核糖体亲和纯化（TRAP）技术能够在对器官和组织进行最少处理的情况下，解析发育过程。该方案可从表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的核糖体亚基的靶向细胞中提取高质量RNA。通过qRT-PCR或RNA-seq等下游分析工具，可揭示组织和细胞类型特异性的基因表达谱。
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方法文章
细胞类型特异性尺度下研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）根发育的核糖体亲和纯化（TRAP）技术转化应用
本文内容
摘要
摘要
本文中，我们提供了通过核糖体亲和纯化（TRAP）方法及后续优化的低起始量文库制备技术，从不同Arabidopsis thaliana根部细胞类型中获取转译组数据的详细实验操作指南。
我们采用表达GFP标记的核糖体蛋白RPL18的植物品系作为起始材料，该表达通过使用适当的启动子实现细胞类型特异性。在免疫纯化和RNA提取之前，组织被迅速冷冻，以保持组织完整性，同时允许进行具有高时间分辨率的时间序列研究。值得注意的是，细胞壁结构保持完整，这是其他方法（如基于荧光激活细胞分选的技术）的主要缺陷，后者依赖于原生质体化来分离特定细胞群体。此外，与基于激光捕获显微切割的技术不同，本方法无需组织固定，因而能够获得高质量的RNA。
然而，从细胞亚群中取样并仅分离与多聚核糖体结合的RNA会严重限制RNA的得率。因此，有必要采用足够灵敏的文库制备方法，以确保通过RNA测序成功获取数据。
TRAP 为植物研究提供了一种理想的工具，因为许多发育过程都涉及细胞壁相关和机械信号通路。利用启动子靶向特定细胞群体，能够弥补器官水平与单细胞水平研究之间的空白，而这些传统方法往往分别受限于分辨率不足或成本过高。在此，我们应用 TRAP 技术研究侧根形成过程中的细胞间通讯。
引言
随着新一代测序技术应用的日益广泛，发育生物学中的空间分辨率得以提升。近年来的研究致力于将组织解析至特定的细胞类型，甚至达到单细胞水平1,2,3,4。为此，过去五十年中已开发出大量不同的方法（见图1A）5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。
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方案
1. 转基因的克隆、转基因品系的构建与筛选
- 将选定的启动子克隆至合适的入门载体中。使用基于重组的克隆方法（材料表），并将启动子重组至pDONRP4-P1r中。使用基于重组的克隆方法将RPL18（携带选定的亲和标签或荧光蛋白）克隆至pDONRP1-P249中。
- 将含有RPL18的入门载体与含有启动子的入门载体通过双片段重组反应，共同重组至含有FAST-red筛选盒的相应目的载体中50，以实现对转基因种子的直接筛选。
- 通过测序验证重组载体的正确性，并将其转化至合适的感受态农杆菌中。对拟南芥（Arabidopsis）植株进行花序浸染法转化，3-4周后收获并筛选T1代种子51。
- 利用显微镜观察以鉴定表达良好的株系，并在多个独立株系中根据已报道的启动子活性验证其表达模式。选择具有代表性表达模式且仅含单个T-DNA插入的株系。这有助于减少基因沉默现象，并有利于后续的遗传杂交实验。
- 筛选标记基因纯合的T3代后代植株。
2. 扩增与灭菌
- 细胞类型特异性的TRAP技术可从每条根中有限数量的靶细胞分离RNA。为获得所需的起始材料，需扩增纯合品系。....
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结果
为进行质量评估，应对上述流程的多个中间步骤进行检测：包括在植株中验证表达模式、对分离的多聚核糖体RNA以及最终文库进行质量控制。此外，还可通过已知标记基因进行qRT-PCR，以确认对处理条件的响应或优化实验条件。
共聚焦分析 GFP 信号分布
为了检测内胚层和 XPP 的表达模式，我们通过共聚焦显微镜分析了 pELTP::GFP-RPL18 和 pXPP::GFP-RPL18 的纯合品系。图 2A 和 图 2B 显示了具有 GFP 信号（绿色）的代表性植株，其细胞壁经碘化丙啶复染（品红色）以清晰界定。在 图 2A1<.......
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讨论
验证 RPL18 的定位模式
避免对任何 TRAP 实验数据产生误读的关键在于标记核糖体亚基的正确表达模式。因此，将 GFP 作为表位标签融合到 RPL18 上，可优雅地实现对目标表达模式的验证，并随后从同种组织中沉淀多聚核糖体组分。为确保启动子驱动模式正确，Jiao 和 Mayerowitz 于 2010 年采用过更为侵入性的方法，该方法需要进行 GUS 染色；Tian 等人于 2019 年的方法则依赖于使用抗 FLAG 抗体的免疫染色58,59。
我们强烈建议在每一代中都检测定位模式，因为T-DNA转基因株系容易发生沉默，从而导致信号强度减弱或表达种子的比例下降。由于构建体中包含了GFP标签，这些常规检测可通过显微镜轻松完成。
然而，即使进行详尽的共聚焦分析，在某些情况下也可能得出错误的结论。我们希望通过在构建对照TRAP品系时的失败尝试来强调这一问题。迄今为止.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢苏黎世遗传多样性中心的 Jean-Claude Walser 在本项目初期阶段提供的关键性专业建议。Vermeer 实验室的工作得到了瑞士国家科学基金会（SNSF）授予 JEMV 的 SNF 教授职位资助（PP00P3_157524）和 R'EQUIP 设备资助（316030_164086）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 灭菌 | |||
| 次氯酸钠溶液，13% | Sigma | 71696 | |
| 烧杯 | VWR | 214-1172/74/75 | |
| 带瓷板的干燥器（DURAN） | Sigma/Merck | Z317454-1EA/Z317594-1EA | |
| 乙醇，分析纯 | Honeywell | 02860-1L | |
| 盐酸，37% | Roth | 4625.1 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| 平板培养与收获 | |||
| MS盐，基础盐混合物，含MES缓冲液 | Duchefa | M0254 | |
| 植物细胞培养用琼脂 | Applichem/Panreac | A2111.1000 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D4540 | |
| 镊子 | Rubis Switzerland | 5-SA 型号 | |
| 氢氧化钾（KOH） | Fluka | 60370 | |
| 微孔胶带/外科手术胶带 | 3M | 1530-0 | |
| 萘乙酸（NAA） | Duchefa | N0903 | |
| 培养皿 120×120 mm | Greiner bio-one | 688102 | |
| 手术刀 | VWR/Swann-Morton | 233-5454 | |
| 中性双层擦拭纸 | 任选供应商 | ||
| 免疫沉淀 | |||
| GFP磁珠：gtma-100 GFP-Trap_MA | Chromotek | 例如 gtma-100 | |
| Brij-35 | Sigma | P1254-500G | |
| 离心管（与离心机匹配） | Beckman Coulter | 357001 | |
| 氯霉素 | Applichem | C0378-25G | |
| 棉质手套 | VWR | 113-7355 | |
| 放线菌酮，HPLC级 | Sigma | 01810-1G | |
| DEPC | VWR | E174 | 可能交货周期较长 |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Fluka | 43815 | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA） | Sigma | 3054.3 | |
| DUALL 23型匀浆器 | KONTES GLASS CO (通过VWR购买) | SCERSP885450-0023（整套） | 仅研杵 SCERSP885451-0023；仅研钵 SCERSP885452-0023；交货周期较长 |
| Igepal CA-360 | Sigma | I3021-100ml | |
| 氯化钾（KCl） | Sigma | 60130 | |
| 六水合氯化镁（MgCl2 hexahydrat） | Roth | 2189.2 | |
| 研钵和研杵 | VWR | 470148-960 & 470019-978 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Roche | 10 837 091 001 | |
| 聚氧乙烯-(10)-十三醇醚（PTE） | Sigma | P2393-500G | |
| 无RNase水 | Roth | T143.3 | |
| RNAZap | Thermo Fisher | AM9780/AM9782 | 用于表面清洁 |
| Tris，>99.3% | Roth | AE15.3 | |
| 吐温X-100（Triton X-100） | Fluka | T8787-250ml | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ml | |
| RNA提取 | |||
| 异丙醇，分析纯 | Sigma | 33539-1L-GL-R | |
| 氯仿，HPLC级 | Scharlau | CL02181000 | |
| 乙醇，分析纯 | Honeywell | 02860-1L | |
| 低吸附微量离心管，1.5 ml | Eppendorf/Sigma | Z666548-250EA | LoBind |
| 无RNase的DNase试剂盒 | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy MiniElute 纯化试剂盒 | Qiagen | 74204 | |
| TRIzol试剂 | ThermoFisher/Ambion | 15596018 | |
| 文库构建 | |||
| 15/50 mL 管磁力分离器 | Abraxis | PN 472250 | |
| AMPure磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| Index Kit A | Illumina | FC-131-2001 | |
| Index Kit D | Illumina | FC-131-2004 | |
| 钕磁铁 | Amazon/其他 | 6 × 1.5 mm，N42级（NdFeB） | |
| Nextera XT试剂盒 | Illumina | FC-131-1024/1096 | https://emea.support.illumina.com/ |
| PCR排管 | ThermoScientific | AB-0266 | |
| SMARTer v4试剂盒 | Takara Bioscience | 634892 | https://www.takarabio.com/ |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | 用于RNA/DNA质量控制的专用设备 |
| Tapestation | Agilent | 4200 Tapestation Instrument | 用于RNA/DNA质量控制的专用设备 |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5400 Fragment Analyzer System | 用于RNA/DNA质量控制的专用设备（高通量） |
| LabChip | PerkinElmer | LabChip GX Touch 核酸分析仪 | 用于RNA/DNA质量控制的专用设备（高通量） |
| Qubit 4 荧光计 | ThermoFisher | Q33239 | 用于RNA/DNA浓度测定的专用设备 |
| qRT-PCR | |||
| GATA23 | Microsynth | 正向引物：AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG； 反向引物：GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC | |
| GH3.3 | Microsynth | 正向引物：CAAACCAATCCT CCAAATGAC； 反向引物：ACTTATCCGCAA CCCGACT | |
| LBD29 | Microsynth | 正向引物：TCTCCAACAACA GGTTGTGAAT； 反向引物：AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA | |
| UBC21 | Microsynth | 正向引物：TGCGACTCAGGG AATCTTCT； 反向引物：TCATCCTTTCTT AGGCATAGCG | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green | Bio-Rad | #172-5270 | |
| iScript Adv cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | #172-5038 | |
| 其他 | |||
| 15 ml Falcon管，Cellstar | Greiner bio-one | 188261 | |
| 50 ml Falcon管，Cellstar | Greiner bio-one | 210261 | |
| 1 ml 滤芯吸头 | Axygen | TF-1000-R-S | |
| 10 µl 滤芯吸头 | Axygen | TF-10-R-S | |
| 100 µl 滤芯吸头 | Axygen | TF-100-R-S | |
| 20 µl 滤芯吸头 | Axygen | TF-20-R-S | |
| 200 µl 滤芯吸头 | Axygen | TF-200-R-S | |
| 1.5 ml 微量离心管 | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4170-100MG | |
| 测序公司 | Novogene | en.novogene.com |
参考文献
- Van Verk, M. C., Hickman, R., Corné, M. J., Pieterse, M., Van Wees, S. C. RNA-Seq: Revelation Of The Messengers. Trends In Plant Science. 18 (4), 175-179 (2013).
- Libault, M., Pingault, L., Zogli, P., Schiefelbein, J. Plant Systems Biology At The Single-Cell Level. Trends In Plant Science.
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重印与许可
