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方法文章

人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的制备

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DOI：

10.3791/60925

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2020年3月2日

 ,  ,  ,  , 
1The Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Regenerative Medicine and Stem Cell (RMSC) Research Center, Ben-Gurion University of the Negev, 3The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, 4The Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Division of Micro and Nanosystems, KTH Royal Institute of Technology, 6AIMES, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

本文内容

摘要

血脑屏障（BBB）是一种多细胞构成的神经血管功能单元，可严格调控大脑内环境的稳态。通过结合人诱导多能干细胞（iPSCs）与器官芯片技术，我们构建了一种可用于疾病建模及中枢神经系统药物穿透能力预测的个体化血脑屏障芯片。本文详细描述了该血脑屏障芯片的制备与操作流程。

摘要

血脑屏障（BBB）由神经血管单元（NVUs）构成，可保护中枢神经系统（CNS）免受血液中多种可能干扰大脑精细功能的因素影响。因此，血脑屏障是向中枢神经系统递送治疗药物的主要障碍。越来越多的证据表明，血脑屏障在神经系统疾病的发生和发展中起着关键作用。因此，迫切需要一种能够预测靶向中枢神经系统药物穿透能力，并阐明血脑屏障在健康与疾病状态下作用的模型。

我们近期将器官芯片与诱导性多能干细胞（iPSC）技术相结合，开发出一种完全个性化的人源血脑屏障（BBB）芯片。这一新型平台展现出适用于预测药物和分子在人血脑屏障中转运能力的细胞、分子和生理特性。此外，通过使用患者特异性的血脑屏障芯片，我们建立了神经系统疾病模型，并展示了其在个性化预测医学应用中的潜力。本文提供了一套详细的实验方案，介绍如何从诱导性多能干细胞衍生出的脑微血管内皮细胞（iBMECs）分化开始，构建iPSC来源的血脑屏障芯片，最终形成包含神经前体细胞、分化神经元和星形胶质细胞的混合神经培养体系。同时描述了将细胞接种至器官芯片并在受控层流条件下培养血脑屏障芯片的操作流程。最后，提供了对血脑屏障芯片进行分析的详细方法，包括用于评估药物和分子通透性的旁细胞渗透性检测，以及通过免疫细胞化学方法鉴定芯片内细胞类型的组成。

引言

血脑屏障（BBB）是一种高度选择性的屏障，将中枢神经系统（CNS）与循环血液分隔开来。它可保护大脑的关键功能免受潜在干扰性物质、因子和外源性化合物的影响，同时允许营养物质及其他维持大脑稳态所必需的代谢物进入1。BBB 是一种多细胞构成的神经血管单元（NVU），其中周细胞、星形胶质细胞终足以及神经元突起直接与脑微血管内皮细胞（BMECs）接触。这些相互作用使 BMECs 形成特殊的屏障特性，并由紧密连接和黏附连接提供支持2,3。该屏障的形成限制了分子的细胞旁通路转运，但其含有极性分布的转运蛋白，可主动将分子转运进入中枢神经系统或返回血液中1。由于这些独特的屏障特性，BBB 构成了向脑内递送生物制药的主要障碍，据估计，仅有不到 5% 的经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的小分子药物能够到达中枢神经系统4。

动物模型已被广泛用于研究血脑屏障（BBB）的通透性以及参与BBB发育的分子机制5。尽管动物模型能够真实地再现复杂的多细胞体内环境，但不同物种间BBB转运蛋白的表达与活性差异以及底物特异性差异，常常导致无法将动物实验数据准确外推至人类6。因此，基于人类的模型对于研究人类血脑屏障以及用于靶向中枢神经系统（CNS）药物的开发至关重要。随着生物类、人类特异性药物在药物研发领域中所占比例不断增加，这一需求变得更加突出。越来越多的证据表明，受损的血脑屏障与多种严重的中枢神经系统疾病相关，包括脑肿瘤和神经性疾病7,8,9。能够真实反映这些疾病的基于人类的模型具有双重潜力：1）识别可用于药物开发的新靶向通路；2）预测药物在中枢神经系统的通透性，从而缩短临床前研究的时间和资源投入，并可能降低临床试验的失败率。

体外模型已被广泛用于研究脑微血管内皮细胞（BMECs）与神经血管单元（NVU）中其他细胞之间的相互作用，并用于筛选潜在的血脑屏障（BBB）通透性药物10。为了重建人血脑屏障的关键特征，体外模型必须表现出符合生理的相关特性（即低细胞旁路通透性和在内皮单层上具有生理相关性的跨内皮电阻[TEER]）。此外，体外系统的分子谱必须包含代表性功能转运系统的表达。通常，体外模型由内皮细胞组成，这些细胞在半透膜上与其他NVU细胞共培养，以增强血脑屏障特性11。该方法可对屏障功能和分子通透性进行简单且相对快速的评估。此类基于细胞的血脑屏障模型可使用动物或人类细胞来源建立，包括从手术切除组织中分离的细胞或永生化BMEC细胞系。

最近，已有研究建立了将人类多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞（BMECs）的实验方案，这为体外构建人源血脑屏障（BBB）模型提供了极具吸引力的细胞来源12,13。由诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的BMECs（iBMECs）具有高度可扩展性，能够展现人源血脑屏障关键的形态学和功能特征，并携带供体患者的遗传背景。在培养条件下，iBMECs可形成单层细胞，表达紧密连接标志物，并形成类似体内结构的紧密连接复合物。这些细胞还表达血脑屏障标志物，包括血脑屏障葡萄糖转运体——葡萄糖转运体1（GLUT1）。尤为重要的是，与其他可选的人源BMEC细胞来源不同，iBMECs所形成的屏障特性其数值可达到与体内测量值相当的高水平14，能够沿基底-外侧轴发生极化，并表达具有功能的外排转运蛋白。此外，使用来自不同个体的iPSCs不仅（1）为以个体化医学方式研究血脑屏障特性提供了可能，而且（2）为生成神经血管单元（NVU）中的其他细胞类型提供了灵活的细胞来源。若利用同基因型细胞来源制备个体化血脑屏障芯片，将有助于理解个体间药物反应的差异，而这种差异正是临床研究中观察到的治疗耐药性或疗效降低的主要原因。

将iBMECs以培养皿中的单层细胞或跨孔插入式半透膜上的单层细胞形式使用，是构建血脑屏障（BBB）模型的一种有力方法。这些系统通常具有较强的稳健性、可重复性且成本较低。此外，诸如经内皮电阻（TEER）和通透性等功能分析也相对容易实施。然而，二维（2D）系统无法重现体内组织的三维（3D）特性，并且缺乏循环血液及血细胞所提供的生理性剪切应力。这限制了这些模型中血管内皮细胞发育和维持其固有的血脑屏障特性和功能的能力。

已采用由活细胞构建的微加工系统，以模拟各种器官功能，这一概念被称为“器官芯片”。通过重建类似体内多细胞结构、组织-组织界面、理化微环境以及血管灌注，这些微加工平台实现了传统二维培养系统无法达到的组织和器官功能水平。它们还能够实现高分辨率、实时成像，并对生化、遗传和代谢谱进行分析，其结果与体内组织和器官环境中活细胞的特性相似。然而，器官芯片面临的一个特殊挑战是，这些微加工芯片的设计、制造和应用需要专业的工程专业知识，而这类知识通常在以生物学为导向的学术实验室中较为缺乏。

我们近期将诱导多能干细胞（iPSC）与器官芯片技术相结合，开发出一种个性化的血脑屏障（BBB）芯片模型15,16。为克服上述技术挑战，本研究采用 commercially available Chip-S1 芯片，并结合培养模块（culture module）使用，该仪器由 Emulate 公司设计，可简单且稳定地自动化维护芯片。该 BBB 芯片可重建神经细胞与内皮细胞之间的相互作用，并达到生理相关的跨内皮电阻（TEER）值，该值通过集成金电极的定制器官芯片进行测量17。此外，该 BBB 芯片表现出较低的旁细胞通透性，可在器官水平响应炎症信号，表达具有活性的外排泵，并展现出对可溶性生物标志物和生物药物的可预测性转运能力。值得注意的是，来自多个个体的 BBB 芯片能够捕捉健康个体与神经系统疾病患者之间预期的功能差异15。

以下方案详细描述了一种在动态流动条件下生成人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的可靠、高效且可重复的方法。本文提供了可在血脑屏障芯片内直接进行或通过收集流出液开展的各类检测与终点分析的指导。因此，该方案展示了可用于评估人源相关模型中生物学特性及功能特性与响应的一系列技术。

本文简要描述了基于诱导多能干细胞（iPSC）的血脑屏障（BBB）芯片。人iPSC最初在组织培养瓶中作为游离的神经前体细胞团（称为EZ球）进行分化和扩增。将解离后的EZ球接种至Chip-S116,18,19的上层通道，这些细胞在7天内进一步分化为包含诱导型神经前体细胞（iNPCs）、诱导型星形胶质细胞（iAstrocytes）和诱导型神经元（iNeurons）的混合培养物，构成芯片的"脑侧"。同时，人iPSC也在组织培养板中分化为诱导型脑微血管内皮细胞（iBMECs）。将iBMECs接种至芯片的下层通道，随着其发育形成内皮管状结构，构成芯片的"血侧"（图1）。分隔上下通道的多孔细胞外基质（ECM）包被膜具有两个功能：1）允许通道间细胞形成细胞-细胞相互作用；2）使研究者能够使用常规光学显微镜对任一通道中的细胞进行通透性检测和成像分析。

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方案

1. 诱导多能干细胞来源的神经前体细胞（iNPCs）的生成

  1. 按照下述方法并参考既往发表的文献20,21,22，由iPSC集落生成EZ球体。
    1. 在包被有基底膜基质的6孔板（0.5 mg/孔）中，使用mTESR1或其他商业培养基将iPSC集落培养至完全汇合（见材料表）。
    2. 移除iPSC培养基，加入2 mL EZ球体培养基 [ESM；DMEM:F12（7:3）添加100 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、100 ng/mL表皮生长因子、5 µg/mL肝素和2% B27添加剂]。
    3. 用无菌1000 µL移液枪头背面或细胞刮刀轻轻刮取每个汇合孔的底部。
    4. 收集所有细胞，并转移至超低吸附T25培养瓶中，以促进自由漂浮球体的自发形成。于37 °C孵育过夜。
    5. 当培养基变黄时，每2–3天更换一次球体培养基，方法是更换一半体积的新鲜ESM。此操作可使球体保留在条件培养基中，这对球体的生长和维持至关重要。
      1. 将培养瓶倾斜放置于试管架上，静置1–2分钟，使球体依靠重力自然沉降到培养瓶角落。
      2. 待球体沉降后，用5 mL或10 mL血清移液管吸除一半上清液，并补充等体积预温的新鲜ESM。
    6. 每周传代EZ球体，通过机械切割将球体切成直径约200 μm的片段，方法如先前所述23,20,21。EZ球体可维持传代至多25代，建议在第8–25代之间使用，效果最佳。
  2. 制备iNPC的单细胞悬液：
    1. 为诱导神经分化，将EZ球体解离为单细胞。
    2. 从T75培养瓶中收集切割后3–4天的球体，转移至15 mL锥形管中，静置2分钟或直至所有球体完全沉降至管底。
    3. 用5 mL移液管缓慢吸除ESM，避免扰动已沉降的球体。加入1 mL解离液（见材料表），于37 °C孵育10分钟。
    4. 孵育5分钟后轻轻摇动解离液与球体混合，确保所有沉降的球体均被充分处理。
    5. 缓慢吸除解离液，加入1 mL神经分化培养基 [NDM；DMEM:F12添加2%不含维生素A的B27添加剂、1% N2添加剂以及人源脑源性神经营养因子（hBDNF，20 ng/mL）]。
    6. 使用1 mL移液枪先吹打，再换用200 µL移液枪继续吹打，将球体彻底解离为单细胞，直至无可见团块。吹打过程中应避免产生气泡。
    7. 使用血细胞计数板对解离后的细胞进行计数，并调整细胞密度至最终浓度为1 × 106 cells/mL。可根据具体实验需求调整细胞密度。
      注：短期培养（不超过3天）建议采用较高细胞密度（最高可达6 × 106 cells/mL），而长期应用（最长可达3周）则推荐使用较低细胞密度。
      注：此时细胞已准备好接种至芯片的上层通道，以构建“脑侧”结构。

2. 将iPSC诱导分化为iBMEC

  1. 以1:6的比例将一个6孔板中单个汇合孔的iPSC传代至经基底膜基质包被的6孔板中。让细胞贴壁24小时。每天更换iPSC培养基。
  2. 使用血细胞计数板每天计数细胞。
  3. 当细胞密度达到每孔1.5–3.0 × 105个细胞时，弃去iPSC培养基，加入3 mL未条件化培养基（不含bFGF），即DMEM:F12（1:1），含10% knockout血清替代物（KOSR）、1%非必需氨基酸（NEAA）、0.5%谷氨酰胺补充剂（材料表）和100 µM β-巯基乙醇。连续6天每日更换培养基24。
  4. 第6天，弃去原有培养基，更换为内皮细胞（EC）培养基[人内皮细胞无血清培养基（hESFM），添加1%贫血小板血浆来源的牛血清、20 ng/mL bFGF和10 µM全反式维甲酸（RA）]。继续培养2天。
  5. 弃去EC培养基，每孔加入1 mL解离溶液。在37 °C孵育35分钟。
    注意：尽管在此所用的解离溶液中该孵育时间较长，但iBMEC能够耐受此处理，细胞活力仍可保持在90%以上。
  6. 通过轻柔吹打使细胞脱离孔壁，收集全部细胞至15 mL锥形管中。
    注意：避免剧烈吹打。若细胞不易脱落，可额外孵育5分钟。
  7. 向15 mL锥形管中加入等体积的EC培养基以终止Accutase作用，于200 × g离心5分钟，弃上清，再加入1 mL EC培养基（不含bFGF和RA）重悬细胞。
  8. 使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞密度调整至14–20 × 106个细胞/mL。
    注意：此时细胞已准备好接种至芯片的下通道，以形成“血液侧”。

3. 器官芯片的微加工

  1. 采用先前所述的方法使用器官芯片构建血脑屏障（BBB）芯片模型并进行制备16,18,19。高通道器官芯片（见材料表）由高度柔韧的聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体加工而成，包含两个上下重叠且相互平行的微通道，二者由一片柔性的多孔膜隔开。上、下微通道的尺寸分别为 1 mm × 1 mm 和 1.0 mm × 0.2 mm。两个通道之间由一层厚度为 50 μm、由 PDMS 制成的柔性多孔膜分隔，该膜具有直径为 7 μm、间距为 40 μm 的孔。分隔两个通道的多孔膜表面积为 0.171 cm2。

4. 芯片制备

  1. 器官芯片以预包装形式提供，置于芯片载体中，避免了操作过程中对芯片位置的干扰或错位。此外，芯片载体可牢固连接至便携式模块（“Pod”），作为培养模块与芯片之间的接口。
    1. 用70%乙醇喷洒芯片包装，并将其移入生物安全柜（BSC）中。
    2. 打开包装，将器官芯片放置于无菌培养皿中。仅通过载体两侧进行操作，避免直接接触芯片。
    3. 确保载体上的标签朝向右侧（图2）；若使用多个芯片，应使它们均保持相同方向排列。
    4. 在每个芯片载体的标签处进行标记（完整的芯片制备与操作流程见图3）。

5. 表面活化与细胞外基质包被

  1. 表面活化溶液的制备
    1. 试剂1（ER-1）为小瓶装，每瓶含5 mg，对光敏感。请在使用前立即新鲜配制ER-1溶液。ER-1的完整性对于芯片的成功制备至关重要。
    2. 操作ER-1时，请关闭生物安全柜（BSC）内的照明。
      注意：ER-1对眼睛具有刺激性，必须在生物安全柜内佩戴适当的手套和眼部防护装备进行操作。
    3. 使用前，将ER-1和ER-2试剂平衡至室温（RT）。
    4. 用铝箔包裹一个空的无菌15 mL锥形管，以保护溶液避光。
    5. 在生物安全柜内，轻轻敲击ER-1小瓶，使粉末沉降至瓶底。
    6. 向小瓶中加入1 mL ER-2缓冲液，并立即将其内容物转移至已包裹铝箔的15 mL锥形管底部。不要用移液器吹打混匀。转移至锥形管中的溶液颜色应为红色。
    7. 重复步骤5.1.6共3次。最后一次操作时，盖紧ER-1小瓶并倒置，以收集瓶盖内残留的粉末，然后将溶液转移至锥形管中；最终总体积为4 mL ER-1溶液。
    8. 向15 mL锥形管中的4 mL ER-1溶液中加入6 mL ER-2溶液，使终浓度为0.5 mg/mL。ER-1应在ER-2溶液中完全溶解。
  2. 表面活化
    1. 使用P200移液器和无菌200 μL滤芯吸头，吸取200 μL ER-1混合液。
    2. 将移液器插入底部入口，推动20 μL ER-1混合液通过底部通道，直至混合液开始从底部通道出口流出。
    3. 加入约50 μL ER-1混合液，并将其加入顶部通道入口。推动混合液通过顶部通道，直至其开始从顶部通道出口流出。
    4. 通过轻柔抽吸去除芯片表面多余的ER-1混合液。确保仅从芯片表面去除混合液，而通道内仍保留液体。
    5. 在紫外（UV）活化前，确认通道内无气泡。若发现气泡，使用ER-1混合液冲洗通道以去除气泡。
    6. 将装有芯片的敞口培养皿放入UV光箱中（由Emulate公司提供）。
    7. 将UV光箱背面的开关设置为“Consistent”模式，打开电源并启动UV活化。将芯片置于UV光下照射20分钟。
      注意：避免人员暴露于UV光下。
    8. 从两个通道中移除ER-1混合液。
    9. 用200 μL ER-2溶液冲洗每个通道。
    10. 从两个通道中移除ER-2溶液。
    11. 用200 μL无菌冷的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗每个通道。
    12. 将冷的DPBS保留在通道内，直至进行下一步操作。
  3. 细胞外基质（ECM）的制备与包被
    1. 通过将各ECM组分与冷DPBS、水或其他溶剂混合，配制成终工作浓度的ECM溶液。每次使用时均应新鲜配制。
    2. 根据拟接种的细胞类型确定ECM组成，对芯片的顶部和底部通道均进行ECM包被。ECM混合液在使用前必须保持在冰上。
    3. 使用层粘连蛋白（50 µg/mL）包被“脑侧”，使用胶原蛋白IV与纤连蛋白按4:1比例混合（320:80 µg/mL）包被“血侧”，具体如第5.6节所述。
  4. ECM分装液的制备
    1. 将1 mg/mL的层粘连蛋白用冷DPBS稀释至终浓度50 µg/mL。分装后于-20 °C保存备用。
    2. 用0.1%乙酸溶解胶原蛋白IV至浓度为1 mg/mL。将溶液在2–8 °C下孵育过夜，或在室温下孵育1–3小时，直至完全溶解。
    3. 配制1 mL胶原蛋白IV:纤连蛋白混合液（320 µL胶原蛋白IV，80 µL纤连蛋白，600 µL无菌双蒸H2O）。该混合液可于-20 °C保存。
  5. 芯片的ECM包被
    1. 彻底抽吸两个通道中的冷DPBS。将P200移液器调至吸取100 μL胶原蛋白IV:纤连蛋白溶液。
    2. 通过底部通道入口加入溶液，直至出口处形成小液滴。移除吸头后，入口处保留一小滴液体。
    3. 通过顶部通道入口加入层粘连蛋白溶液，直至出口处形成小液滴。移除吸头后，入口处保留一小滴液体。
    4. 仔细观察通道，确保无气泡存在。若有气泡，使用相应的ECM溶液冲洗通道，直至气泡完全去除。
    5. 对每一片芯片重复步骤5.5.1–5.5.4。
    6. 向一个15 mL锥形管盖中加入1.5 mL DPBS。将装有DPBS的管盖放入盛有芯片的150 mm培养皿中，以提供额外湿度，并用封口膜密封培养皿。为获得最佳效果，建议在4 °C孵育过夜。
      注意：如需要，可在芯片活化和ECM包被当天接种细胞，但推荐过夜孵育。若在加入ECM后于37 °C孵育4小时，芯片也可准备接种。

6. 在“脑侧”通道中接种EZ类脑球体并分化为混合神经元培养物

  1. 将含有已制备芯片的培养皿移至生物安全柜中。用 200 µL NDM 轻柔地清洗两个通道。
  2. 避免接触进样口，小心吸除芯片表面多余的培养基液滴。接种每个芯片前，轻柔振荡细胞悬液，以确保细胞悬液均匀。
  3. 将iNPCs接种至顶部通道以构建“脑侧”
    1. 将细胞（1 × 106 个细胞/mL）接种到芯片的顶部通道中。将含有30–100 μL细胞悬液的P200吸头插入顶部通道入口，轻柔释放吸头使其脱离移液器。取一个空的P200吸头，按下活塞后插入顶部通道出口，小心地将单细胞悬液抽吸通过芯片。
    2. 盖上培养皿，转移至显微镜下检查顶部通道内细胞的接种密度及分布均匀性。轻柔地将吸头从芯片的入口和出口移除。
    3. 接种密度应达到约20%的覆盖率。若接种密度高于或低于预期，或分布不均，需将芯片移回生物安全柜，用200 μL新鲜培养基清洗通道两次，并重复步骤6.3.1。
    4. 确认细胞密度正确后，立即将芯片放入37 °C培养箱中孵育2小时。接种每批芯片后，用新鲜NDM洗去未贴壁的细胞。
    5. 在启动灌流前，将细胞在37 °C下保持静态培养，并每天更换NDM，至少持续48小时。iBMECs可在iNPCs贴壁后或iNPCs接种后的次日进行接种。

7. 将iBMECs接种至底部通道以构建“血液侧”

  1. 将含有已制备芯片的培养皿移至生物安全柜中。用 200 µL EC 培养基轻轻冲洗底部通道。
  2. 避免接触进样口和出样口，小心吸除芯片表面多余的 EC 培养基液滴，确保两个通道内均保留培养基。接种每块芯片前，轻轻振荡细胞悬液，以保证细胞悬液均匀。
  3. 使用 P200 移液器吸取 30–100 µL iBMEC 细胞悬液（14–20 × 106 个细胞/mL），将枪头插入底部通道的入口。轻轻将带有细胞悬液的枪头从移液器上取下，使其保留在进样口内。
  4. 取一支空枪头装在 P200 移液器上，压下活塞，将枪头插入底部通道出口，然后缓慢松开活塞，将单细胞悬液轻柔地抽吸通过底部通道。
  5. 吸除芯片表面多余的细胞悬液。避免直接接触进样口和出样口，以防止将通道内的细胞悬液吸出。
  6. 盖上芯片并转移至显微镜下观察接种密度。在显微镜 4x 或 10x 放大倍数下观察时，底部通道应被细胞完全填充，细胞之间无可见间隙（图 4）。
  7. 若接种密度低于 90% 覆盖率或分布不均，应相应调整细胞密度，并重复步骤 7.2–7.6，直至通道内达到理想密度。确认细胞密度合适后（图 4），对剩余芯片进行细胞接种。为使细胞附着于位于底部通道上方的多孔膜上，将每块芯片倒置并置于芯片支架中。
  8. 在 150 mm 培养皿内放置一个小储液槽（含无菌 DPBS 的 15 mL 离心管盖），以维持细胞所需的湿度环境。将芯片置于 37 °C 培养箱中孵育约 3 小时，或直至底部通道内的细胞完成贴壁。iBMEC 贴壁后（接种后约 3 小时），将芯片翻转回正立位置，使细胞能够附着于底部通道的下部区域。

8. 启动流体流动

  1. 通常在iBMECs接种后48小时启动灌注。此时间段对于iBMECs牢固附着于芯片是必需的。
  2. 为维持芯片内的层流，重要的是对培养基进行脱气并平衡其温度。培养基必须在37 °C水浴中预热1小时。
  3. 最多50 mL的预热培养基可通过在真空驱动的过滤系统下孵育15分钟进行脱气。
  4. 便携式模块的预灌注
    1. 用70%乙醇对便携式模块包装和托盘的外表面进行消毒，擦拭后转移至生物安全柜（BSC）中。打开包装，将模块放入托盘内，方向为储液池朝向托盘后方。
    2. 向每个入口储液池中加入3 mL已预平衡的温热培养基。将内皮细胞（EC）培养基加入底部通道的入口储液池，将NDM加入顶部通道的入口储液池（图5）。
    3. 向每个出口储液池（直接位于各出口端口上方）加入300 μL已预平衡的温热培养基（图5）。
    4. 每个托盘最多可放置六个便携式模块。将托盘送入培养模块的孵育箱中，并完全滑入，使托盘手柄朝外。
    5. 在培养模块上选择并运行“预灌注”（Prime）循环。关闭孵育箱门，使培养模块对便携式模块进行预灌注（约需1分钟）。当状态栏显示“就绪”（Ready）时，表示预灌注循环完成。将托盘从培养模块中取出，并移至生物安全柜（BSC）中。
    6. 在生物安全柜（BSC）中检查每个便携式模块的底面，确认其是否成功完成预灌注。观察四个端口处是否存在微小液滴。
      1. 若任一便携式模块未出现液滴，则对该模块重新运行预灌注循环。若培养基滴落至托盘表面（此情况在出口端口处更常见），则用70%乙醇清洁托盘。
  5. 芯片与便携式模块的连接、调节及灌注启动
    1. 用温热且已平衡的细胞特异性培养基轻轻冲洗每个芯片的两个通道，以去除通道中可能存在的气泡，并在每个入口和出口端口顶部滴加少量培养基（根据通道内培养基类型选择相应培养基）。
    2. 将带载体的芯片插入便携式模块中，每个托盘最多放置六个。将托盘插入培养模块中。在培养模块上设定适当的器官芯片培养条件（流速和拉伸）。
    3. 当“调节”（Regulate）循环完成后，设定的培养条件将立即开始。
      注意：每个通道的流速可独立控制，设定范围为0–1,000 µL/h。血脑屏障（BBB）芯片通常在30 µL/h条件下培养。当以30 µL/h和1000 µL/h流速分别灌注EC培养基或ESM时，所产生的剪切力分别为0.01 dyn/cm2和0.33 dyn/cm2。
    4. 运行“调节”（Regulate）循环，该过程约需2小时，之后培养模块将在预设的器官芯片培养条件下开始灌注。

9. 血脑屏障旁细胞通透性评估

  1. 准备添加10 µg/mL葡聚糖-FITC（4 kDa）的NDM。该溶液将用作“血液侧”通道的输入液。
  2. 用添加了葡聚糖-FITC的NDM填充便携式模块的底部通道储液池，用不含示踪剂的NDM填充顶部通道储液池。
  3. 以30 µL/h的流速灌注顶部和底部通道，持续至少4小时，直至收集到足够用于在酶标仪上检测荧光的培养基（通常为100 µL）。
  4. 从顶部和底部通道的输入与输出储液池中收集培养基样品。避免样品暴露于光线下。
  5. 使用不含示踪剂的NDM对添加了10 µg/mL葡聚糖-FITC的NDM进行1:1连续稀释，制备包含10–12个点的标准曲线。
  6. 取100 µL每份样品（包括标准曲线样品）加入黑色96孔板中，使用酶标仪检测荧光（激发波长485 nm，发射波长530 nm）。
  7. 使用测得的数据按以下方式计算Papp值：

通透性方程示意图，利用浓度输入计算膜转运分析中的Papp值。

  1. 每日进行测量以评估屏障特性，并确认血脑屏障芯片仍处于正常功能状态。

10. 免疫细胞化学

  1. 将芯片移至化学通风橱中。使用P200移液器，通过向两个通道灌注200 µL含4%多聚甲醛（PFA）的DPBS溶液固定细胞，并在室温下孵育10分钟。
  2. 固定完成后，向每个通道灌注200 μL DPBS溶液，孵育5分钟。重复DPBS洗涤2次。
  3. 通过向芯片上的细胞灌注一抗封闭液（PBS中添加5%正常驴血清和0.1% Triton X-100）进行封闭和通透处理，在室温下孵育1小时。
  4. 将一抗用一抗封闭液稀释后，于4 °C孵育过夜。脑微血管内皮细胞（BMECs）标志物包括GLUT-1（1:100稀释）、ZO-1（1:300）、PECAM-1（1:250；CD31）和VE-cadherin（1:200）。神经细胞标志物包括βIII-tubulin（1:1000；Tuj1α）、S100β（1:500）、nestin（1:1000）和GFAP（1:1000）。
  5. 用冷DPBS洗涤芯片3次。
  6. 将二抗用二抗封闭液（含5%正常驴血清但不含Triton-X的DPBS）稀释。
  7. 将稀释后的二抗溶液灌注至两个通道中。通常荧光标记的二抗按1:1000稀释，在室温下避光孵育1小时。
  8. 用DPBS洗涤芯片3次。
  9. 通过向芯片灌注100 μL DAPI溶液对细胞核进行染色，在室温下孵育5分钟。
  10. 用DPBS洗涤芯片3次。
  11. 芯片现已准备好进行成像，可使用正置或倒置荧光显微镜观察。由于器官芯片具有一定厚度，PDMS的透明性允许在完整芯片上直接成像，但放大倍数高于10x时可能需要使用长工作距离物镜。

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结果

图6A,B,C 显示了一种血脑屏障（BBB）芯片，其“脑侧”顶部通道接种了EZ-球体，“血侧”底部通道接种了诱导型脑微血管内皮细胞（iBMECs）。首先接种iBMECs并静置过夜使其贴壁，随后接种EZ-球体。芯片在静态条件下培养，每天更换培养基，持续七天。然后使用4%多聚甲醛在室温下固定BBB芯片10分钟，并用DPBS洗涤3次。对BBB芯片进行免疫细胞化学染色，使用1）巢蛋白（nestin）作为神经前体细胞的标志物，2）S100β或胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞的标志物，以及3）βIII-微管蛋白（βIII-tubulin）作为神经元的标志物。GLUT-1和Pecam-1用作脑微血管内皮细胞（BMECs）的标志物。使用共聚焦显微镜在20倍放大下进行成像，并使用Fiji for ImageJ软件处理图像。

图6D 展示了一项在含有iBMECs和EZ-球体、仅含iBMECs（不含EZ-球...

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讨论

器官芯片技术与源自iPSC的细胞在神经血管单元（NVU）中的结合，为精确建模人血脑屏障（BBB）提供了广阔前景。本文提供了一套详细的实验方案，用于简便且稳健地应用近期发表的基于iPSC的血脑屏障芯片16。接种方案的总体流程与时间安排见图3。为了获得并维持适用于血脑屏障建模的屏障功能，生成均一的iBMEC单层细胞并保持其完整性至关重要。构建功能性单层细胞的第一步是化学活化非极性的PDMS表面，以促进细胞外基质（ECM）蛋白的附着。表面活化试剂在重悬后会迅速降解，可能导致细胞附着效果不理想。因此，在整个操作过程中保持试剂新鲜并避光保存十分关键。

在紫外光活化过程中（第5.2节），必须确保各通道内的试剂均匀分布，以实现一致的细胞外基质（ECM）包被和均匀的细胞贴附。本方案中提供的ECM成分和浓度已针对特定类型的细胞进行优化（即., iBMECs 和 EZ-sphere 分化而来的神经前体细胞）。改变细胞组成是可行的，但可能需要不同的细胞外基质（ECM）条件，这需要...

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披露

Cedars-Sinai 持有 Emulate 公司的少数股份，该公司生产本研究中使用的微流控器官芯片。Cedars-Sinai 的一名高管同时在 Emulate 董事会任职。本研究未获得 Emulate 提供的任何资金支持。Cedars-Sinai 与 Emulate 均已就本研究相关技术提交了专利申请。

致谢

我们感谢 Soshana Svendsen 博士的审阅与修改。本工作由以色列科学基金会资助（项目编号 1621/18）、以色列科学与技术部（MOST）（项目编号 3-15647）、加州再生医学研究所资助（项目编号 DISC1-08800）、Sherman 家族基金会、美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH-NINDS）资助（项目编号 1UG3NS105703）以及美国肌萎缩侧索硬化症协会资助（项目编号 18-SI-389）。AH 由 Wallenberg 基金会资助（项目编号 2015.0178）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AccutaseEMD MilliporeSCR005解离溶液
B27Gibco12587010
bFGFPeprotech100-18B
Chip-S1Emulate IncChip-S1器官芯片
IV型胶原蛋白SigmaC5533
DAPIInvitrogenD3571
葡聚糖-FITCSigma46944
DMEM:F12Thermo Fisher Scientific31330038
驴血清SigmaD9663
Emulate 试剂1 (ER-1)Emulate IncER-1
Emulate 试剂2 (ER-2)Emulate IncER-2
纤连蛋白SigmaF1141
胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)DakoZ0334
GLUT-1InvitrogenMA5-11315
GlutaMAXLife Technologies35050038谷氨酰胺补充剂
人BDNFPeprotech450-02
KOSRThermo Fisher Scientific10828028
层粘连蛋白SigmaL2020
MatrigelCorning354234基底膜基质
mTeSR1StemCell Technologies, Inc.85851
非必需氨基酸 (NEAA)Biological industries01-340-1B
NestinMilliporeMAB353
NutriStemBiological industries05-100-1A替代培养基
PECAM-1Thermo Fisher Scientific10333
血小板贫浆来源牛血清 (PPP)Biomedical TechnologiesJ64483AB
视黄酸 (RA)SigmaR2625
S100βAbcamab6602
Steriflip-GP 无菌离心管顶滤器MilliporeSCGP00525
Triton X-100SigmaX100
ZO-1 单克隆抗体Invitrogen33-9100
βIII-微管蛋白 (Tuj1α)SigmaT8660
β-巯基乙醇Life Technologies31350010

参考文献

  1. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
  2. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  3. Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15(2019).
  4. El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
  5. Lim, R. G., et al. Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  6. Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
  7. Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
  8. Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965(2017).
  9. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507(2014).
  10. Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
  11. Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256(2016).
  12. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  13. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
  14. Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
  15. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621(2019).
  16. Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
  17. Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  18. Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
  19. Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
  20. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
  21. Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219(2014).
  22. Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
  23. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
  24. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2014).
  25. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
  26. Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
  27. Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
  28. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783(2012).
  29. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679(2017).
  30. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  31. Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23(2018).
  32. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135(2013).
  33. Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).

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