方法文章

用于基于原子力显微镜的力谱单分子共价连接

DOI：

10.3791/60934

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2020年3月16日

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1Institute of Physical Chemistry, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2Chair in Polymer Chemistry, Saarland University, 3Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

本文内容

摘要

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将探针分子共价连接到原子力显微镜（AFM）悬臂尖端是研究其物理性质的关键技术。通过基于AFM的单分子力谱法，可高度可重复地测定聚合物的拉伸力、脱附力及其长度。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于原子力显微镜（AFM）的单分子力谱技术是研究单个聚合物与表面之间相互作用的理想工具。要实现真正的单分子实验，探针分子的共价固定至关重要，因为只有这样，才能对同一个单分子获得数百条力-伸展曲线。而大量曲线的获取反过来又是证明仅探测到单个分子所必需的。此外，钝化处理对于防止探针分子与AFM悬臂针尖之间以及AFM悬臂针尖与基底表面之间的非特异性相互作用至关重要。本文所介绍的功能化方案具有良好的可靠性，且可轻松应用于多种聚合物。在力-伸展曲线中可检测到特征性的单分子事件（即拉伸段和平台段）。从这些事件中可提取出拉伸力、脱附力和脱附长度等物理参数。这对于在单分子水平上精确研究刺激响应体系尤为重要。作为示例体系，聚乙二醇（PEG）、聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNiPAM）和聚苯乙烯（PS）分别在水环境中从SiOx表面（适用于PEG和PNiPAM）以及疏水性自组装单分子层表面（适用于PS）上被拉伸并脱附。

引言

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自20世纪80年代发明以来1，原子力显微镜（AFM）已成为自然科学中最重要的成像技术之一，具有亚纳米级空间分辨率、亚皮牛顿级力分辨率，并可在多种溶剂和温度条件下进行测量2,3,4,5,6,7。

除了成像8,9之外，原子力显微镜（AFM）还可用于单分子力谱（SMFS）研究，以揭示单个聚合物与表面之间的黏附相互作用、单个聚合物的物理性质以及蛋白质的解折叠机制7,10,11,12,13,14,15,16。在常规的SMFS实验中，将功能化的悬臂探针与表面接触，使AFM悬臂尖端的聚合物物理吸附到该表面上。通过将AFM悬臂探针从表面回撤，悬臂偏转的变化被转换为作用力，从而得到力-伸展曲线4。可依据不同参数（如拉伸速度、在表面的停留时间、对表面的压入深度、温度、溶剂17,18以及固体基底、聚合物薄膜或支撑脂双层等不同表面19,20,21,22）来测定拉伸力、脱附力和脱附长度等物理参数。此外，还可从不同的空间方向对聚合物进行探测，从而研究聚合物的摩擦特性23,24,25,26。

对于此类研究，将被研究的聚合物共价连接到原子力显微镜（AFM）探针尖端至关重要。因此，确保单个分子事件的高产率，且每次均为同一种聚合物结合于AFM悬臂探针尖端，可有效避免因AFM悬臂弹簧常数校准27,28、结合位点差异29或使用不同聚合物（具有不同轮廓长度）所导致的结果偏差，后者常见于纳米捕获实验中30,31,32。此外，也可在很大程度上避免与其他聚合物的相互作用以及平均效应的影响18,28。为实现聚合物与AFM探针尖端的共价连接，可采用多种化学修饰方法，其中许多方法已在Hermanson的著作中进行了总结33。基于氨基和巯基的连接反应以及点击化学是AFM探针尖端功能化中最常用的方法34,35,36,37,38,39,40,41,42。Becke 等人40展示了如何利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）/NHS化学方法将蛋白质连接至AFM探针尖端。然而，上述官能团容易发生交联，从而导致功能丧失43,44。此外，碳二亚胺在溶液中易快速水解43。相比之下，马来酰亚胺和巯基通常更稳定，且不易发生交联反应。本方案是对先前发表于参考文献35,39中的实验流程的优化。

本文介绍了一种可靠的官能化方案，该方案可轻松适配多种不同的聚合物，不受轮廓长度或疏水性等性质的限制。作为示例，选用了三种不同的聚合物：亲水性的聚乙二醇（PEG）和聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNiPAM），以及高摩尔质量的疏水性聚苯乙烯（PS）。为了实现与合适连接分子的共价结合，所选的三种聚合物均以端基硫醇基团作为官能团。连接分子本身通常为短链PEG聚合物，具有两个活性位点：一端为硅烷基团，另一端为马来酰亚胺基团。前者可实现与原子力显微镜（AFM）探针尖端的共价连接，后者则可与官能化的高摩尔质量聚合物的硫醇基团发生结合反应。此外，非活性PEG连接分子可作为钝化层，防止探针聚合物与AFM探针尖端之间以及AFM探针尖端与基底表面之间发生非特异性相互作用。

方案

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注意：见图1以获取示意图概览。

1. 试剂准备

注意：本方案所用的聚合物包括：马来酰亚胺-聚乙二醇-三乙氧基硅烷（silane-PEG-mal，5 kDa）、巯基-聚乙二醇-巯基（HS-PEG-SH，35 kDa）、巯基封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNiPAM-SH，637 kDa）以及巯基封端的聚苯乙烯（PS-SH，1.3 mDa）。

  1. 通过原子转移自由基聚合制备结构明确且高摩尔质量的PNiPAM-SH，随后转化并还原功能端基以引入巯基，具体方法见文献18。详细结构请参见图1。
  2. 为储存化学品，需在充满氮气的干燥手套箱系统中分装成小份，以避免接触空气中的氧气和水分。PEG和PNiPAM具有吸湿性45,46，且PEG、PNiPAM和PS的功能端基在常温储存条件下易被氧化33,47,48。所有化学品均需在-20 °C下保存。
  3. 使用分析纯或更高纯度的溶剂。此外，清洗原子力显微镜（AFM）探针芯片和玻璃器皿时应使用超纯水，因为单分子实验对任何污染都非常敏感。

2. 仪器设置

注意：使用不锈钢或玻璃制成的镊子和烧杯。使用倒置镊子以确保安全抓握（例如具有低弹簧常数的 R3 SA 型号）。

  1. 配制 RCA 溶液（超纯水、过氧化氢和氨水，比例为 5:1:1），用于清洗玻璃器皿和镊子。
  2. 将器皿放入烧杯中，并加入 RCA 溶液直至完全浸没玻璃器皿或镊子。
  3. 将步骤 2.2 中的烧杯在 80 °C 下加热 1 小时。
  4. 用超纯水反复冲洗器皿，直至无明显刺激性气味（至少三次）。
  5. 将玻璃器皿和镊子在烘箱中干燥（120 °C）。

3. 尖端功能化

注意：所有步骤均应在通风橱中进行，以避免吸入有机蒸气。此外，必须佩戴手套、实验服和护目设备。每一步均需使用腈类或乳胶手套，以避免污染。使用甲苯时，应佩戴耐溶剂手套。除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。每一步均应使用新的仪器和手套，以避免可能的交叉污染。

  1. 通过将氧气等离子体作用于 AFM 悬臂芯片 MLCT-Bio-DC 来进行表面活化。
    注意：等离子体处理在后续功能化步骤中的效率与等离子体腔室中的氧气含量成正比。
    1. 使用新清洁的镊子将 AFM 悬臂芯片放入等离子体腔室（40 kHz，600 W）中。
    2. 使用自定义修改的活化程序：抽真空（0.1 mbar）— 通入氧气至压力为 0.2 mbar（4 分钟）— 等离子体处理（功率：40%，持续时间：2 分钟，处理压力：0.2 mbar）。
    3. 对腔室进行通气，并立即继续进行步骤 3.2.2，以防止空气中的污染物吸附到 AFM 悬臂芯片上。
  2. 硅烷化与 PEG 化
    注意：各步骤之间的时间控制是一个关键参数。在等待期间应尽可能新鲜地配制溶液。马来酰亚胺基团在水性介质中易发生水解，巯基在溶液中也容易被氧化为二硫键33,47，从而阻碍 AFM 针尖的功能化反应。
    1. 在耐溶剂的塑料或玻璃管中配制甲苯中的硅烷-PEG-马来酰亚胺溶液（1.25 mg/mL），并将 6 mL 溶液倒入平底培养皿中，每皿 3 mL。
      注意：如果在单分子力谱（SMFS）实验中观察到多个探针聚合物结合现象，可通过将硅烷-PEG-马来酰亚胺与非功能化硅烷-PEG 混合来减少锚定位点的数量。为调节钝化层中 PEG 的质量（即轮廓长度），可使用不同分子量的 PEG27。
    2. 在步骤 3.1.3 后立即将 AFM 悬臂芯片浸入硅烷-PEG-马来酰亚胺溶液中（每培养皿最多 10 片），在 60 °C 下孵育 3 小时35。
    3. 将培养皿从烘箱中取出，让溶液冷却至少 10 分钟。
    4. 小心冲洗每一片 AFM 悬臂芯片。当穿过气-液界面时，应减小毛细力对 AFM 悬臂的影响，例如在将芯片浸入溶液时略微倾斜。
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，用甲苯冲洗三次。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，先用甲苯冲洗一次，再用乙醇冲洗两次。
    5. 选择至少两片 AFM 悬臂芯片作为对照芯片，跳过步骤 3.3，并按以下方式冲洗，以逐步提高溶剂极性：
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，先用乙醇冲洗两次，再用超纯水冲洗一次。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，用超纯水冲洗两次。
        注意：对照 AFM 悬臂芯片经历了所有功能化步骤，唯独不进行聚合物连接（步骤 3.3）。它们用于验证功能化过程、AFM 悬臂芯片夹持系统、表面以及 SMFS 实验所用溶剂的洁净程度。
  3. 共价聚合物连接
    注意：尽管预期 AFM 针尖已完全被马来酰亚胺基团覆盖，但单个探针聚合物的结合位点却很少，因为马来酰亚胺在水中会发生水解，生成无活性的 PEG47。这些无活性的 PEG 如上所述起到钝化层的作用。
    1. 在步骤 3.2.5 后，立即将 AFM 悬臂芯片浸入以下任一聚合物溶液中，置于 3 mL 培养皿中。若相应聚合物未充分溶解，可使用 40 °C 水浴并充分搅拌。
      注意：由于使用巯基封端的聚合物可能导致形成二硫键，从而干扰其与硅烷-PEG-马来酰亚胺上马来酰亚胺基团的反应，因此建议添加还原剂，尤其是在水溶性聚合物于水相缓冲液中进行步骤 3.3 时33。
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，在甲苯中使用 1.25 mg/mL 的浓度，在 60 °C 下孵育 1 小时。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，在乙醇中使用 1.25 mg/mL 的浓度，在室温下孵育 3 小时。
        注意：如果在 SMFS 实验中观察到多个探针聚合物结合现象，应降低聚合物浓度。
    2. 小心冲洗每一片 AFM 悬臂芯片。
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，在冷却 10 分钟后，依次用甲苯冲洗两次、乙醇冲洗两次，最后用超纯水冲洗一次。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，用乙醇冲洗两次，再用超纯水冲洗两次。
    3. 将每片 AFM 悬臂芯片单独存放于盛有超纯水的小型（1 mL）培养皿中，于 4 °C 保存，直至实验使用。

4. 表面准备

  1. 氧化硅晶圆
    注意：该表面用于PEG和PNiPAM的单分子力谱（SMFS）实验。
    1. 使用金刚石刀将氧化硅晶圆切割成小片。
    2. 将氧化硅小片分别放入微量离心管中，并用乙醇充满各管。
    3. 对氧化硅小片进行超声处理10分钟。
    4. 用乙醇冲洗氧化硅小片两次，并在氮气流下小心吹干。立即使用这些氧化硅小片。
  2. 金表面自组装的疏水烷烃硫醇单分子层（SAM）
    注意：该表面用于聚苯乙烯（PS）的单分子力谱（SMFS）实验。有关SAM的更多信息，请参见文献39,49。
    1. 使用镀金硅晶圆（A [100]，5 nm钛，100 nm金）进行步骤4.1.1–4.1.4。
    2. 将表面小片在1-十二烷硫醇溶液（2 mM）中孵育18小时。
    3. 用乙醇对新制备的SAM表面冲洗两次。
    4. 用氮气流吹干SAM表面，可立即使用；或将其保存在乙醇中，最多可保存4天以备后续使用。

5. 数据采集

注意：此处显示的所有测量均在超纯水中进行，使用 Cypher ES 原子力显微镜（AFM），并配备加热和冷却样品台以实现温度变化。通常，任何具备液体环境中测量能力的原子力显微镜均可使用。

  1. 将功能化的原子力显微镜（AFM）悬臂芯片插入原子力显微镜中。
  2. 将制备好的样品表面粘接到适用于液体环境中测量的样品台中（例如，High Resolution Replicating Compound 101RF 或紫外光固化胶粘剂）。
    注意：这些粘合剂具有高度惰性，对多种极性溶剂具有良好的耐受性。在使用前应检查粘合剂对非极性溶剂（如甲苯或己烷）或高温的耐受性。
  3. 将原子力显微镜悬臂芯片和探针样品浸入液体中，此处为超纯水。
    注意：可在原子力显微镜悬臂芯片的样品台上滴加一滴溶剂（约 100 µL）。用溶剂覆盖原子力显微镜悬臂芯片可减少毛细作用力，否则当探针穿过气-液界面接近样品表面时，该力将作用于原子力显微镜悬臂上。
  4. 如有需要，调节温度并使系统达到平衡。
    注意：对于带有反射涂层（如铝或金）的原子力显微镜悬臂，温度变化可能由于双金属效应引起悬臂偏转。应在远离样品表面的位置（数 µm）进行平衡，直至偏转信号不再发生变化（对于 MLCT-Bio-DC，最长可达 15 分钟）。
  5. 随机改变温度，以排除功能化层老化可能带来的影响。确保所用温度不会导致原子力显微镜悬臂发生不可逆弯曲。
    注意：温度变化可能影响溶剂性质（如蒸发或黏度变化），从而干扰实验。在本示例中，以水为溶剂，温度在 40 K 范围内以 10 K 为步长变化（例如，从 278 K 到 318 K）。
  6. 接近样品表面，通过在硬质表面（如二氧化硅）上获取力-伸展曲线来测定 InvOLS（反向光学杠杆灵敏度）。具体方法为：记录光电探测器的偏转信号（单位：V）随压电陶瓷位移的变化，并使用线性函数拟合曲线中代表原子力显微镜悬臂针尖压入基底表面部分（排斥区）的斜率。为减小误差，至少取五个测量值的平均值作为最终的 InvOLS 值。更多细节请参见文献4,39。
    注意：InvOLS 只能在硬质表面上可靠测定。若在软表面或界面进行实验，应确保在软表面附近放置一个硬质表面，以便在软表面实验前后完成 InvOLS 校准，而无需拆卸原子力显微镜装置。
  7. 为测定弹簧常数，将原子力显微镜悬臂移至既无吸引力也无排斥力作用的高度（数 µm），然后记录热噪声谱，绘制功率谱密度（PSD）随频率变化的曲线。以下步骤通常由商用原子力显微镜软件中的自动内置功能完成：首先，对获取的热噪声谱进行拟合分析，例如采用简谐振子（SHO）模型对 PSD 进行拟合，拟合范围至第一和第二共振峰之间的最小值处；其次，计算拟合部分 PSD-频率曲线下的面积，该面积代表原子力显微镜悬臂在垂直方向上的均方位移；最后，利用能量均分定理计算原子力显微镜悬臂的力常数28,50。
    注意：应选择包含原子力显微镜悬臂第一共振峰的合适频率范围。为获得足够的信噪比，至少应累积 10 条 PSD 曲线，并尽可能提高频率分辨率。
  8. 开始实验。以网格方式（例如，在 20 × 20 µm2 区域内采集 10 × 10 个点）记录力图，获取力-伸展曲线，以避免局部表面效应（如杂质、位错等），并对不同表面区域进行平均。
    注意：典型参数包括拉伸速度为 1 µm/s，采样速率为 5 kHz，以确保足够的分辨率。当拉伸速度变化时，应相应调整采样速率。回缩距离应根据所测聚合物的轮廓长度或脱附长度进行调整（约为预期长度的两倍）。
  9. 调整并改变探针在样品表面的停留时间，以允许单个聚合物链与表面充分粘附（通常为 0 – 5 秒）。
  10. 在实验结束时重复测定 InvOLS 和弹簧常数，以检验系统的稳定性与数据一致性。
    注意：若聚合物与表面之间存在强粘附作用，可在实际测量完成后进行校准，以保护功能化层不受损伤。

6. 数据评估

注意：数据评估使用基于 Igor Pro 编写的自定义软件来执行以下步骤。

  1. 通过将原始偏转信号（单位：伏特）乘以记录的 InvOLS 和测定的弹簧常数，将其转换为力值（单位：牛顿）。
  2. 将原子力显微镜（AFM）悬臂的偏转量（原始偏转信号乘以 InvOLS 后的值）从压电元件在垂直方向上的驱动距离中减去，以获得真实的延伸量（探针-表面距离）4。
  3. 通过拟合最后一个事件之后基线的线性函数，并从力-延伸曲线中减去该函数，对所获得的力-延伸曲线进行漂移校正。拟合部分应代表远离表面的足够延伸区域，在该区域内，AFM 悬臂探针与底层表面之间既无吸引力也无排斥力作用。随后，将基线设定为零轴。
    注意：在金等高反射性表面进行测量时，可能会出现干涉现象。这是由于激光束部分从表面以及 AFM 悬臂背面反射所致。因此，所获得的力-延伸曲线可能在垂直延伸方向上表现出正弦形式的力信号伪影。此类伪影会影响最终的力值。为仍能使用这些力-延伸曲线，可进行校正（图 2）。
  4. 若力-延伸曲线中出现干涉现象，选择一条具有代表性的力-延伸曲线（回缩曲线），该曲线除可能存在的非特异性黏附峰外，仅显示相同的正弦伪影（即振幅和相位）（图 2A）。
    注意：对代表性力-延伸曲线进行平滑处理，以获得干涉信号的低频模式。
  5. 选择一条需要校正的力-延伸曲线（图 2B）。
  6. 将步骤 6.4 和 6.5 中的两条力-延伸曲线叠加，以确保二者表现出相同的正弦伪影（即振幅和相位）（图 2C）。
  7. 将待校正的力-延伸曲线减去（已平滑的）代表性力-延伸曲线，从而得到一条接近直线而非正弦形的基线（图 2D）。
    注意：需确保代表性曲线中的非特异性黏附峰与待校正曲线中出现的单分子事件明显区分开。实际上，代表性曲线的选择对于正确校正至关重要。

结果

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以下示例展示了聚合物PEG、PNiPAM和PS的单分子拉伸与脱附实验结果。所有原子力显微镜（AFM）探针均按照上述方案进行了功能化处理。PEG和PNiPAM在SiOx表面进行测量，并改变了温度条件。关于PEG和PNiPAM温度依赖性拉伸曲线的详细讨论，请参见Kolberg等人的研究18。另一种不同的力-伸长模式表现为恒定力的平台区（例如，在水中将PS从金基底上末端为甲基的烷烃硫醇自组装单分子层（SAM）中脱附时4,27,39,51）。

示例1：PEG和PNiPAM在水中的拉伸行为
通过将单个PNiPAM和PEG聚合物一端共价连接到AFM悬臂尖端，另一端物理吸附在SiOx表面，测量其在水中随温度变化的拉伸行为。在完成校准和空白对照实验后（少于2%的力-伸长曲线显示单分子事件），对每个AFM悬臂至少记录两个力图。温度依赖性实验通过在每个温度下至少记录一个力图来完成。当仅观察到少量拉伸事件时，即弃用该AFM悬臂，并使用芯片上的下一个悬臂（通常按MLCT-Bio-DC芯片的C、B、D、E顺序进行）。以PEG的代表性数据为例，在500条测得的力-伸长曲线中，有95条观察到单个拉伸事件（占19%）。对于PNiPAM，在600条力-伸长曲线中有252条显示出拉伸特征（占42%）。为了更便于比较力-伸长曲线，针对每个温度生成了一条主曲线。为此，仅选取那些拉伸至至少500 pN且构象涨落和溶剂效应可忽略的曲线52。最终纳入分析的拉伸曲线数量为：PEG在278 K时为3条，298 K时为7条，318 K时为4条；PNiPAM在278 K时为4条，298 K时为3条，318 K时为3条18。

生成主曲线的步骤如图3所示。所选的力-伸展曲线（图3A）被重新缩放至一个长度L0（即在500 pN力下的伸展长度），见图3B。黏附峰显示出表面与原子力显微镜（AFM）探针尖端之间非特异性黏附存在较大变异，但这并不影响聚合物的拉伸行为。在合并重新缩放后的力-伸展曲线后，采用二项式平滑法对曲线进行平均处理，如图3C所示。该处理方法使用高斯滤波器，将数据与来自帕斯卡三角形的归一化系数进行卷积，其平滑参数水平为2053。最终，针对每个温度均获得一条主曲线，如图3D所示。放大图显示了温度对力-伸展行为影响最为显著的区间。

PEG（A）与PNiPAM（B）的温度行为比较见图4。对于PEG，随着温度升高，其拉伸力呈下降趋势。当温度从278 K升高至318 K时，在100 pN下的重缩放延伸长度增加了约5%。而对于PNiPAM，则观察到相反的温度依赖性变化：当温度从278 K升高至328 K时，在100 pN下的重缩放延伸长度减少了约1%。此外，通过计算任意给定力值下力-延伸主曲线下的面积，可获得拉伸自由能。结合分子动力学（MD）模拟18，该方法可用于提取拉伸自由能中的能量和熵贡献。

示例2：聚苯乙烯在水相中从自组装单分子膜表面解吸
通过测定聚苯乙烯在水相中从自组装单分子膜（SAM）表面的解吸行为，可确定其解吸作用力与解吸长度，从而量化疏水相互作用。完成校准后，需在样品表面至少两个不同位置记录力图谱。当聚合物成功连接时，力-伸展曲线呈现出恒定力的平台区，这是其典型特征，见图5A和图5C。当被测键的动态过程远快于原子力显微镜（AFM）探针尖端的拉伸速率（准平衡状态）时，可观察到类似平台的解吸行为。通过对平台型力-伸展曲线的力-伸展轨迹进行积分，可直接获得黏附自由能54。该方法已被用于测定液体环境中单个聚合物在表面上的静电作用、色散力、疏水相互作用以及摩擦特性2,4,23,51,54,55。

每个恒定力平台均用S型曲线进行拟合，以确定解吸力和解吸长度，然后将这些值绘制成直方图。直方图采用高斯函数拟合，以提取最大值和标准差。为了更清晰地展示，解吸力和解吸长度的值在散点图中共同显示，如图5B和图5D所示。

对于水环境中自组装单层膜上聚苯乙烯的脱附力，所测定的数值与先前获得的结果一致19,23。由于脱附长度与聚合物的轮廓长度相关51，脱附长度分布可用于证明相应聚合物通过其功能末端基团共价连接至原子力显微镜探针尖端。因此，脱附长度可作为识别特征。

当多个聚合物连接到原子力显微镜（AFM）悬臂针尖时，在力-伸展曲线中可观察到一系列平台（离散台阶）56。每个平台代表在不同伸展长度下发生的单个聚合物脱附事件。图5C 和 图5D 所示实验展示了一个典型情况，即同时有两个聚合物连接到AFM悬臂针尖。通过对最终断裂事件进行拟合，可发现脱附长度呈现双峰分布，而脱附力则呈现窄分布。在此情况下，较短的脱附长度在90%的力-伸展曲线中出现，表现为单一平台，或作为较长平台上的附加平台，如 图5C 所示。较长的脱附长度则在37%的获得的力-伸展曲线中出现。因此，脱附长度的分布可用于确定连接到AFM悬臂针尖的不同聚合物的数量。通常情况下，脱附长度值的窄分布表明在所获得的力-伸展曲线中探测的是同一个单一聚合物。同时，可通过相应力-伸展曲线的叠加分析来判断是否测量的是同一个单一聚合物。

在证实单个PS聚合物的共价结合后，可针对该PS聚合物开展进一步实验，改变底物（固体表面以及聚合物薄膜）、溶剂条件、温度、拉伸速度或停留时间。

AFM悬臂针尖功能化过程示意图；等离子体活化、硅烷化、PEG化。
图1：针尖功能化过程的示意图。 包括原子力显微镜（AFM）悬臂针尖在（1）等离子体活化、（2）硅烷化/PEG化以及（3）聚合物连接后的化学修饰。此外，还展示了所用聚合物的详细化学结构，分别为聚乙二醇（PEG）、聚N-异丙基丙烯酰胺（PNiPAM）和聚苯乙烯（PS）。请点击此处查看该图的放大版本。

力-延伸分析，显示力与延伸曲线的图表，实验数据校正步骤。
图 2：消除力-延伸曲线中的干扰。（A）寻找一条在延伸过程中显示出正弦力信号伪影但无单分子拉伸事件的力-延伸曲线。（B）选择一条包含单分子事件的力-延伸曲线，该曲线需从正弦伪影中进行校正。（C）叠加两条曲线，以确认它们的正弦伪影是否确实匹配。（D）通过从曲线（B）中减去曲线（A），获得一条具有直线基线的力-延伸曲线。尽管粘附峰无法用于进一步分析，但该力-延伸曲线现已对伪影进行了校正，从而在单分子事件区域（此处：> 0.2 µm 延伸）获得更精确的力值。请点击此处查看此图的放大版本。

力-伸展分析；不同温度下的图谱序列重标度、平滑处理及主曲线比较。
图 3：从 PEG 在 298 K 下的力-伸展曲线确定主曲线。（A）在 298 K 下的实验数据，使用了 7 条力-伸展曲线。在 500 pN 力下将曲线重标度至长度 L0 后（B），可通过二项式平滑处理将这些力-伸展曲线合并并取平均，从而获得主曲线（C）。重标度后的曲线以点表示，主曲线以实线表示。最后，可对不同温度下获得的主曲线进行比较（D）。插图为力-伸展行为中温度效应最显著区域的放大图。请点击此处查看该图的放大版本。

温度变化的力-伸展曲线；聚合物力学测试结果示意图。
图4：PNiPAM与PEG的温度依赖性主曲线比较。 对于PEG，当温度升高时，在100 pN（中等力范围）处观察到归一化伸展长度增加（A）；而对于PNiPAM，则表现出相反的温度依赖性偏移（B）。请点击此处查看该图的放大版本。

力-伸展曲线分析；绘制机械性能和力分布图。
图 5：水中 SAM 上 PS 的力-伸展曲线分析。 （A）典型的力-伸展曲线（蓝色），其中平台区经 S 形拟合（紫色）。此外，箭头标出了所确定的平台力值（红色）和长度值（绿色）。通过 S 形拟合获得的脱附力和脱附长度值以散点图显示，相应的直方图采用高斯函数拟合。（B）测得的平均脱附力和脱附长度分别为 (112 ± 6) pN 和 (659 ± 7) nm，其中 93% 的力-伸展曲线表现出此类单一平台事件。（C）同时有两个聚合物分子连接在原子力显微镜（AFM）探针尖端时的典型力-伸展曲线（蓝色）。在此情况下，脱附力呈单峰分布，平均力值为 (117 ± 5) pN，而脱附长度呈双峰分布，对应的平均长度值分别为 (656 ± 9) nm 和 (1050 ± 16) nm。（D）90% 的采样力-伸展曲线仅显示单一平台事件。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

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基于原子力显微镜的单分子力谱技术是研究高分子物理中单分子相互作用的主要工具之一。对于真正的单分子实验，必须将探针高分子共价连接到原子力显微镜悬臂针尖上。

以往许多研究基于“纳米垂钓”实验，特别是对于PNiPAM，其中聚合物被吸附在表面，然后通过使用原子力显微镜（AFM）悬臂针尖随机从基底上钩取并拉伸这些聚合物30,31。这种方法可能改变实验结果，导致对单分子行为的误读。在此类实验中，协同效应可能主导结果，因为无法排除聚合物之间与邻近分子的相互作用。这对结果具有显著影响，尤其对于那些在体相中与孤立单分子状态下表现出显著不同行为的聚合物而言尤为如此57,58。

本文所展示的功能化方案具有良好的可靠性，且可轻松应用于不同聚合物，无论其轮廓长度、疏水性或单体的空间位阻如何。此外，还提供了钝化步骤，以防止单个探针聚合物与原子力显微镜（AFM）悬臂针尖之间，以及AFM悬臂针尖与基底表面之间的非特异性相互作用。同时，本文展示了对呈现拉伸事件的力-伸长曲线的评估方法，并提出了一种构建主力气-伸长曲线的分析流程，从而更有效地揭示例如温度对力-伸长行为的影响。此外，还提供了针对呈现恒定力平台的单分子脱附事件的分析方法。同时，给出了一种简单方法用于校正力-伸长曲线中可能出现的正弦形力信号伪影，此类伪影若不加处理，可能会影响实验结果的准确性。

与 Stetter 等人39的方法相比，本文所介绍的功能化流程由四步减少为三步，且流程的稳健性得到提升。将聚乙二醇化（PEGylation）和硅烷化在一步中完成的主要优势在于能够更好地控制反应过程，并提高产率。此外，所需配制的溶液更少，冲洗步骤也相应减少，从而降低了制备的工作量和耗时，同时提高了实验的可重复性。此外，原子力显微镜（AFM）探针的转移始终是功能化过程中的关键环节。将探针从一种溶液转移至另一种溶液时，总会存在因穿过气-液界面而显著影响功能化质量的风险，或因镊子操作不当而导致探针丢失。

为了证明单个聚合物与原子力显微镜（AFM）探针尖端之间实现了正确的共价连接，必须满足若干条件。首先，对照AFM探针至关重要，每次功能化实验都应制备相应的对照探针。只有当对照实验中仅有少量力-伸展曲线显示出拉伸或平台现象时（在本示例中小于2%），才可认为功能化过程及用于实验的液体池是洁净的。

清晰的拉伸模式且无额外液滴或峰值，是获得合适单分子拉伸事件的关键。此外，还应分析断裂力对断裂时的力加载速率的依赖性，或拉伸曲线的完整弹性响应，以排除多个聚合物同时解吸的可能性59,60。对于PEG和PNiPAM，在表面不同位置获取的力-伸长曲线中，分别有19%和42%表现出此类拉伸模式。为了获得拉伸事件，聚合物在相应基底表面的物理吸附必须足够强；否则将观察到类似平台的解吸事件。这一点在高力条件下（高达500 pN或更高）检测拉伸事件时尤为关键。由于并非每条力-伸长曲线都能满足这种强物理吸附条件，因此此类事件的产率低于单纯的平台状解吸事件。作为替代方案，可采用如儿茶酚类强吸附基团，或聚合物与基底表面之间的化学吸附。然而，这需要在聚合物上引入额外的功能基团或偶联位点61,62。

事实上，聚合物的质量（即轮廓长度）可提供一个有价值的指纹特征。尽管由于以下原因，质量无法直接转化为所测得的轮廓长度，但长度分布对于界定单分子事件仍具有重要价值。对于低多分散性（Ɖ = 1.28）的 PNiPAM 聚合物，我们在实验中发现所获得的拉伸事件的延伸值（因而聚合物长度）存在显著差异。造成这一现象的一个可能原因是聚合物长度及其分布的测定方式。在尺寸排阻色谱（SEC）中，目标聚合物的相对分子量是相对于聚苯乙烯（PS）或聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）等标准品测定的63。由于目标聚合物与标准品的流体力学半径可能存在显著差异，因此所推定的相对分子量可能偏离其绝对分子量。此外，在功能化过程中，甲苯中微量水分可能导致硅烷层发生低聚反应。此类低聚物连接到原子力显微镜（AFM）探针尖端后，会形成更柔韧的层，且锚定位点更少64。同时，聚合物在硅层上的连接点未必位于探针顶端，这可能导致检测到的长度值发生偏移29。虽然蠕虫状链（WLC）或自由连接链（FJC）等聚合物模型无法在整个延伸范围内准确再现 PEG 或 PNiPAM 的力-伸长行为18,29,41,65,66，但这类聚合物模型可能对其他聚合物和蛋白质体系具有重要价值10,15,67,68。

只有当大量力-伸展曲线显示出足够长的恒定力平台时，才认为单个PS聚合物（轮廓长度超过1 µm）的共价连接成功（图5）。由单个聚合物解吸产生的平台表现为在某一伸展长度处，恒定力突然急剧下降至基线，如图5A所示。若多个聚合物连接到原子力显微镜（AFM）悬臂针尖，则会观察到一系列阶梯状的平台56（图5C）。平台长度（即解吸长度）与聚合物的轮廓长度相关51，其长度必须显著长于由于AFM悬臂针尖与基底表面非特异性粘附所导致的任何粘附峰（此处约为200 nm）。仅在单条力-伸展曲线中出现的特征不应被解释。在本研究展示的实验中，在表面两个不同位置的至少两个力图中，100条曲线中至少有80条显示出长度超过200 nm的平台。此外，通过如图5B和5D所示的散点图分析解吸长度的分布，可以揭示连接到AFM悬臂针尖上的聚合物数量及结合情况。对于PS而言，从力-伸展曲线平台中获得的解吸力和解吸长度分布较为集中，可作为共价连接成功的证据。这最终证实了功能化方案的成功。因此，我们强烈建议在发表文章中提供此类力和长度的分布数据。

使用内置算法（包含许多预设参数）分析力-伸展曲线时应谨慎。例如，固定的采样率并不适用于所有施加的拉伸速度，或者对力-伸展曲线进行自动平滑处理可能会平均掉重要的细节信息。通常情况下，充分理解相应的分析流程可以避免分析过程中的错误，而这些错误可能显著影响基于原子力显微镜的单分子力谱实验的最终结果。

综上所述，我们介绍了一种可靠且可轻松应用于多种聚合物的功能化方案。此外，本文还展示了对单分子力-伸展曲线的恰当分析方法，可用于确定拉伸力、解吸力和解吸长度等物理参数。所介绍的实验方案与操作步骤对于在单分子水平上研究刺激响应系统具有重要价值。

披露

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作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.N.B. 和 T.H. 感谢德国研究基金会（DFG, German Research Foundation）根据德国卓越战略计划提供的资助——项目编号 EXC-2193/1 – 390951807，以及德国联邦与各州卓越战略框架内的资助——项目编号 EXC-2193/1 – 390951807，同时感谢基金项目 HU 997/1-13（项目号 #420798410）。M.G. 感谢黑森州高等教育部、科研与艺术部在 LOEWE 项目 iNAPO 框架内提供的部分支持。我们感谢弗劳恩霍夫应用固体物理研究所（IAF）的 Wolfgang Bronner 博士和 Agne Zukauskaite 博士捐赠的高质量金镀膜硅片。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-十二硫醇（≥98%）Sigma-Aldrich, USA417364-500ML用于自组装单分子膜（SAM）
氨水溶液（30%）Roth, GermanyCP17.2用于清洗
Cypher ESAsylum Research, an Oxford Instruments company, USA-原子力显微镜（AFM）
乙醇（≥99.9%）Roth, GermanyPO76.1溶剂
镀金硅片Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany-用于自组装单分子膜（SAM）
高分辨率复制化合物Microset Products Ltd, UK101RF粘合剂
过氧化氢溶液Sigma-Aldrich, USAH1009用于清洗
Igor ProWavemetrics, USA-软件环境
Tetra-30-LF-PCDiener Electronic, Germany-等离子体腔体
马来酰亚胺-聚乙二醇-三乙氧基硅烷Creative PEG works, USAPHB-1923连接聚合物
MLCT-Bio-DCBruker, USAMLCT-Bio-DC原子力显微镜探针悬臂
Prime CZ-Si 硅片，n 型（磷掺杂），TTV < 10 µmMicroChemicals, GermanyWSA40600250 P1314SNN1硅片
Purelab Chorus 1，18.2 MΩ cmElga LabWater, Germany10034-540超纯水来源
R3 SAVomm GmbH, Germany5803 Blank镊子
巯基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)Gallei Group, Saarland University, Germany-PNiPAM 探针聚合物
巯基封端的聚苯乙烯Polymer Source, CanadaP40722-SSHPS 探针聚合物
巯基-聚乙二醇-巯基Creative PEGWorks, USAPSB-615PEG 探针聚合物
甲苯（99.99%）Fisher ChemicalsT324-500溶剂

参考文献

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  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Hugel, T., Seitz, M. The Study of Molecular Interactions by AFM Force Spectroscopy. Macromolecular Rapid Communications. 22 (13), 989-1016 (2001).
  3. Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1(2005).
  4. Balzer, B. N., Hugel, T. Single-Molecule Detection and Manipulation. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. Hashmi, S. , Elsevier. Amsterdam. (2016).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. -A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  7. Alsteens, D., et al. Nanomechanical mapping of first binding steps of a virus to animal cells. Nature Nanotechnology. 12 (2), 177-183 (2017).
  8. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468, 72-76 (2010).
  9. Shibata, M., et al. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy. Nature Communications. 8 (1), 1-9 (2017).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Oesterhelt, F., Oesterhelt, D., Pfeiffer, M., Engel, A., Gaub, H. E., Müller, D. J. Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), New York, N.Y. 143-146 (2000).
  12. Hugel, T., Holland, N. B., Cattani, A., Moroder, L., Seitz, M., Gaub, H. E. Single-molecule optomechanical cycle. Science. 296 (5570), New York, N.Y. 1103-1106 (2002).
  13. Yu, H., Siewny, M. G. W., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), New York, N.Y. 945-950 (2017).
  14. Erlich, K. R., Sedlak, S. M., Jobst, M. A., Milles, L. F., Gaub, H. E. DNA-free directed assembly in single-molecule cut-and-paste. Nanoscale. 11 (2), 407-411 (2019).
  15. Rico, F., Russek, A., González, L., Grubmüller, H., Scheuring, S. Heterogeneous and rate-dependent streptavidin-biotin unbinding revealed by high-speed force spectroscopy and atomistic simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6594-6601 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Kienle, S., Liese, S., Schwierz, N., Netz, R. R., Hugel, T. The effect of temperature on single-polypeptide adsorption. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13 (4), 982-989 (2012).
  18. Kolberg, A., et al. Opposing Temperature Dependence of the Stretching Response of Single PEG and PNiPAM Polymers. Journal of the American Chemical Society. 141 (29), 11603-11613 (2019).
  19. Balzer, B. N., et al. Cohesion Mechanisms of Polystyrene-Based Thin Polymer Films. Macromolecules. 46 (18), 7406-7414 (2013).
  20. Balzer, B. N., et al. Adhesion property profiles of supported thin polymer films. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (13), 6300-6306 (2013).
  21. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  22. Schwierz, N., Krysiak, S., Hugel, T., Zacharias, M. Mechanism of Reversible Peptide-Bilayer Attachment: Combined Simulation and Experimental Single-Molecule Study. Langmuir. 32 (3), 810-821 (2016).
  23. Balzer, B. N., et al. Nanoscale Friction Mechanisms at Solid-Liquid Interfaces. Angewandte Chemie International Edition. 52 (25), 6541-6544 (2013).
  24. Balzer, B. N., Kienle, S., Gallei, M., von Klitzing, R., Rehahn, M., Hugel, T. Stick-Slip Mechanisms at the Nanoscale. Soft Materials. 12, 106-114 (2014).
  25. Kühner, F., Erdmann, M., Sonnenberg, L., Serr, A., Morfill, J., Gaub, H. E. Friction of single polymers at surfaces. Langmuir. 22 (26), 11180-11186 (2006).
  26. Grebíková, L., Gojzewski, H., Kieviet, B. D., Klein Gunnewiek, M., Vancso, G. J. Pulling angle-dependent force microscopy. The Review of Scientific Instruments. 88 (3), 33705(2017).
  27. Geisler, M., et al. Hydrophobic and Hofmeister effects on the adhesion of spider silk proteins onto solid substrates: an AFM-based single-molecule study. Langmuir. 24 (4), 1350-1355 (2008).
  28. Pirzer, T., Hugel, T. Atomic force microscopy spring constant determination in viscous liquids. Review of Scientific Instruments. 80 (3), 35110(2009).
  29. Liese, S., et al. Hydration Effects Turn a Highly Stretched Polymer from an Entropic into an Energetic Spring. ACS Nano. 11 (1), 702-712 (2017).
  30. Cui, S., Pang, X., Zhang, S., Yu, Y., Ma, H., Zhang, X. Unexpected Temperature-Dependent Single Chain Mechanics of Poly(N-isopropyl-acrylamide) in Water. Langmuir. 28 (11), 5151-5157 (2012).
  31. Liang, X., Nakajima, K. Nanofishing of a Single Polymer Chain: Temperature-Induced Coil-Globule Transition of Poly(N -isopropylacrylamide) Chain in Water. Macromolecular Chemistry and Physics. 219 (3), 1700394(2018).
  32. Zhang, W., Zou, S., Wang, C., Zhang, X. Single Polymer Chain Elongation of Poly(N -isopropylacrylamide) and Poly(acrylamide) by Atomic Force Microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (44), 10258-10264 (2000).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques - 3rd Edition. , Academic Press. San Diego. (2013).
  34. Leitner, M., et al. Single-molecule AFM characterization of individual chemically tagged DNA tetrahedra. ACS Nano. 5 (9), 7048-7054 (2011).
  35. Walder, R., et al. Rapid Characterization of a Mechanically Labile α-Helical Protein Enabled by Efficient Site-Specific Bioconjugation. Journal of the American Chemical Society. 139 (29), 9867-9875 (2017).
  36. Tang, J., et al. High-affinity tags fused to s-layer proteins probed by atomic force microscopy. Langmuir. 24 (4), 1324-1329 (2008).
  37. Wildling, L., et al. Linking of sensor molecules with amino groups to amino-functionalized AFM tips. Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1239-1248 (2011).
  38. Maity, S., Viazovkina, E., Gall, A., Lyubchenko, Y. A. A Metal-free Click Chemistry Approach for the Assembly and Probing of Biomolecules. Journal of Nature and Science. 2 (4), 187(2016).
  39. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456(2015).
  40. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167(2018).
  41. Ott, W., et al. Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy. ACS Nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).
  42. Newton, R., et al. Combining confocal and atomic force microscopy to quantify single-virus binding to mammalian cell surfaces. Nature Protocols. 12 (11), 2275-2292 (2017).
  43. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical Biochemistry. 156 (1), 220-222 (1986).
  44. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
  45. Baird, J. A., Olayo-Valles, R., Rinaldi, C., Taylor, L. S. Effect of Molecular Weight, Temperature, and Additives on the Moisture Sorption Properties of Polyethylene Glycol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99 (1), 154-168 (2010).
  46. Halperin, A., Kröger, M., Winnik, F. M. Poly(N-isopropylacrylamide) Phase Diagrams: Fifty Years of Research. Angewandte Chemie International Edition. 54 (51), 15342-15367 (2015).
  47. Barradas, R. G., Fletcher, S., Porter, J. D. The hydrolysis of maleimide in alkaline solution. Canadian Journal of Chemistry. 54 (9), 1400-1404 (1976).
  48. Kharasch, N., Tarbell, D. S. Chapter 10 - The Mechanism of Oxidation of Thiols to Disulfides. Organic Sulfur Compounds. , 97-102 (1961).
  49. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1992).
  50. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868-1873 (1998).
  51. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  52. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H. E., Netz, R. R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 48301(2005).
  53. Marchand, P., Marmet, L. Binomial smoothing filter: A way to avoid some pitfalls of least-squares polynomial smoothing. Review of Scientific Instruments. 54 (8), 1034-1041 (1983).
  54. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  55. Friedsam, C., Gaub, H. E., Netz, R. R. Adsorption energies of single charged polymers. EPL (Europhysics Letters). 72 (5), 844-850 (2005).
  56. Scherer, A., Zhou, C., Michaelis, J., Brauchle, C., Zumbusch, A. Intermolecular Interactions of Polymer Molecules Determined by Single-Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 38 (23), 9821-9825 (2005).
  57. Abbott, L. J., Tucker, A. K., Stevens, M. J. Single Chain Structure of a Poly(N-isopropylacrylamide) Surfactant in Water. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (9), 3837-3845 (2015).
  58. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. Journal of Controlled Release. 11 (1), 255-265 (1990).
  59. Sulchek, T., Friddle, R. W., Noy, A. Strength of multiple parallel biological bonds. Biophysical journal. 90 (12), 4686-4691 (2006).
  60. Sulchek, T. A., et al. Dynamic force spectroscopy of parallel individual Mucin1-antibody bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16638-16643 (2005).
  61. Krysiak, S., Wei, Q., Rischka, K., Hartwig, A., Haag, R., Hugel, T. Adsorption mechanism and valency of catechol-functionalized hyperbranched polyglycerols. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 11, 828-836 (2015).
  62. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating receptor-ligand systems of the cellulosome with AFM-based single-molecule force spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950(2013).
  63. Trathnigg, B. Determination of MWD and chemical composition of polymers by chromatographic techniques. Progress in Polymer Science. 20 (4), 615-650 (1995).
  64. Blass, J., Albrecht, M., Wenz, G., Zang, Y. N., Bennewitz, R. Single-molecule force spectroscopy of fast reversible bonds. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (7), 5239-5245 (2017).
  65. Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene-glycol) in water. New Journal of Physics. 1, 1-11 (1999).
  66. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348(2014).
  67. Lyu, X., Song, Y., Feng, W., Zhang, W. Direct Observation of Single-Molecule Stick-Slip Motion in Polyamide Single Crystals. ACS Macro Letters. 7 (6), 762-766 (2018).
  68. Hugel, T., et al. Elasticity of Single Polyelectrolyte Chains and Their Desorption from Solid Supports Studied by AFM Based Single Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 34 (4), 1039-1047 (2001).

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