RPL18 的纯合品系。图 2A 和 图 2B 显示了具有 GFP 信号（绿色）的代表性植株，其细胞壁经碘化丙啶复染（品红色）以清晰界定。在 图 2A1<...

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讨论

验证 RPL18 的定位模式
避免对任何 TRAP 实验数据产生误读的关键在于标记核糖体亚基的正确表达模式。因此，将 GFP 作为表位标签融合到 RPL18 上，可优雅地实现对目标表达模式的验证，并随后从同种组织中沉淀多聚核糖体组分。为确保启动子驱动模式正确，Jiao 和 Mayerowitz 于 2010 年采用过更为侵入性的方法，该方法需要进行 GUS 染色；Tian 等人于 2019 年的方法则依赖于使用抗 FLAG 抗体的免疫染色58,59。

我们强烈建议在每一代中都检测定位模式，因为T-DNA转基因株系容易发生沉默，从而导致信号强度减弱或表达种子的比例下降。由于构建体中包含了GFP标签，这些常规检测可通过显微镜轻松完成。

然而，即使进行详尽的共聚焦分析，在某些情况下也可能得出错误的结论。我们希望通过在构建对照TRAP品系时的失败尝试来强调这一问题。迄今为止...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢苏黎世遗传多样性中心的 Jean-Claude Walser 在本项目初期阶段提供的关键性专业建议。Vermeer 实验室的工作得到了瑞士国家科学基金会（SNSF）授予 JEMV 的 SNF 教授职位资助（PP00P3_157524）和 R'EQUIP 设备资助（316030_164086）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
灭菌
次氯酸钠溶液，13%Sigma71696
烧杯VWR214-1172/74/75
带瓷板的干燥器（DURAN）Sigma/MerckZ317454-1EA/Z317594-1EA
乙醇，分析纯Honeywell02860-1L
盐酸，37%Roth4625.1
Tween 20SigmaP9416
平板培养与收获
MS盐，基础盐混合物，含MES缓冲液DuchefaM0254
植物细胞培养用琼脂Applichem/PanreacA2111.1000
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD4540
镊子Rubis Switzerland5-SA 型号
氢氧化钾（KOH）Fluka60370
微孔胶带/外科手术胶带3M1530-0
萘乙酸（NAA）DuchefaN0903
培养皿 120×120 mmGreiner bio-one688102
手术刀VWR/Swann-Morton233-5454
中性双层擦拭纸任选供应商
免疫沉淀
GFP磁珠：gtma-100 GFP-Trap_MAChromotek例如 gtma-100
Brij-35SigmaP1254-500G
离心管（与离心机匹配）Beckman Coulter357001
氯霉素ApplichemC0378-25G
棉质手套VWR113-7355
放线菌酮，HPLC级Sigma01810-1G
DEPCVWRE174可能交货周期较长
二硫苏糖醇（DTT）Fluka43815
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）Sigma3054.3
DUALL 23型匀浆器KONTES GLASS CO (通过VWR购买)SCERSP885450-0023（整套）仅研杵 SCERSP885451-0023；仅研钵 SCERSP885452-0023；交货周期较长
Igepal CA-360SigmaI3021-100ml
氯化钾（KCl）Sigma60130
六水合氯化镁（MgCl2 hexahydrat）Roth2189.2
研钵和研杵VWR470148-960 & 470019-978
苯甲基磺酰氟（PMSF）Roche10 837 091 001
聚氧乙烯-(10)-十三醇醚（PTE）SigmaP2393-500G
无RNase水RothT143.3
RNAZapThermo FisherAM9780/AM9782用于表面清洁
Tris，>99.3%RothAE15.3
吐温X-100（Triton X-100）FlukaT8787-250ml
Tween 20SigmaP9416-100ml
RNA提取
异丙醇，分析纯Sigma33539-1L-GL-R
氯仿，HPLC级ScharlauCL02181000
乙醇，分析纯Honeywell02860-1L
低吸附微量离心管，1.5 mlEppendorf/SigmaZ666548-250EALoBind
无RNase的DNase试剂盒Qiagen79254
RNeasy MiniElute 纯化试剂盒Qiagen74204
TRIzol试剂ThermoFisher/Ambion15596018
文库构建
15/50 mL 管磁力分离器AbraxisPN 472250
AMPure磁珠Beckman CoulterA63881
Index Kit AIlluminaFC-131-2001
Index Kit DIlluminaFC-131-2004
钕磁铁Amazon/其他6 × 1.5 mm，N42级（NdFeB）
Nextera XT试剂盒IlluminaFC-131-1024/1096https://emea.support.illumina.com/
PCR排管ThermoScientificAB-0266
SMARTer v4试剂盒Takara Bioscience634892https://www.takarabio.com/
BioanalyzerAgilent2100 Bioanalyzer Instrument用于RNA/DNA质量控制的专用设备
TapestationAgilent4200 Tapestation Instrument用于RNA/DNA质量控制的专用设备
Fragment AnalyzerAgilent5400 Fragment Analyzer System用于RNA/DNA质量控制的专用设备（高通量）
LabChipPerkinElmerLabChip GX Touch 核酸分析仪用于RNA/DNA质量控制的专用设备（高通量）
Qubit 4 荧光计ThermoFisherQ33239用于RNA/DNA浓度测定的专用设备
qRT-PCR
GATA23Microsynth正向引物：AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG；
反向引物：GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3Microsynth正向引物：CAAACCAATCCT
CCAAATGAC；
反向引物：ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29Microsynth正向引物：TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT；
反向引物：AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21Microsynth正向引物：TGCGACTCAGGG
AATCTTCT；
反向引物：TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR GreenBio-Rad#172-5270
iScript Adv cDNA合成试剂盒Bio-Rad#172-5038
其他
15 ml Falcon管，CellstarGreiner bio-one188261
50 ml Falcon管，CellstarGreiner bio-one210261
1 ml 滤芯吸头AxygenTF-1000-R-S
10 µl 滤芯吸头AxygenTF-10-R-S
100 µl 滤芯吸头AxygenTF-100-R-S
20 µl 滤芯吸头AxygenTF-20-R-S
200 µl 滤芯吸头AxygenTF-200-R-S
1.5 ml 微量离心管SARSTEDT72.690.001
碘化丙啶SigmaP4170-100MG
测序公司Novogeneen.novogene.com

参考文献

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TRAP RPL18 RNA GFP
细胞类型特异性尺度下研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）根发育的核糖体亲和纯化（TRAP）技术转化应用
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