在有机相与水相溶剂的界面处，经设计的两亲性弹性蛋白样蛋白会响应环境参数，自组装形成囊泡、纤维和凝聚体等复杂的超分子结构。所述组装方案可制备具有可调控特性的蛋白膜基区室（PMBCs），实现多种货物分子的包封。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
弹性蛋白样蛋白的定向组装形成特定超分子结构及体外货物包封
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
定制的蛋白质结构单元是组装超分子结构（如最小细胞、药物递送载体和酶支架）的多功能候选材料。由于弹性蛋白样蛋白（Elastin-like proteins, ELP）具有良好的生物相容性以及可在遗传水平上进行调控的特性，因此是生物技术和生物医学应用的理想构建单元。然而，组装具有明确理化性质和良好包封能力的蛋白质基超分子结构仍然具有挑战性。
本文提供了两种高效的引导式自组装方案，可将两亲性弹性蛋白样多肽（ELP）组装成超分子蛋白质结构，例如球形共聚物、纤维和稳定的囊泡。所介绍的组装方案可生成基于ELP的蛋白质膜包封结构（PMBCs），其具有可调节的理化特性。PMBCs表现出相分离行为，并展现出依赖于方法的膜融合特性，能够包载化学性质多样的荧光分子。所获得的PMBCs在药物制剂与递送平台、人工细胞以及区室化反应空间等方面具有广阔的应用前景。
引言
用于生物技术应用的超分子结构组装正变得越来越重要1,2,3,4,5。为了组装具有理想理化性质的功能性结构（如凝聚体、囊泡和纤维），理解并控制组分的理化性质和构象特性至关重要。由于天然分子具有分子级别的精确性，超分子结构的构建单元正越来越多地基于脂质、核酸或蛋白质。与合成聚合物相比，蛋白质类构建单元能够在遗传水平上精确调控所形成的超分子结构6。单个蛋白质构建单元的一级氨基酸（aa）序列本身就编码了从分子水平到宏观水平的自组装潜力，以及最终超分子结构的三维形态和物理特性7。
已有报道的多种超分子结构组装方法通常涉及两亲性蛋白质，例如温度敏感型弹性蛋白样蛋白（ELP）5,8,9、重组油质蛋白（oleosin）10以及人工设计的蛋白两亲....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 两亲性弹性蛋白样蛋白（ELPs）的设计与克隆
- 克隆并设计载体，具体方法参见其他文献8,20。质粒可应要求提供。
2. 蛋白质表达、纯化与制备
- F20E20-mEGFP 和 F20E20-mCherry 的表达
- 从过夜预培养物中接种主表达培养物至 OD600 37 °C、200 rpm 条件下，在含有适当抗生素的无菌400 mL LB培养基中于2 L摇瓶中培养。
- 在超纯水中配制IPTG储存液（1 M），用于诱导表达培养物。
- 当OD600 当OD值达到0.5–0.8时，向表达培养物中加入IPTG至终浓度1 mM，并将培养温度降至20 °C。在200 rpm条件下于20 °C继续诱导表达约20 h。
- 表达含非天然氨基酸 pAzF 的两亲性 ELP
- 从过夜培养物中接种主表达培养液 E. coli 含有两个质粒 pEVOL pAzF 和例如 pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his 的预培养物 至 OD600 0.3（氨基酸序列见补充信息）。在2 L锥形瓶中，加....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
囊泡制备方案的开发
图1概述了两种不同的囊泡制备方法。左侧的四氢呋喃（THF）溶胀法包含三个连续步骤，根据温度的不同可形成不同类型的ELP超分子组装体。在图1A中，落射荧光显微镜图像显示了由BDP-R20F20组装形成的囊泡以及由BDP-R40F20组装形成的纤维状结构。右侧所示的正丁醇（BuOH）法则仅导致ELP囊泡的形成，其囊泡产量比THF溶胀法高出约两个数量级。示意图展示了BuOH囊泡的制备过程。在图1B的囊泡制备中，将BDP-R40F20与10–15%（v/v）BuOH混合，并通过挤出该混合物来制备囊泡。
引导超分子自组装形成不同结构
图2展示了通过THF溶胀法由BDP-R40F20组装而成的不同超.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
遵循所述方案时出现故障 特定超分子结构的组装主要导致非特异性聚集体的形成（图2，IV）或均匀分布的ELP-两亲性分子。本方案的关键步骤将在下文讨论：
为了获得较高的两亲性ELP表达量，20°C的相对较低温度最为适宜。为成功进行基于亲和力的两亲性ELP纯化，在裂解缓冲液中使用4 M尿素浓度被证明最有利于溶解两亲性ELP，并提高可溶性洗脱组分中的蛋白产量。如果希望使用较低尿素浓度的裂解缓冲液，则必须针对各个构建体测试其亲和纯化效果。对于某些构建体，2 M尿素同样有效，特别是当His标签连接在亲水结构域时，仍能与树脂结合。 在His标签亲和纯化之后，再通过尺寸排阻色谱进行额外的纯化步骤，也可提高囊泡产量。
若采用THF溶胀法，需用荧光有机染料对两亲性ELP进行标记以便观察。在通过SPAAC反应对两亲性ELP进行BDP标记时（氨基酸序列含非天然氨基酸pAzF，请参见补充信息），所有纯化缓冲液中均不得含有任何还原剂，如TCEP、DTT或β-巯基乙醇。这是为了.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
作者感谢德国联邦教育与研究部（BMBF）提供的资金支持，以及弗莱堡阿尔伯特-路德维希大学生物系统分析中心（ZBSA）提供的研究设施。我们感谢美国加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所（TSRI）的 P. G. Schultz 提供质粒 pEVOL-pAzF。我们还感谢弗莱堡阿尔伯特-路德维希大学生物系统分析中心（ZBSA）生命成像中心（LIC）的工作人员在共聚焦显微镜资源使用方面提供的帮助，以及在图像采集过程中给予的出色技术支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 µm 和 0.2 µm 滤菌滤膜 | VWR | ||
| 1,4-二硫苏糖醇 | Merck | ||
| 1-丁醇，>99.5% 分析纯 | Roth | ||
| 2log DNA 标准分子量标记 | NEB | ||
| 2-巯基乙醇 | Roth | ||
| 50 mL Falcon 离心管 | VWR | ||
| 79249 炔烃 Mega Stokes 染料 | Sigma Aldrich | ||
| 冰乙酸 | VWR | ||
| 乙腈，无水，99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| 氨苄青霉素钠盐，99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge 离心机 | Heraeus | ||
| 带 PES 膜的瓶顶滤器（45 µm，22 µm） | Thermo Scientific | ||
| 亮蓝 G250（考马斯亮蓝） | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| DS Qi1 相机 | Nikon | ||
| 5417r 离心机 | Eppendorf | ||
| 5810r 离心机 | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu 方形铜网铜载栅 | EMS | ||
| 氯霉素 | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| 葡聚糖-德克萨斯红，3000 MW，中性 | Life Technologies | ||
| 数字超声破碎仪 | Branson | ||
| 二甲基亚砜（DMSO） | Applichem | ||
| DNase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| 环境振荡培养箱 ES-20 | Biosan | ||
| 无水乙醇 | Roth | ||
| 溴化乙锭溶液 | Roth | ||
| 滤膜支撑板 | Avanti | ||
| 玻璃板 | Bio-Rad | ||
| 甘油，蛋白质组学级 | Amresco | ||
| 甘氨酸 | Applichem | ||
| H4-叠氮苯丙氨酸-OH | Bachem | ||
| MR HeiTec 加热板 | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF 粗提柱 | GE Life Sciences | 镍柱 | |
| 盐酸，发烟，37%，分析纯 | Merck | ||
| ix 20 照明器 | INTAS | ||
| LAS-4000 照明器 | Fujifilm | ||
| 咪唑 | Merck | ||
| 显微镜用浸油 | Merck | ||
| Unimax 1010 摇床培养箱 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG，>99% | Roth | ||
| 卡那霉素硫酸盐 | Roth | ||
| L(+)-阿拉伯糖 | Roth | ||
| 实验室天平 Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB 培养基 | Roth | ||
| 冷冻干燥仪 Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| 溶菌酶，20000 U/mg | Roth | ||
| CM 100 透射电子显微镜 | Philips | ||
| Eclipse TS 100 倒置显微镜 | Nikon | ||
| 显微镜盖玻片（15 x 15 mm） | VWR | ||
| 显微镜载玻片 | VWR | ||
| 微波炉 | Studio | ||
| Mini-Extruder 挤出装置 | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl，>99.5%，分析纯 | Roth | ||
| 氢氧化钠颗粒 | Roth | ||
| Ni-NTA 琼脂糖，PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore 径迹蚀刻膜 | Avanti | ||
| PH 计 766 calimatic | Knick | ||
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Roth | ||
| 聚丙烯柱（1 mL） | Qiagen | ||
| PowerPac basic 电泳仪 | BioRad | ||
| 异丙醇 | Emplura | ||
| 蛋白质标准分子量标记 10-250 kDa | NEB | ||
| 循环冷却器 F12 | Julabo | ||
| 加强环 | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS 片剂 | Roth | ||
| 磷酸二氢钠二水合物，NaH2PO4 | VWR | ||
| 0.2 mm 醋酸纤维素无菌注射式滤器 | VWR | ||
| T4 DNA 连接酶 | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| 德克萨斯红-葡聚糖偶联物 | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort 恒温混匀仪 | Eppendorf | ||
| 四氢呋喃，>99.5% 分析纯 | Acros | ||
| Triton X-100 | Roth | ||
| 酪蛋白胨/蛋白胨 | Roth | ||
| 超声清洗机 | VWR | ||
| 尿素，分析纯 | Roth | ||
| 真空泵 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans 再生纤维素管状透析膜（12.0 S / 3.5 S / 1.0 V） | Roth |
参考文献
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Reco....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
