一种模拟使用静脉移植物进行血管重建手术的兔静脉移植模型，用于评估动脉血压下的内膜增生

摘要

本实验方案旨在通过使静脉承受动脉血压，实验性地建立静脉内膜增生模型，以开发在使用静脉移植进行血管重建手术后减轻静脉内膜增生的策略。

摘要

尽管自体静脉移植物常用于缺血性疾病血管重建手术，但由于暴露于动脉血压下会加速内膜增生，其长期通畅率仍然较差。本方案旨在通过将兔颈外静脉移植至同侧颈动脉，建立静脉内膜增生的实验模型。该方案无需在躯干深部进行手术操作，切口范围有限，对动物创伤较小，便于移植后长期观察。这一简便的操作方法使研究人员能够探索抑制移植静脉内膜增生进展的策略。利用本方案，我们曾报道了将已知可调控血管平滑肌细胞（VSMC）由增殖表型向收缩表型转化的microRNA-145（miR-145）转导至获取的静脉移植物中的作用。我们证实，在移植手术前通过转导miR-145诱导VSMC表型转变，可有效抑制静脉移植物的内膜增生。本文报道了一种创伤较小的实验平台，可用于研究在血管重建手术中抑制静脉移植物内膜增生的潜在策略。

引言

由于动脉粥样硬化导致缺血性疾病的患者数量在全球范围内不断增加¹。尽管目前心血管疾病的药物和外科治疗已取得进展，但心肌梗死等缺血性心脏病仍是发病率和死亡率的主要原因²。此外，以外周肢体血流减少为特征的外周动脉疾病可引发严重肢体缺血，其中约40%的患者在确诊后6个月内失去肢体，死亡率高达20%³。

血管重建手术，如冠状动脉旁路移植术（CABG）和外周动脉旁路手术，是缺血性疾病的主要治疗手段。这些手术的目的是建立新的血流通道，以向动脉粥样硬化动脉发生狭窄或闭塞病变的远端部位提供充足的血流。尽管原位动脉移植物（如用于CABG的胸内动脉）因预期具有更长的通畅率而被优先选作旁路移植物，但由于静脉移植物（如自体大隐静脉）更容易获取和获得，因此在临床上更为常用⁴。静脉移植物的薄弱之处在于其通畅率较动脉移植物差⁵，这是由于在承受动脉压力时发生加速的内膜增生，从而导致静脉移植物病变⁶。

静脉移植物病变的发展经历以下三个阶段：1）血栓形成；2）内膜增生；3）动脉粥样硬化⁷。为了应对静脉移植物病变，已开展了大量基础....

方案

注意：对动物实施的所有外科手术均应遵循《实验动物护理与使用指南》（www.nap.edu/catalog/5140.html）或其他适当的伦理准则。在开展实验前，相关方案须经相应机构的动物福利委员会批准。

1. 动物准备

1. 购买体重为 2.7–3.0 kg 的雄性日本白兔（或体型相当的兔子）。
2. 在进行实验前，将兔子在 12 小时光照-黑暗循环条件下适应 1 周，并饲喂常规兔粮。

2. 麻醉与动物准备

注意：所有后续操作均须在无菌条件下进行。手术区域和器械在使用前应使用10%聚维酮碘溶液、70%乙醇或季铵盐化合物进行消毒。

1. 通过耳缘静脉注射戊巴比妥钠（25 mg/kg）对兔进行静脉麻醉。
2. 确认兔失去自主活动能力后，将其转移至手术台，并置于仰卧位。用麻醉面罩覆盖其鼻部和口部，开始吸入0.7–1.0%异氟烷-氧气混合气体以实施全身麻醉。
   注意：若兔出现活动，短暂将异氟烷浓度提高至2%可有效抑制。
3. 使用电动剪毛器修剪颈部和肩部的毛发。喷洒70%乙醇或其他消毒液对皮肤表面进行消毒后，用剃刀刮除颈部区域残留的毛发。以10%聚维酮碘对术区进行消毒，并皮下注射盐酸利多卡因（3 mg/kg）作为局部麻醉。
   注意：观察气管的节律性....

结果

图1A 显示了静脉移植术后2周内膜增生成功的代表性图像（上图）。下图显示了负载microRNA-145的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid)）纳米颗粒对内膜增生的治疗效果，该治疗减轻了内膜增生（下图）。图1B 比较了磷酸盐缓冲液对照组（PBS）、对照microRNA（Cont-miR）组和microRNA-145（miR-145）组之间的内膜增生情况。microRNA通过聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒进行递送。microRNA-145治疗显著减轻了内膜增生。图2 显示了细胞增殖标志物Ki-67的免疫染色结果。miR-145组中Ki-67阳性细胞数量较少，表明血管平滑肌细胞（VSMCs）从不成熟的增殖状态转变为成熟的收缩状态。

讨论

本实验方案旨在提供一个实验平台，用于测试针对血管平滑肌细胞（VSMC）的各种分子或遗传干预措施，以调控其从增殖表型向收缩表型转化，从而在体内抑制静脉内膜增生的进展。利用该模型，我们成功在术后2周制备出内膜增生病变（图1A），并证明了microRNA-145在调控VSMC表型方面的治疗潜力^26,27，验证了本方案作为进一步研究抑制静脉内膜增生的有效模型。

我们的兔内膜增生模型包括以下三个主要步骤：1）导管损伤；2）颈静脉移植；3）远端分支结扎（图3）。经球囊导管通过损伤的静脉移植物已被证实发生去内皮化，且内膜呈现增生性改变^23,28。在本方案中，我们将导管损伤的静脉移植物视为临床上常用于冠状动脉或外周动脉旁路移植术中经手动加压和扩张.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 聚维酮碘溶液	Nakakita	872612	外科耗材
2-0 VICRYL Plus	Johnson and Johnson	VCP316H	外科耗材
4-0 丝线缝合线	Alfresa pharma	GA04SB	外科耗材
8-0 聚丙烯缝合线	Ethicon	8741H	外科耗材
头孢唑啉钠	Nichi-Iko Pharmaceutical	6132401D3196	抗生素
Fogarty 导管（2Fr）	Edwards Lifesciences LLC	E-060-2F	外科耗材
肝素	Nipro	873334	抗凝剂
静脉导管（20G）	Terumo	SR-OT2051C	外科耗材
异氟烷	Fujifilm	095-06573	麻醉剂
盐酸利多卡因	MP Biomedicals	193917	麻醉剂
戊巴比妥钠	Tokyo Chemical Industry	P0776	麻醉剂