方法文章

将类似蛋白的蛋白质定向组装到定义的超分子结构和体外货物封装中

DOI：

10.3791/60935

⸱

2020年4月8日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biological Systems Analysis, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg, 3Freiburg Institute for Advanced Studies (FRIAS), University of Freiburg, 4BIOSS Centre for Biological Signalling Studies, University of Freiburg, 5IMTEK Department of Microsystems Engineering, University of Freiburg, 6Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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在有机溶剂和水性溶剂的界面上，定制的两栖乳素样蛋白质组装成复杂的超分子结构，如由环境参数触发的囊泡、纤维和焦质。所述装配协议产生具有可调特性的蛋白质膜型隔间 （PMBC），能够封装各种货物。

摘要

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定制蛋白质积木是超分子结构（如最小细胞、药物输送车辆和酶支架）组装的多功能候选物。由于其生物相容性和遗传性，弹性蛋白（ELP）是生物技术和生物医学应用的理想构建基块。然而，以蛋白质为基础的超分子结构的组装具有独特的物理化学特性和良好的封装潜力仍然具有挑战性。

在这里，我们提供两种高效的协议，引导两栖ELPs自组装成超分子蛋白结构，如球形角质、纤维和稳定囊泡。提交的装配协议基于具有适应性物理化学特性的ElP生成蛋白膜基隔间（PMBC）。PMBC 演示相分离行为并揭示方法依赖膜融合，并能够封装化学多样化的荧光货物分子。由此产生的PMBC作为药物配方和输送平台、人工细胞和分段反应空间具有很高的应用潜力。

引言

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用于生物技术应用的超分子结构的组装变得越来越重要。,2,3,4,5对于具有所需物理化学特性的功能性结构（如锥形、囊泡和纤维）的组装，了解和控制这些部件的物理化学和构象特性非常重要。由于在自然界中发现的分子的分子精度，超分子结构的构建基块越来越多地基于脂质、核酸或蛋白质。与合成聚合物相比，蛋白质积木能够精确控制基因水平上的新兴超分子结构6。单个蛋白质构建基块的主要氨基酸（aa）序列本质上编码了从分子到宏观水平的信息，以及最终超分子结构7的三维形状和物理特性。

报告用于组装不同超分子结构的方法通常涉及两栖蛋白，如温度敏感弹性蛋白（ELP）5,8,9， 重组烯烃10和人工蛋白质两栖动物11

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方案

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1. 两栖弹性蛋白（ELPs）的设计与克隆

  1. 克隆和设计构造，如其他地方描述的8，,20。质粒可应要求提供。

2. 蛋白质表达、纯化和制备

  1. F20E20-mEGFP 和 F20E20-mCherry 的表达式
    1. 接种主要表达文化，从一夜的战前文化到OD600的0.3。在37°C下孵育，在无菌400 mL LB介质中孵育200rpm，并在2升烧瓶中补充抗生素。
    2. 准备 IPTG 库存解决方案 （1 M），用于诱导超纯水中的表达培养。
    3. 当达到 OD600 0.5_0.8 时，将 IPTG 添加到表达培养到最终浓度 1 mM，并将孵育温度降低至 20°C。在 20°C 下允许表达，在 200 rpm 下进行大约 20 小时。
  2. 含有UAA pAzF的两栖ELP的表达
    1. 接种来自隔夜大肠杆菌预培养的主要表达培养，含有两个质粒pEVOL pAzF，例如pET28-NMBL-（TAG）R40F20-他的OD600的0.3（见氨基酸序列的补充信息）。在37°C下孵育，在无菌400 mL LB介质中孵育200 rpm，在2升烧瓶中补....

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结果

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囊泡生产协议开发
图 1概述了两种不同的囊泡制备方法。左侧的 THF 膨胀方法由连续三个步骤组成，并根据温度产生不同的超分子总成。在图1中，外荧显微镜图像显示由BDP-R20F20组装的囊泡和从BDP-R40F20组装的纤维结构。在右侧图示的BuOH方法专门导致ELP囊泡的形成，与THF膨胀方法相比，产生约两个数量级的囊泡。原理图图显示了 BuOH 囊泡的制备过程。对于图 1B BDP-R40F20 中的囊泡制备，与 10-15% （v/v） BuOH 混合，通过混合物的挤出制备囊泡。

引导超分子自组装到不同的结构
图 2显示了通过 THF 膨胀协议从 BDP-R40F20 组装的不同超分子结构的原理图和表位荧.......

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讨论

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在遵循所述协议以组装定义的超分子结构时出现故障，主要导致非特异性聚合体的形成（图2，IV），或导致均匀分布的ELP-两栖动物。协议的关键步骤如下:

对于两栖ELP的高表达率，相对低温20°C是最佳选择。为了成功纯亲性ELP进行亲和纯化，在溶质缓冲液中尿素浓度为4M，经验证可最好地溶解两栖ELP，提高可溶性洗脱分数中的蛋白质产量。如果需要在水解缓冲液中降低尿素浓度，则必须针对各个构造测试亲和力纯化。2 M 尿素也适用于某些结构，尤其是对于那些 His-tag 被融合到亲水领域，因此仍然能够结合树脂的构造。 通过尺寸排除色谱法在其标签纯化后，额外的纯化步骤也可以增加囊泡产量。

在应用 THF 膨胀协议的情况下，需要用荧光有机染料标记对两栖 ELP 进行可视化。重要的是，通过SPAAC对两栖ELP的BDP标签（参见含有UAA pAzF的氨基酸序列的补充资料）是所有净化缓冲液中不存在任何还原剂，如TCEP、DTT或β-汞酮乙醇。这是必要的，以避免在SPAAC反应

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披露

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作者声明没有相互竞争的财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢BMBF的财政支持和生物系统分析中心（ZBSA）提供的研究设施。我们感谢P.G.舒尔茨，TSRI，拉霍亚，加利福尼亚州，美国提供质粒pEVOL-pAzF。我们感谢弗赖堡大学生物系统分析中心（ZBSA）的生命成像中心（LIC）的工作人员帮助他们提供共聚焦显微镜资源，并在图像记录方面给予出色的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 和微;m 和 0.2 µm 消毒过滤器VWR
1,4-二硫苏糖醇默克
1-丁醇。>99.5% p.a.Roth
2log DNA 分子量标准NEB
2-巯基乙醇Roth
50 mL Falcon 管VWR
79249 炔烃 Mega Stokes 染料Sigma Aldrich
醋酸 冰川VWR
乙腈，无水，99.8%Sigma-Aldrich
氨苄青霉素钠盐，99%Roth
BDP-FL-PEG4-DBCOJena Bioscience
BiofugeHeraeus
瓶顶过滤器，带 PES 膜（45 µm， 22 & micro;m）Thermo Scientific
Brillant Blue G250 （Coomassie）Roth
BspQINEB
相机 DS Qi1尼康
离心机 5417rEppendorf
离心机 5810rEppendorf
CF-400-Cu 方网铜网格EMS
氯霉素Roth
CompactStar CS 4VWR
葡聚糖，德克萨斯红，3000 MW，中性Life Technologies
数字超声器Branson
二甲基亚砜 （DMSO）Applichem
Dnase IApplichem
EarINEB
EcoRI-HFNEB
环境摇床培养箱 ES-20Biosan
乙醇无水Roth
溴化乙锭溶液Roth
过滤器支持Avanti
玻璃板Bio-Rad
甘油蛋白质组学级Amresco
甘氨酸Applichem
H4-叠氮基-苯-OHBachhem
加热板 MR HeiTecHeidolph
HindIIINEB
HisTrap FF 粗柱GE 生命科学镍柱
盐酸盐酸发烟，37%，每年默克
照明器 ix 20INTAS
照明器 LAS-4000富士胶片
咪唑默克
显微镜浸油默克
培养箱 摇床 Unimax 1010Heidolph
Inkubator 1000Heidolph
IPTG，>99%Roth
卡那霉素硫酸盐Roth
L（+）-阿拉伯糖Roth
实验室秤扩展 ed2202s/224s-OCE赛多利斯
LB-培养基Roth
冻干剂 Alpha 2-4 LSC基督
溶菌酶，20000 U/mgRoth
显微镜 CM 100飞利浦
显微镜 Eclipse TS 100尼康
显微镜 盖玻片 （15 x 15 mm）VWR
显微镜载玻片VWR
MicrowaveStudio
迷你挤出机套装Avanti 极性脂质
氯化钠，>99.5%，年利率Roth
Natriumhydroxid 沉淀Roth
Ni-NTA 琼脂糖，PerfectPro5 Prime
核孔径迹蚀刻膜Avanti
PH 计 766 杯形Knick
苯甲基磺酰氟化物 （PMSF）Roth
聚丙烯色谱柱 （1 mL）Qiagen
PowerPac 碱性BioRad
丙醇-2-olEmplura
蛋白质分子量标准 10-250 kDaNEB
循环冷却器 F12Julabo
加固环Herma
SacI HFNEB
SDS 颗粒Roth
磷酸钠二氢二水合物，NaH2PO4VWR
无菌针式过滤器 0.2 mm 醋酸纤维素VWR
T4 DNA 连接酶NEB
TEMEDRoth
TexasRed 葡聚糖偶联物MolecularProbes
Thermomix comfortEppendorf
THF， >99.5% p.a.来自 Casein Roth 的 Acros
Triton X 100Roth
Trypton/Pepton
超声波清洗机VWR
Urea p.a.Roth
真空泵 2.5真空
XbaINEB
XhoINEB
ZelluTrans 再生纤维素管状膜 （12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V）Roth

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
  2. Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Reco....

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Protein AssemblyVesicle FormationFiber FormationCoacervate FormationProtein PurificationFluorescent Cargo EncapsulationDialysis MethodExtrusion TechniqueConfocal Microscopy

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