在本实验中，通过尾静脉向小鼠注射可标记血管的罗丹明B异硫氰酸酯-葡聚糖。在暴露并固定肝脏后，可选择肝脏的特定区域，利用多光子显微镜观察活体内的深层组织。
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本文内容
摘要
摘要
观察小鼠肝脏组织的血管内动态过程，可使我们对小鼠肝脏相关疾病开展更深入的在体观察与研究。通过向小鼠体内注射可标记血管的染料，将其肝脏暴露并固定于观察框中，以实现活体肝脏的实时成像。利用双光子显微镜获取肝脏组织中血管的二维与三维图像，并对选定区域的组织进行连续成像，以观察其长期变化，同时记录肝脏组织内血管的动态改变。双光子显微镜是一种用于观察深层组织切片或器官中细胞及其功能的技术，其对组织微结构具有高敏感性，可在活体条件下实现生物组织的高空间分辨率成像，并获取组织的生化信息。尽管双光子显微镜可用于观察肝脏局部区域，但传统固定方法难以保证图像稳定性。本实验采用特制的真空吸附装置固定肝脏，从而在显微镜下获得更为稳定的肝脏图像。此外，该方法还可通过染料标记特定物质，用于观察这些物质在肝脏内的动态变化。
引言
血管可以为人体各种器官组织提供营养，并进行物质交换。同时，许多细胞因子、激素、药物和细胞也通过血管运输至特定部位发挥作用。观察肝组织中的血管变化，有助于了解肝组织内血流分布和物质运输情况，并协助分析某些与血管相关的疾病1，2。
观察小鼠肝脏血管的方法有多种。其中，光学显微镜在观察不透明的血管组织时存在诸多局限性3。多光子显微镜可用于无创、高分辨率地成像活体肝脏中的血管结构4。该技术不仅能获得血管的三维图像，还可用于帮助组织样本以观察其中的生物学效应；此外，该技术可对整个组织进行成像，而不仅仅是像计算机断层扫描和磁共振成像那样仅限于微血管5。
双光子显微镜能够有效检测深层活体组织中散射的荧光信号，且光毒性更小6。因此，可确保活体组织的活性，并减少损伤程度。与共聚焦显微镜相比，双光子显微镜具有更强的穿透能力，可观察更深的组织层次7，提供独特的三维成像。目前，双光子显微镜常用于颅神经成像8，并已拓展至活体小鼠神经元动态的研究9,10,11。
在本实验中，对小鼠血管进行荧光标记后，将肝脏固定于成像框架中，利用多光子显微镜可观察活体肝组织内血管的动态变化。本实验展示了如何标记特定物质，使用多光子显微镜辅助观察组织内部特定位置，观察细胞间组织中的细胞事件，进行光化学测量12,13,14，以及观察活体组织内部的物质动态过程15。例如，肿瘤内皮标志物1（TEM1）已被鉴定为在多种实体瘤的血管和间质中表达上调的一种新型表面标志物，通过标记针对TEM1的单链可变区片段（scFv）78，随后可利用多光子显微镜对小鼠血管瘤进行定位并评估肿瘤情况16。
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方案
所有动物护理和操作均遵循中国南方医院关于健康与福利的政策（申请编号：NFYY-2019-73）。
1. 小鼠准备
- 麻醉小鼠。
- 准备戊巴比妥钠（50 mg/kg）并装入注射器中。
- 用左手抓住小鼠（8周龄雄性C57BL/6），使其腹部朝上，头部低于尾部。用75%酒精对腹部皮肤进行消毒。
- 右手持注射器，将针头从皮肤右侧3-5 mm处刺入腹白线，确保注射器针头与皮肤呈45°角，缓慢将戊巴比妥钠注入腹腔。剃毛后，用75%酒精和氯己定溶液交替擦拭小鼠切口周围区域，共消毒3次。
- 通过观察翻正反射是否消失来判断麻醉是否成功。
- 经尾静脉注射异硫氰酸罗丹明B-葡聚糖。
- 准备100 µL浓度为10 mg/mL的异硫氰酸罗丹明B-葡聚糖溶液，并装入注射器中。
- 用75%酒精擦拭小鼠尾巴。
- 左手握住尾巴，右手持注射器，使针头与静脉平行，缓慢注入100 µL染料。
- 注射完成后，用棉签按压止血。
- 用无菌水浸湿的纱布浸湿小鼠腹部毛发，然后使用剃刀沿毛发生长方向剃除腹部毛发。剃毛后，用75%酒精和氯己定溶液交替擦拭小鼠切口周围区域，共消毒3次。
- 用75%酒精擦拭加热垫后打开电源，将小鼠仰卧放置于加热垫上，以维持其体温在37 °C。
2. 使用身体器官成像框架固定小鼠肝脏
注意：商用器官成像支架尚未发布。
- 将一个洁净的吸盘固定在指定位置。
- 安装器官成像固定装置（补充图 1），并用75%酒精擦拭加热垫和吸盘。
- 将吸盘（直径5 mm）连接至真空泵管路，并开启真空泵。
- 在经75%酒精消毒的无菌操作台上，交替使用75%酒精和氯己定溶液对小鼠切口周围区域进行三次消毒，然后使用手术剪从小鼠胸骨下缘向下剪去2 cm皮肤，暴露肝脏。
- 将小鼠连同加热垫一起放置于支架底座上。
- 调节器官成像固定装置，使吸盘固定住肝脏，随后施加30–35 kPa的负压进行吸附，使肝脏牢固贴附于吸盘上（补充图 2）。
3. 调整多光子激光扫描显微镜
- 打开多光子显微镜，选择 60x/1.00 W 物镜。
- 将固定架和小鼠置于物镜下方固定。
- 在吸引杯中心即物镜正上方滴加一滴生理盐水，使其完全覆盖物镜，然后调节物镜位置，使其刚好接触生理盐水。
- 双击计算机图标以启动激光软件并打开开关，随后按住电源按钮和快门按钮持续 3 秒。
- 将激光波长设置为 800 nm。
- 通过计算机启动显微镜操作软件。
- 在采集设置中，选择激光 800。
4. 使用多光子激光扫描显微镜观察
- 进行图像采集控制时，点击荧光开关。
- 确保关闭房间和设备的照明。为降低噪声水平，应在暗环境中使用显微镜。
- 打开显微镜上的光路快门。
- 将荧光滤光片旋转至第四档，并拉出光路切换器的两个拨杆。
- 通过目镜观察，使用粗调和微调准焦螺旋调节焦距，并利用X/Y轴调节视野，以找到目标区域。
5. 多光子激光扫描显微术
- 关闭软件中的荧光开关，将荧光滤光片切换至二挡（二挡为 RXD1），并推动光路开关的两个拨杆。
- 点击 Focus ×2 预览目标区域，并调整采集设置和图像采集控制参数（图像分辨率：1024）。
- 按下 Control + C，调节高压、增益和偏移量（以降低噪声水平）。
- 点击 Stop 停止预览，点击 XY 按钮进行二维扫描，扫描完成后保存图像（图1）。
- 选择一个区域，点击 Depth，然后点击 Preview，在 Microscope 设置中选择终止层面和起始层面（确保包含血管所需的完整部分），进行三维图像扫描，扫描完成后保存（图2）。
- 选择一个区域，点击 Time，并调整其他采集设置和图像采集控制参数（步进大小：1 μm；层数：10；时间扫描次数：40），扫描不同层面，扫描完成后保存以获得动态图像（视频1）。
注意：扫描过程中需专人照看小鼠，并根据需要追加麻醉。 - 通过颈椎脱臼法处死小鼠。
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结果
使用双光子显微镜获得的图1中可以观察到肝脏中血管的分布情况。血管从主干分出多个分支，并分布到周围空间。血管的外周呈红色，内腔为暗色，内部存在许多物质。图像越清晰，说明其位置越接近观察平面。周围还可见一些红色斑点，可能是染料渗透至周围组织并染色了其他物质所致。在视频1中，可见非红色的物质在红色血管内移动，可能是细胞。视频末尾，部分此类物质变暗，这可能是由于固定肝脏随时间推移固定效果不佳所致。该方法可支持长达2小时的成像。
图1：多光子显微镜下肝组织中的血管。血管呈红色。一幅分辨率为2048 ×...
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讨论
观察特定活体组织是理解组织内物质变化、定位及其生物学效应的有效手段17。本实验的关键步骤包括使用器官成像固定装置固定肝脏，以解决因呼吸和心跳引起的运动伪影问题，并利用多光子显微镜进行观察。通过该方法，可借助多光子显微镜对活体肝脏内部组织进行成像，并对血管进行荧光标记，从而清晰观察其位置及三维结构。该方法还可通过对特定物质进行荧光标记，并在活体组织中动态追踪该物质，以观察其特定效应，提供进一步的可视化信息。
多光子显微镜已从一种新颖技术发展为在组织环境中获取细胞事件信息的不可或缺工具。然而，为了获得稳定的图像以有效观察特定组织和器官，必须将器官固定。呼吸和心跳引起的运动伪影会妨碍对肝脏进行直接成像，因此需要使用器官固定装置，该装置利用真空吸附原理固定器官，防止图像抖动。真空吸盘还可用于固定多种不同的器官。但是，若未使用适当的负压或成像时间超过2小时，则存在组织破裂的风险。
尽管多光子显微镜的分辨率略低于共聚焦显微镜，但其穿透深度可达9-10 µm，能够提供更深层组织的观察图像，并用...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（81772133，81902444）、广东省自然科学基金（2020A1515010269，2020A1515011367）、广州市公民健康科技研究项目（201803010034，201903010072）和军事医学创新项目（17CXZ008）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 × 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W 加热垫 | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% 绝对乙醇 | 广东光华科技股份 | 1.17113.023 | |
| 吸水棉球 | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| 小鼠手术器械 | RWD Life Science | SP0001-G | 包括剪刀和镊子 |
| 多光子显微镜 | Olympus | FV1200MPE | |
| 器官成像固定装置 | BiolinkOptics Technology | BL336 | 包括吸盘、软管、负压泵和支架 |
| 罗丹明 B 异硫氰酸酯–葡聚糖 | Sigma | R9379 | |
| 剃毛机 | Lei Wa | RE-3201 | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma | P3761-25G |
参考文献
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- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
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重印与许可
