基于AFM的力光谱单分子共价附价

自20世纪80^年代发明以来，原子力显微镜（AFM）已成为自然科学中最重要的成像技术之一，具有亚纳米空间分辨率、亚皮牛顿力分辨率和在各种溶剂和温度条件下测量的可能性^{2、3、4、5、6、7。3,4,5,6,72}

除了成像^{88，9，AFM9}用于执行单分子力光谱（SMFS），深入了解单个聚合物和表面之间的粘合相互作用，单聚合物的物理特性和蛋白质^{77，10，11，12，13，14，15，1610,11,12,13,14,15,16}的展开机制。在常规的 SMFS 实验中，功能化悬臂尖端与表面接触，使 AFM 悬臂尖端的聚合物进入此表面。通过从表面收回 AFM 悬臂尖端，AFM 悬臂的偏转变化将转换为导致力延伸曲线⁴的力。拉伸力、脱脂力和脱脂长度等物理参数可确定为取决于不同参数，如拉力速度、表面停留时间、入表面入缩进深度、温度、溶剂^17、18以及固体基板、聚合物薄膜^17,或支撑脂质双层^{19、20、21、2220,21,22}等不同表面¹⁹。此外^,，聚合物可以探测不同的空间方向，从而研究聚合物^{23、24、25、26,24,25}的摩擦特性。²⁶

被调查的聚合物附价附着在AFM悬臂尖端对于此类研究至关重要。因此，单分子事件与一个和相同的聚合物绑定到AFM悬臂尖端的高产量，防止任何偏差的结果，由于校准的弹簧常数的AFM悬臂^27，28，不同的连接点²⁹或不同的聚合物（与不同的轮廓长度），如在纳米钓鱼实验^27,3030，31，32的情况下。^,31,32此外，与其他聚合物的相互作用以及平均效应可以广泛防止^{18，28。18,}对于聚合物附价到AFM悬臂尖端，可以应用不同类型的化学修饰，其中许多在赫曼森³³书中总结。基于胺和硫醇的链接反应以及咔嗒声化学代表了AFM悬臂尖端功能化34、35、36、37、38、39、40、41、42中最常用的方法。^{34,35,36,37,38,39,40,41,42}Becke等人⁴⁰展示了如何使用1-乙酰-3-（3-二甲基氨基丙基）卡博迪米德（EDC）/NHS化学将蛋白质附在AFM悬臂尖端。然而，上述功能组倾向于交叉链接，从而导致功能^43，44,44的丢失。此外，在溶液⁴³中，carbodiimids表现出快速水解的倾向。马利米德和三醇群通常更稳定，不表现出交联反应。提出的协议是参考文献^35、39,39中给出的先前发布的协议的优化。

在这里，提出了一个可靠的功能化协议，可以很容易地调整到大量的不同聚合物，无论轮廓长度或疏水性等特性。通过实例选择三种不同的聚合物:亲水聚乙烯乙二醇 （PEG） 和聚聚（N-异丙烯酰胺） （PNiPAM） 以及高摩尔质疏水聚苯乙烯 （PS）。为了提供具有适当链接分子的共价结合功能，选择这三种聚合物作为功能端组采用电传性二醇乳酸。链接分子本身通常是一种短的PEG聚合物，有两个活性位点，一端是硅烷组，另一端是雄性酰胺组。前者使AFM悬臂尖端的共价附价，后者与功能化高摩尔质量聚合物的thiol组结合反应。此外，非活性 PEG 链接器分子充当钝化层，以防止探头聚合物与 AFM 悬臂尖端之间以及 AFM 悬臂尖端和底层表面之间不必要的相互作用。

注:有关原理图概述，请参阅图 1。

1. 试剂设置

注:用于此协议的聚合物是:雄性-聚乙烯乙二醇-三氧西烷（硅烷-PEG-mal， 5 kDa），铁醇-聚乙烯乙二醇-硅醇（HS-PEG-SH，35 kDa），铁醇端端聚酰胺（N-异丙烯酰胺）（PNiPAM-SH，637 kDa）和铁醇端端聚苯乙烯（PS-SH，1.3 mDa）。

1. 准备定义良好和高摩尔质量PNiPAM-SH通过原子转移基聚合，然后转换和减少功能端组引入硫醇摩尔，如文献¹⁸所述。有关详细结构，请参阅图 1。
2. 对于化学品的储存，在带氮气的干手套箱系统中准备较小的等号，以避免暴露于大气中的氧气和水分。PEG和PNiPAM是吸湿^45，46,46和PEG，PNiPAM和PS的功能端组已知很容易氧化时，存储在环境条件33，47，48。^33,47,48所有化学品必须储存在-20°C。
3. 使用分析级溶剂或更高等级的溶剂。此外，使用超纯水冲洗 AFM 餐具片和玻璃器皿，因为单分子实验对所有污染非常敏感。

2. 设备设置

注:使用用不锈钢或玻璃制成的钳子和烧杯。使用倒钳进行安全夹持（例如，型号 R3 SA 具有低弹簧常数）。

1. 准备RCA（超纯水、过氧化氢和氨（5:1:1））溶液，以清洁玻璃器皿和钳子。
2. 将容器放入烧杯中，用 RCA 填充容器，直到玻璃器或钳子完全覆盖。
3. 在 80°C 下，从步骤 2.2 加热烧杯 1 小时。
4. 然后用超纯水冲洗容器，直到不再有刺激性气味（至少三次）。
5. 烤箱中的干玻璃器和钳子 （120 °C）。

3. 提示功能化

注:所有步骤都应在烟雾罩中执行，以避免吸入有机蒸汽。此外，还需要手套、实验室外套和眼部保护。每一步都使用硝酸盐或乳胶手套，以避免污染。使用甲苯时，请戴上耐溶剂手套。所有步骤（除非另有说明）均在 RT 处完成。每一步均使用新设备和手套以避免可能的交叉污染。

1. 通过将氧气等离子体应用于 AFM 悬臂芯片 MLCT-Bio-DC，执行表面激活。
   注:进一步功能化步骤的等离子体处理效率随血浆室中的氧气含量而扩展。
   1. 使用刚清洁的钳子将 AFM 悬臂芯片放入等离子室（40 kHz、600 W）。
   2. 使用定制修改的激活程序:疏散（0.1 mbar） – 将氧气淹没到 0.2 mbar（4 分钟）的压力 - 等离子过程（功率:40%，持续时间:2 分钟，过程压力:0.2 mbar）。
   3. 通风室并立即继续步骤 3.2.2，以防止空气中污染物吸附到 AFM 悬臂芯片。
2. 硅化与培化
   注: 计时是步骤之间的关键参数。在等待期间尽可能新鲜地准备解决方案。马利米德群在水介质中受到水解影响，在溶液^33、47,47中容易氧化为二硫化物，从而阻碍AFM尖端功能化反应。
   1. 在耐溶剂塑料或玻璃管中制备甲苯（1.25毫克/mL）中的硅烷-PEG-mal溶液，并将6 mL溶液倒入扁平的培养皿中，每个溶液3 mL。
      注:如果在 SMFS 实验中观察到多个探针聚合物的结合，则将硅烷-PEG-mal 与非功能性硅烷-PEG 混合可以减少锚点的数量。对于具有不同质量（即轮廓长度）的钝化层 PEG 的调整，可以使用²⁷。
   2. 在西兰-PEG-麦芽溶液中步骤3.1.3（每盘最多10片）在60°C³⁵下，立即孵育AFM悬臂芯片3小时。
   3. 将培养皿从烤箱中拿出来，让溶液冷却至少 10 分钟。
   4. 仔细冲洗每个 AFM 悬臂片。通过空气溶剂接口时，减少毛细管力对 AFM 悬臂的影响，例如，在浸入溶液时，稍微倾斜这些芯片。
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，用托鲁烯冲洗三次。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，用苯冲洗一次，用乙醇冲洗两次。
   5. 选择至少两个 AFM 悬臂芯片作为控制 AFM 悬臂芯片，跳过步骤 3.3 并按如下冲洗，以增加溶剂的极性:
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，用乙醇冲洗两次，用超纯水冲洗一次。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，用超纯水冲洗两次。
         注:控制 AFM 悬臂芯片已通过除聚合物附件（步骤 3.3）之外的所有功能化步骤。它们有助于证明功能化过程、AFM 悬臂芯片支架系统的清洁度、表面和用于 SMFS 实验的溶剂。
3. 共价聚合物附件
   注:尽管AFM悬臂尖端预计将完全覆盖于雄性酰胺组，但单探针聚合物只有几个结合位点，因为雄性在水中进行水解，导致不活跃的PEG^47。如上文所述，这些非活动 PEG 充当钝化层。
   1. 在 300m L 培养皿中以下聚合物溶液之一中，在步骤 3.2.5 后直接孵育 AFM 悬臂芯片。如果相应的聚合物未正确溶解，请使用 40°C 水浴并搅拌溶液。
      注:由于使用硫醇端端聚合物可能导致二硫化物键的形成，从而阻碍与硅烷-PEG-mal的雄酰胺组的反应，因此建议使用还原剂，特别是如果步骤3.3应用于水溶性聚合物的水缓冲液^33。
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，在 60 °C 下，在托露烯中使用 1.25 mg/mL 浓度 1 小时。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，在 RT 时使用乙醇中的浓度为 1.25 mg/mL 3 小时。
         注:如果在SMFS实验中观察到多探针聚合物的结合，应降低聚合物的浓度。
   2. 小心冲洗每个 AFM 悬臂片。
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，用托鲁烯冲洗两次，用乙醇冲洗两次，冷却 10 分钟后用超纯水冲洗一次。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，用乙醇冲洗两次，用超纯水冲洗两次。
   3. 将每个 AFM 悬臂芯片单独存放在一个小 （1 mL） 的培养皿中，在 4°C 下充满超纯水，直到在实验中使用。

4. 表面准备

1. 氧化硅晶圆
   注:此表面用于带 PEG 和 PNiPAM 的 SMFS。
   1. 使用金刚石刀将氧化硅晶圆切成小块。
   2. 将氧化硅片分别放入微离心管中，然后用乙醇填充这些管子。
   3. 将氧化硅碎片声波10分钟。
   4. 用乙醇冲洗氧化硅片两次，并在氮气流下小心干燥。立即使用氧化硅片。
2. 自组装的单层疏水烷烷醇在黄金 （SAM）
   注:此表面用于 SMFS 和 PS。有关 SAM 的更多信息，请参阅文献^39，49。
   1. 使用镀金硅片（A [100]、5 纳米钛、100 纳米金）执行步骤 4.1.1 = 4.1.4。
   2. 在 1 多德坎蒂奥尔溶液 （2 mM） 中孵育表面部分 18 小时。
   3. 用乙醇冲洗新鲜准备的SAM两次。
   4. 含氮流的干式SAM直接使用或储存在乙醇中长达4天，供以后使用。

5. 数据采集

注:此处显示的所有测量均采用超纯水进行，使用 Cypher ES AFM 使用加热和冷却样品阶段进行温度变化。通常，可以使用所有提供液体测量功能的 AFM。

1. 将功能化的 AFM 悬臂芯片插入 AFM。
2. 将制备的表面粘附到适合在液体中测量的样品支架（例如，高分辨率复制化合物 101RF 或 UV 固化粘合剂）。
   注:这些粘接剂高度惰性，耐大量极性溶剂。在使用前，应检查胶粘剂对非极性溶剂（例如托鲁烯或六烷）或高温的耐受性。
3. 将 AFM 悬臂芯片和探头样品浸入液体中，此处为超纯水。
   注:溶剂落:溶剂落点（约100 μL）可沉积在AFM悬臂芯片支架上。用溶剂覆盖 AFM 悬臂芯片可降低毛细管力，否则，当接近通过空气溶剂界面的样品表面时，毛细管会作用于 AFM 悬臂。
4. 如果需要，调整温度，让系统平衡。
   注:温度变化可能导致 AFM 悬臂偏转，因为 AFM 悬臂具有双金属效应，具有铝或金等反射涂层。在不再观察到偏转信号的进一步变化（MLCT-Bio-DC为15分钟）之前，应远离表面（几μm）进行平衡。
5. 随机改变温度，以排除功能老化的任何影响。确保应用的温度不会导致 AFM 悬臂不可逆地弯曲。
   注:任何温度对溶剂特性的影响（如蒸发或粘度变化）都可能妨碍您的实验。在上述示例中，温度变化范围高达 40 K，以 10 K 步骤作为溶剂（例如，从 278 K 到 318 K）。
6. 通过在坚硬表面（如氧化硅）上采用力延伸曲线，接近表面以确定 InvOLS（反向光学杠杆灵敏度）。为此，获取光探测器（V）与压电距离的偏转信号，并使用线性函数确定表示 AFM 悬臂尖端缩进基础表面（排斥机制）的零件的斜率。为了减少错误，取平均值至少五个值以获取最终的 InvOLS 值。有关详细信息，请参阅文献 4^4、39。
   注: InvOLS 只能在坚硬的表面上可靠地确定。在软表面或界面上进行实验时，请确保将硬曲面放置在靠近软表面的位置。然后，InvOLS 校准可以在软表面实验之前或之后完成，而无需拆卸 AFM 设置。
7. 对于弹簧恒定测定，将 AFM 悬臂移到 AFM 悬臂尖端和表面之间既无吸引力，也无排斥性相互作用的高度（几 μm）。然后，记录绘制功率频谱密度 （PSD） 与频率的热噪声频谱。以下步骤通常由商用 AFM 软件中的自动内置功能执行:首先，通过将函数与 PSD（例如简单的谐波振荡器 （SHO） 配合来分析获得的热噪声频谱。配合在第一次和第二次共振之间完成到最小值。其次，PSD 与频率图的拟合部分下的区域是确定表示 AFM 悬臂垂直方向的平均平方位移。最后，用于获得AFM悬臂力常数^{28、50。28,}
   注:应使用适当的频率范围，包括 AFM 悬臂的第一个谐振峰值。为了获得令人满意的信噪比，至少应累积10个PSD，其频率分辨率最高。
8. 开始实验。以网格状方式采用力延伸曲线（例如，面积为 20 x 20 μm²的 10 x 10 点）来记录力贴图，以避免任何局部表面影响（例如杂质、错位）和平均不同的表面面积。
   注:典型参数为 1 μm/s 的拉速度，采样率为 5 kHz，以确保分辨率充足。当拉取速度变化时，应调整采样率。缩回距离应适应测量聚合物的轮廓或脱解长度（约为预期长度的两倍）。
9. 使用并改变对表面的久坐时间，使单个聚合物粘附在表面（通常为 0 ~ 5 s）。
10. 重复实验结束时的 InvOLS 和弹簧常数的确定，以检查系统的一致性和稳定性。
    注:为了聚合物和表面之间的强附着力，可以在实际实验后进行校准，以保持功能化。

6. 数据评估

注: 对于数据评估，使用基于 Igor Pro 的自定义编写的软件执行以下步骤。

1. 通过使用录制的 InvOLS 和确定的弹簧常数乘法将原始偏转信号（以伏特为单位）转换为力值（以牛顿为单位）。
2. 从压电元素在垂直方向驱动的距离中减去 AFM 悬臂的偏转（在原始偏转信号与 InvOLS 乘法后），以获得真正的延伸（尖端表面距离）⁴。
3. 通过在上次事件后将线性函数拟合到基线并从力延伸曲线中减去相同的曲线，校正为漂移获得的力-延伸曲线。拟合部件应代表从表面的充分延伸，在表面，AFM悬臂尖端和基础表面之间既不观察到吸引力或排斥性相互作用。然后，基线设置为零轴。
   注:在高反射表面（如黄金）进行测量时，可能会出现干扰。这些结果来自表面和AFM悬臂背面的激光束的部分反射。因此，获得的力延伸曲线可能会沿垂直延伸显示正弦力信号伪影。这是阻碍最终力值的伪影。为了继续考虑这些力延伸曲线，可以进行修正（图2）。
4. 如果干扰出现在力延伸曲线中，请选择一个有代表性的力延伸曲线（回缩曲线），显示除非特定附着力和相同正弦伪影（即振幅和相位）（图2A）之外没有其他事件。
   注:平滑代表力延伸曲线，以获得干扰的低频模式。
5. 选择要校正的力延伸曲线（图 2B）。
6. 从步骤 6.4 叠加两个力延伸曲线。和6.5。以确保两者都显示相同的正弦伪影（即振幅和相位）（图2C）。
7. 从力-延伸曲线中减去（平滑）表示力延伸曲线，以校正该曲线，导致直线而不是正弦基线（图 2D）。
   注: 注意代表曲线的未特异性附着力峰与要校正的曲线中出现的任何单个分子事件不同。事实上，选择有代表性曲线对于正确校正至关重要。

以下示例显示了聚合物 PEG、PNiPAM 和 PS 的单分子拉伸和脱脱的结果。所有 AFM 悬臂提示均按照上述协议进行了功能化。PEG 和 PNiPAM 在 SiOx上测量，温度变化。有关 PEG 和 PNiPAM 由此产生的与温度相关的拉伸曲线的详细讨论，请参阅 Kolberg,等人18不同的力延伸图案是恒定力的高原（例如，当从水中的黄金4、27、39、5127中甲基端端烷醇 （SAM） 的自组装单4层脱氧器中解出 PS 时）。39,51

示例 1:水中 PEG 和 PNiPAM 的拉伸
水中与温度相关的拉伸行为是使用单 PNiPAM 和 PEG 聚合物在一端与 AFM 悬臂尖端并另一端的 SiOx表面物理床共价地测量的。校准和清洁控制实验（不到 2% 的力延伸曲线显示单个分子事件）后，为每个 AFM 悬臂至少记录了两个力图。通过在每个温度下记录至少一个力图来执行与温度相关的实验。当只出现少数拉伸事件时，相应的 AFM 悬臂被丢弃，并取取芯片的下一个 AFM 悬臂（通常按 MLCT-Bio-DC 的 C、B、D 和 E 顺序）。对于 PEG 的模范数据，在 500 个测量的力延伸曲线（19%）中，95 个拉伸事件被观察到。对于 PNiPAM，600 个力延伸曲线中 252 条显示拉伸模式 （42%）。为了更好地比较力延伸曲线，生成了每个温度的单一主曲线。为此，只选择拉伸事件至少为500 pN的曲线，其中构象波动和溶剂效应可以忽略不计。最后考虑的伸展次数是3在278K，7在298K和4在318K为PEG和4在278K，3在298K和3在318KPNiPAM18。

生成主曲线的过程如图3所示。所选的力延伸曲线（图 3A）被重新缩放为长度为 L0（以 500 pN 的力进行扩展），参见图 3B。附着力峰显示表面和AFM悬臂尖端之间未特异性粘附的很大变化，但不影响聚合物拉伸行为。合并重新缩放的力延伸曲线后，它们由图 3C所示的双标平滑求平均值。为此，高斯滤波器在等于平滑参数2053的水平上，将来自Pascal三角形的规范化系数的数据卷在一起。最后，如图3D中给出的每个温度，都获得了主曲线。放大显示温度对力扩展行为的影响最显著的范围。

PEG （A） 和 PNiPAM （B） 的温度行为的比较可以在图 4中找到。对于PEG，随着温度的升高，拉伸力的减少。当温度从278度提高到318K时，在100 pN时，在100 pN处重新缩放的扩展增加约5%。对于 PNiPAM，可以揭示一个相反的温度相关变化。当温度从278度升高到328K时，在100 pN处观察到100 pN下重新缩放的延伸量减少约1%。此外，通过确定曲线下的任何给定力值的面积，可以从力延伸主曲线中获得拉伸自由能。这可用于提取能量和各热带贡献的拉伸自由能量的帮助下，分子动力学（MD）模拟18。

示例 2:水中 SAM 表面的 PS 脱吸
PS从水中的SAM表面的解脱可用于确定脱盐力和长度，从而量化疏水性相互作用。校准后，在表面的两个不同点至少记录了两个力图。当聚合物附着成功时，力延伸曲线显示恒力的高原，作为特征特征，参见图5A和图5C。当探针键的动力学比 AFM 悬臂尖端（准平衡）的拉取速率快得多时，观察到高原状脱盐。高原式力延伸曲线的去附力通过集成力延伸轨迹54，直接提供附着力自由能量。它们用于测定液体环境中表面单聚合物的静电、分散和疏水性相互作用以及摩擦特性2,42、4、23、51、54、55。,23,51,54,55

恒定力的每个高原都装有一个sigmoidal曲线，以确定脱毛力和脱毛长度，然后绘制成方图。直方图装有高斯，以提取最大值和标准差。为了更好的概览，解吸力和长度值在散点图中一起显示，如图5B和图 5D所示。

对于水中SAM上的聚苯乙烯，确定的脱盐力对应于先前获得的值19、23,23。由于脱盐长度与聚合物轮廓长度51相关，因此脱盐长度分布可作为相关聚合物通过功能端部组与AFM悬臂尖端共价结合的证明。因此，脱盐长度用作指纹。

对于连接到 AFM 悬臂尖端的多个聚合物，可以在力延伸曲线56中观察到高原级联（离散步数）。每个高原代表聚合物在不同延伸处的解渗。图5C和图5D的实验显示了同时连接到AFM悬臂尖端的两种聚合物的典型案例。通过拟合最终破裂，可以发现脱模长度的双模态分布，而脱模力则显示出狭窄的分布。在这种情况下，较小的解波长度可以在90%的力延伸曲线中找到，无论是作为单个高原，还是作为较长高原上的附加高原，如图5C所示。在获得的力延伸曲线的37%中，发现较高的脱盐长度。因此，脱盐长度分布可用于确定连接到 AFM 悬臂尖端的不同聚合物的数量。一般来说，脱盐长度值的窄分布很好地表明，在获得的力延伸曲线中探测了一个聚合物和同一聚合物。同时，可以使用相应力延伸的叠加来确定是否测量了单个聚合物。

在证明单个PS聚合物的共价结合后，可以进行不同的基材（固体表面以及聚合物薄膜）、溶剂条件、温度、拉力速度或居住时间。

图 1:提示功能化过程的原理图概述。包括 AFM 悬臂尖端的化学改性（1） 血浆活化 （2） 硅化/PEGygy 和 （3） 聚合物附件。此外，还展示了所用聚合物的详细化学结构，即PEG、PNiPAM和PS。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 2:消除力延伸曲线中的干扰。（A） 查找一个力延伸曲线，显示沿延伸的正弦力信号伪影，但没有单个分子拉伸事件。（B） 选择具有单个分子事件的力延伸曲线，该曲线将从正弦伪影中校正。（C） 叠加曲线以控制曲线的正弦伪影是否真正匹配。（D） 通过从 （B） 中减去力延伸曲线 （A） 获得具有直线基线的力延伸曲线。尽管粘附峰不能用于进一步分析，但力延伸曲线现在针对伪影进行了校正，从而在单个分子事件区域获得更准确的力值（此处: > 0.2 μm 的扩展）。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 3:在 298 K 时从 PEG 的力延伸曲线确定主曲线。（A） 实验数据在 298 K，使用 7 力延伸曲线。在 500 pN（B）的力下重新缩放至长度 L0后，力延伸曲线可以通过双标平滑来合并并求平均值，从而获得主曲线（C）。重新缩放的曲线作为点给出，而主曲线显示为实线。最后，可以比较不同温度的所得主曲线（D）。放大表示温度对力扩展行为的影响最明显的范围。请点击此处查看此图形的较大版本。

图4:PNiPAM和PEG与温度相关的主曲线的比较。对于PEG，当温度升高（A）时，在100 pN（中力范围）处观察到重新缩放的扩展增加，而对于PNiPAM，则显示相反的温度相关偏移（B）。请点击此处查看此图形的较大版本。

图5:分析水中SAM上PS的力延伸曲线。（A） 具有高原（紫色）的西格莫达尔拟合的模范力延伸曲线（蓝色）。此外，箭头标记高原的确定力（红色）和长度（绿色）。sigmoidal 拟合获得的解吸力和脱毛长度值显示在散点图中，生成的直方图装有高斯。（B） 确定的平均脱盐力和脱盐长度值为 （112 × 6） pN 和 （659 × 7） nm，其中 93% 的力延伸曲线显示此类单高原事件。（C） 同时连接到 AFM 悬臂尖端的两种聚合物的模范力延伸曲线（蓝色）。在这里，脱毛力显示平均力值为 （117 × 5） pN 的单模态分布，而可找到双模态分布，用于解吸长度，从而平均长度值为 （656 × 9） nm 和 （1050 × 16） nm。（D） 90% 的采样力延伸曲线仅显示单个高原事件。请点击此处查看此图形的较大版本。

作者声明他们没有相互竞争的财务利益。