一种模拟使用静脉移植物进行血管重建手术的兔静脉移植模型，用于评估动脉血压下的内膜增生

摘要

本实验方案旨在通过使静脉承受动脉血压，实验性地建立静脉内膜增生模型，以开发在使用静脉移植进行血管重建手术后减轻静脉内膜增生的策略。

摘要

尽管自体静脉移植物常用于缺血性疾病血管重建手术，但由于暴露于动脉血压下会加速内膜增生，其长期通畅率仍然较差。本方案旨在通过将兔颈外静脉移植至同侧颈动脉，建立静脉内膜增生的实验模型。该方案无需在躯干深部进行手术操作，切口范围有限，对动物创伤较小，便于移植后长期观察。这一简便的操作方法使研究人员能够探索抑制移植静脉内膜增生进展的策略。利用本方案，我们曾报道了将已知可调控血管平滑肌细胞（VSMC）由增殖表型向收缩表型转化的microRNA-145（miR-145）转导至获取的静脉移植物中的作用。我们证实，在移植手术前通过转导miR-145诱导VSMC表型转变，可有效抑制静脉移植物的内膜增生。本文报道了一种创伤较小的实验平台，可用于研究在血管重建手术中抑制静脉移植物内膜增生的潜在策略。

引言

由于动脉粥样硬化导致缺血性疾病的患者数量在全球范围内不断增加¹。尽管目前心血管疾病的药物和外科治疗已取得进展，但心肌梗死等缺血性心脏病仍是发病率和死亡率的主要原因²。此外，以外周肢体血流减少为特征的外周动脉疾病可引发严重肢体缺血，其中约40%的患者在确诊后6个月内失去肢体，死亡率高达20%³。

血管重建手术，如冠状动脉旁路移植术（CABG）和外周动脉旁路手术，是缺血性疾病的主要治疗手段。这些手术的目的是建立新的血流通道，以向动脉粥样硬化动脉发生狭窄或闭塞病变的远端部位提供充足的血流。尽管原位动脉移植物（如用于CABG的胸内动脉）因预期具有更长的通畅率而被优先选作旁路移植物，但由于静脉移植物（如自体大隐静脉）更容易获取和获得，因此在临床上更为常用⁴。静脉移植物的薄弱之处在于其通畅率较动脉移植物差⁵，这是由于在承受动脉压力时发生加速的内膜增生，从而导致静脉移植物病变⁶。

静脉移植物病变的发展经历以下三个阶段：1）血栓形成；2）内膜增生；3）动脉粥样硬化⁷。为了应对静脉移植物病变，已开展了大量基础研究⁸。迄今为止，根据最新指南，在冠状动脉或外周血管重建手术后的二级预防中，除抗血小板治疗和降脂治疗外，尚无其他推荐的药物治疗策略^9,10,11,12。因此，为了克服静脉移植物病变，特别是内膜增生，有必要建立一个相关的实验平台以支持进一步的研究。

内膜增生是一种适应性现象，发生在血管周围环境改变时，血管平滑肌细胞（VSMCs）在内膜中增殖、积聚并产生细胞外基质。因此，它构成了移植物粥样硬化的基础⁷。在增生的内膜中，VSMCs 表现出增殖和基质生成能力，而非收缩功能，这一现象被称为“表型转换”⁸。调控静脉移植物中 VSMCs 的表型以预防静脉移植物病变，是当前研究的关键目标，已有大量基础研究围绕这一主题展开⁸。然而，一项旨在通过药物手段调控 VSMC 表型的随机对照临床试验仅显示出有限的效果¹³。此外，目前尚无标准化的治疗方法用于预防内膜增生。未来仍需开展更多包括动物模型研究在内的基础研究。

为了推动该领域的研究，建立一种能够模拟在动脉血压条件下静脉移植物的动物模型至关重要，以便进行长期的术后观察。Carrel 等人建立了将犬的颈外静脉植入颈总动脉的动物模型¹⁴。此后，多种静脉移植物模型被用于研究动脉血压改变对生理和病理过程的影响，包括将下腔静脉移植至胸主动脉或腹主动脉，或将大隐静脉移植至股动脉^15,16,17。这些模型通常在猪或犬等较大型动物中建立，适用于模拟临床情况下的静脉移植物病变。然而，对于希望开发通过体内调控血管平滑肌细胞（VSMC）表型来减轻内膜增生新治疗策略的研究人员而言，若能建立一种无需特殊外科技术且成本较低的动物模型则更为理想。最初，兔颈静脉移植至颈动脉的模型被引入神经外科领域^18,19。随后，该模型被应用于内膜增生的研究^20,21。最初的模型仅包含静脉移植步骤，因而节省了操作时间。此外，后续研究显示，静脉移植物的制备方式本身也会影响内膜增生的程度²²。Davies 等人评估了在兔静脉移植模型中球囊导管损伤对内膜增生的影响^23,24。尽管在静脉移植基础上增加球囊损伤更接近临床实际情况，但仍需要更可重复的模型。因此，Jiang 等人研究了不同血流环境对内膜增生的影响，并建立了远端分支结扎术作为可重复性更高的模型²⁵。然而，他们在进行静脉移植时采用了套管技术，这与临床中手工缝合吻合的方式有所不同。在本实验方案中，我们报道了一种可重复、具有临床相关性且易于推广的兔静脉移植模型制备方法，用于评估在动脉血压条件下内膜增生的情况。

方案

注意：对动物实施的所有外科手术均应遵循《实验动物护理与使用指南》（www.nap.edu/catalog/5140.html）或其他适当的伦理准则。在开展实验前，相关方案须经相应机构的动物福利委员会批准。

1. 动物准备

1. 购买体重为 2.7–3.0 kg 的雄性日本白兔（或体型相当的兔子）。
2. 在进行实验前，将兔子在 12 小时光照-黑暗循环条件下适应 1 周，并饲喂常规兔粮。

2. 麻醉与动物准备

注意：所有后续操作均须在无菌条件下进行。手术区域和器械在使用前应使用10%聚维酮碘溶液、70%乙醇或季铵盐化合物进行消毒。

1. 通过耳缘静脉注射戊巴比妥钠（25 mg/kg）对兔进行静脉麻醉。
2. 确认兔失去自主活动能力后，将其转移至手术台，并置于仰卧位。用麻醉面罩覆盖其鼻部和口部，开始吸入0.7–1.0%异氟烷-氧气混合气体以实施全身麻醉。
   注意：若兔出现活动，短暂将异氟烷浓度提高至2%可有效抑制。
3. 使用电动剪毛器修剪颈部和肩部的毛发。喷洒70%乙醇或其他消毒液对皮肤表面进行消毒后，用剃刀刮除颈部区域残留的毛发。以10%聚维酮碘对术区进行消毒，并皮下注射盐酸利多卡因（3 mg/kg）作为局部麻醉。
   注意：观察气管的节律性运动，注意颈静脉和颈动脉的搏动情况。当呼吸频率和脉搏减慢时，可考虑暂时减少麻醉剂用量。监测经皮血氧饱和度和脉率亦有帮助。
   注意：此步骤可作为暂停点。

3. 颈静脉的采集

注意：在进行皮肤切口前，应使用局部麻醉剂（如利多卡因）。

1. 在皮肤切开前，皮下注射恩诺沙星（5 mg/kg）进行预防性给药。 镇痛处理采用皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg），每日两次，持续3天。
   注意：为避免体温下降，可使用手术部位擦洗代替将70%乙醇喷洒在动物体表。
2. 用手术刀沿颈部纵向切开50–60 mm。 钝性分离皮下组织和筋膜，暴露20–30 mm长的颈静脉节段。使用4-0丝线结扎所暴露静脉的所有分支。
3. 在颈内静脉和颈外静脉周围放置一根2-0丝线，以便在下一步切开颈静脉后立即进行结扎。
4. 切开静脉壁远端约1 mm处。将一根2-French球囊导管从切口处向静脉近端插入。用2-0丝线在颈静脉远端位置进行结扎固定。
5. 向球囊内注入0.2 mL空气，使球囊膨胀。通过导管往返三次，剥离静脉内膜以实现内皮细胞脱落。
   注意：该操作被认为等同于人类血管重建手术中大隐静脉移植物的扩张过程，后者同样会引起内皮细胞脱落。
6. 结扎静脉近端，切断静脉以获取移植物。
   注意：应仔细区分所获取静脉的远端与近端，因为与动脉吻合时需采用反向连接方式（即静脉的远端应与动脉的近端吻合）。例如，从某一侧插入静脉导管可作为标记方法。
7. 对获取的颈静脉进行治疗性处理时，应根据具体研究问题采用相应方法处理静脉（例如电穿孔²⁶或直接浸入溶液²⁷，以将microRNA转导至静脉壁）。
   注意：在本方案中，静脉移植物分别浸泡于磷酸盐缓冲液、对照microRNA及microRNA-145溶液中。此步骤可作为暂停点。

4. 使用获取的颈外静脉移植搭桥颈动脉

1. 暴露同侧颈动脉长约20–30 mm的节段，小心将其与邻近的静脉和神经分离。用4-0丝线结扎所有暴露静脉的分支。
2. 静脉注射肝素钠（200 IU/kg），等待3–4分钟。
3. 使用外科 夹夹闭动脉的近端和远端，在两夹之间剪断动脉。从近端和远端向切开的颈动脉内注射生理盐水，以扩张血管。
   注意：兔颈动脉容易收缩，应选择充分扩张的部位作为吻合部位。
4. 将获取的静脉以反向端对端方式与动脉进行吻合。
   1. 在远端吻合过程中，将一根20 G静脉导管从远端向近端插入获取的静脉，以保持静脉管腔开放。
   2. 使用8-0聚丙烯间断缝线将静脉近端与动脉远端吻合。在吻合口处及其对侧位置各放置两针锚定缝线，然后在锚定缝线之间的吻合线上方添加缝线。
   3. 将动脉和静脉移植物翻转至背面。在吻合线剩余部分继续添加缝线。
   4. 从静脉中移除静脉导管，夹闭静脉移植物的近端，松开颈动脉远端的血管夹。确认静脉移植物逐渐扩张。
   5. 使用8-0聚丙烯间断缝线将静脉远端与动脉近端吻合。松开动脉夹以检查吻合口是否出血，必要时加缝缝线止血。
      注意：用纱布轻轻压迫出血部位并等待片刻，可能足以实现止血。近端松夹后应观察静脉移植物是否立即扩张并出现强烈搏动。若未观察到此现象，应考虑重复步骤4.4.2–4.4.3。
5. 用4-0丝线结扎颈内动脉，以模拟低血流状态，并促进内膜增生。
6. 用生理盐水清洗伤口，逐层使用3-0聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）缝合伤口。

5. 术后操作

1. 检查动物自主呼吸恢复后，停止麻醉并移除麻醉面罩。在动物从麻醉中恢复期间，需频繁检查其状况。
2. 在呼吸功能完全恢复前，将动物与其他动物隔离。必要时可进行人工辅助呼吸。 在动物完全恢复前，不得将其放回群体饲养。
3. 麻醉恢复后，观察动物的进食和饮水情况，并提供适当的营养支持。给予镇痛药物（例如，皮下注射布托啡诺 0.05–0.2 mg/kg，每日2次，持续3天），并观察是否存在不适或疼痛的迹象。

结果

图1A 显示了静脉移植术后2周内膜增生成功的代表性图像（上图）。下图显示了负载microRNA-145的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid)）纳米颗粒对内膜增生的治疗效果，该治疗减轻了内膜增生（下图）。图1B 比较了磷酸盐缓冲液对照组（PBS）、对照microRNA（Cont-miR）组和microRNA-145（miR-145）组之间的内膜增生情况。microRNA通过聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒进行递送。microRNA-145治疗显著减轻了内膜增生。图2 显示了细胞增殖标志物Ki-67的免疫染色结果。miR-145组中Ki-67阳性细胞数量较少，表明血管平滑肌细胞（VSMCs）从不成熟的增殖状态转变为成熟的收缩状态。

讨论

本实验方案旨在提供一个实验平台，用于测试针对血管平滑肌细胞（VSMC）的各种分子或遗传干预措施，以调控其从增殖表型向收缩表型转化，从而在体内抑制静脉内膜增生的进展。利用该模型，我们成功在术后2周制备出内膜增生病变（图1A），并证明了microRNA-145在调控VSMC表型方面的治疗潜力^26,27，验证了本方案作为进一步研究抑制静脉内膜增生的有效模型。

我们的兔内膜增生模型包括以下三个主要步骤：1）导管损伤；2）颈静脉移植；3）远端分支结扎（图3）。经球囊导管通过损伤的静脉移植物已被证实发生去内皮化，且内膜呈现增生性改变^23,28。在本方案中，我们将导管损伤的静脉移植物视为临床上常用于冠状动脉或外周动脉旁路移植术中经手动加压和扩张...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 聚维酮碘溶液	Nakakita	872612	外科耗材
2-0 VICRYL Plus	Johnson and Johnson	VCP316H	外科耗材
4-0 丝线缝合线	Alfresa pharma	GA04SB	外科耗材
8-0 聚丙烯缝合线	Ethicon	8741H	外科耗材
头孢唑啉钠	Nichi-Iko Pharmaceutical	6132401D3196	抗生素
Fogarty 导管（2Fr）	Edwards Lifesciences LLC	E-060-2F	外科耗材
肝素	Nipro	873334	抗凝剂
静脉导管（20G）	Terumo	SR-OT2051C	外科耗材
异氟烷	Fujifilm	095-06573	麻醉剂
盐酸利多卡因	MP Biomedicals	193917	麻醉剂
戊巴比妥钠	Tokyo Chemical Industry	P0776	麻醉剂