将类似蛋白的蛋白质定向组装到定义的超分子结构和体外货物封装中

摘要

在有机溶剂和水性溶剂的界面上，定制的两栖乳素样蛋白质组装成复杂的超分子结构，如由环境参数触发的囊泡、纤维和焦质。所述装配协议产生具有可调特性的蛋白质膜型隔间 （PMBC），能够封装各种货物。

摘要

定制蛋白质积木是超分子结构（如最小细胞、药物输送车辆和酶支架）组装的多功能候选物。由于其生物相容性和遗传性，弹性蛋白（ELP）是生物技术和生物医学应用的理想构建基块。然而，以蛋白质为基础的超分子结构的组装具有独特的物理化学特性和良好的封装潜力仍然具有挑战性。

在这里，我们提供两种高效的协议，引导两栖ELPs自组装成超分子蛋白结构，如球形角质、纤维和稳定囊泡。提交的装配协议基于具有适应性物理化学特性的ElP生成蛋白膜基隔间（PMBC）。PMBC 演示相分离行为并揭示方法依赖膜融合，并能够封装化学多样化的荧光货物分子。由此产生的PMBC作为药物配方和输送平台、人工细胞和分段反应空间具有很高的应用潜力。

引言

用于生物技术应用的超分子结构的组装变得越来越重要^。,2,3,4,5对于具有所需物理化学特性的功能性结构（如锥形、囊泡和纤维）的组装，了解和控制这些部件的物理化学和构象特性非常重要。由于在自然界中发现的分子的分子精度，超分子结构的构建基块越来越多地基于脂质、核酸或蛋白质。与合成聚合物相比，蛋白质积木能够精确控制基因水平上的新兴超分子结构^6。单个蛋白质构建基块的主要氨基酸（aa）序列本质上编码了从分子到宏观水平的信息，以及最终超分子结构⁷的三维形状和物理特性。

报告用于组装不同超分子结构的方法通常涉及两栖蛋白，如温度敏感弹性蛋白（ELP）^5,8,9， 重组烯烃¹⁰和人工蛋白质两栖动物¹¹.温度触发方法导致云母的组装^4,10,12纤维¹³床单¹⁴和囊泡^9,15,16.有机溶剂在形成基于动态蛋白的囊泡方面应用了方法^8,11,14.到目前为止，用于囊泡形成的应用协议通常缺乏对微米大小的装配体的装配控制^16,17或装配产量有限⁵.此外，一些报告的基于ELP的囊泡有削弱封装电位¹²或久而久之的稳定性有限⁹.针对这些缺点，所提出的协议使微数和亚微米大小的超分子结构能够自我组装，具有明显的物理化学特性、良好的封装电位和长期稳定。定制的两栖ELP组装成超分子结构，范围从球形锥形和高度有序的扭曲纤维束到单层囊泡，具体取决于应用的协议和相关环境条件。大型孔径蛋白膜基隔间（PMBC）揭示了所有主要表型，如膜融合和相分离行为，类似于脂质体。PMBC 可有效封装化学多样化的荧光货运分子，这些分子可以使用简单的异位荧光显微镜进行监测。本研究中使用的重复ELP域是蛋白质超分子结构的有吸引力的构建基块¹⁸.ELP 五角苷酸重复单元 （VPGVG） 已知可以耐受除第四位置的 proline（瓦林、V）之外的不同 aa，同时保持其结构和功能特性¹⁹.含有独特亲水性和疏水域的两栖ELP的设计通过在VPGXG重复中插入具有明显疏水性、极性和电荷的aaguest残留物（X）来实现²⁰.两栖ELP域，其中配备了疏水性苯丙氨酸 （F） 或异硫氨酸 （I），而亲水域含有带电谷氨酸 （E） 或精氨酸 （R） 作为客人残留物。可在补充信息和参考中找到符合条件的两栖ELP构造和相应的 aa 序列列表^8,21.所有构建基块，其中配备了小荧光染料或荧光蛋白，通过荧光显微镜进行可视化。mEGFP和其他荧光蛋白是N终端融合到ELP两栖爱好者的亲水域。有机染料通过无铜菌株结合，促进烷基苯-azide环增剂（SPAAC）与共同翻译引入的不天然氨基酸（UAA）。UAA的共同翻译合并para-阿齐多芬丙氨酸 （pAzF）²²允许对亲水ELP域进行N端修改。通过这种方式，绿色荧光染料BDP-FL-PEG₄-DBCO （BDP） 或任何具有紧绷环状素的小荧光分子可用作荧光探针。成功加入UAA pAzF并通过SPAAC对染料进行环化，可通过LC-MS/MS轻松确认，因为相应的试性肽具有有效的电化⁸.由于荧光蛋白与大多数有机溶剂不相容，因此应用这种小型有机染料拓宽了装配协议的溶剂选择范围。下面介绍了我们实验室开发的两种最有效的超分子结构装配协议。THF 膨胀方法仅与有机染料改性两栖 ELP 兼容。相反，1-丁醇（BuOH）挤出方法与许多蛋白质兼容，如mEGFP，因为所述方法完全保存了这些融合蛋白的荧光。此外，使用 BuOH 挤出方法，小分子的封装和车辆融合行为效果最佳。

方案

1. 两栖弹性蛋白（ELPs）的设计与克隆

1. 克隆和设计构造，如其他地方描述的^8，,20。质粒可应要求提供。

2. 蛋白质表达、纯化和制备

1. F20E20-mEGFP 和 F20E20-mCherry 的表达式
   1. 接种主要表达文化，从一夜的战前文化到OD₆₀₀的0.3。在37°C下孵育，在无菌400 mL LB介质中孵育200rpm，并在2升烧瓶中补充抗生素。
   2. 准备 IPTG 库存解决方案 （1 M），用于诱导超纯水中的表达培养。
   3. 当达到 OD₆₀₀ 0.5_0.8 时，将 IPTG 添加到表达培养到最终浓度 1 mM，并将孵育温度降低至 20°C。在 20°C 下允许表达，在 200 rpm 下进行大约 20 小时。
2. 含有UAA pAzF的两栖ELP的表达
   1. 接种来自隔夜大肠杆菌预培养的主要表达培养，含有两个质粒pEVOL pAzF，例如pET28-NMBL-（TAG）R40F20-他的_OD600的0.3（见氨基酸序列的补充信息）。在37°C下孵育，在无菌400 mL LB介质中孵育200 rpm，在2升烧瓶中补充卡那霉素和氯霉素。
   2. 在超纯水中制备 100 mM pAzF 库存解决方案。对于 10 mL 的 pAzF 库存溶液，重量为 206.2 mg pAzF，并在 8 mL 超纯水中重新悬浮。要溶解 pAzF，用 3 M NaOH 提高溶液的 pHH，并大力混合。当 pAzF 溶解时，小心地将 pH 降至 10.5，并将超纯水添加到最终体积为 10 mL。使用无菌过滤器 （0.22 μm） 和 2 mL 反应管中的溶液等值。
   3. 在超纯水中制备 1 M IPTG 库存解决方案，在超纯水中制备 20% 的阿拉伯糖库存解决方案。
   4. 当达到 OD₆₀₀ 0.5_0.8 时，将 pAzF 添加到表达式区域性到最终浓度为 2 mM。孵育培养10分钟，37°C，200 rpm，允许pAzF上升。
   5. 通过同时添加 IPTG （1 mM） 和阿拉伯糖 （2%） 诱导靶蛋白的表达和必要的 tRNA/t-RNA 合成酶的表达并将孵化温度降至20°C。
   6. 在 20°C 下允许表达，在 200 rpm 下进行大约 20 小时。在4°C、4000 x g、40分钟时通过g离心采集表达培养。
3. 细胞水清和蛋白质纯化
   1. 在裂酶缓冲液中重新悬浮大肠杆菌颗粒（每升培养物10毫升;50 mM Tris-HCl pH 8、500 mM NaCl、4 M尿素、0.25%Triton X-100），含有裂酶（0.1毫克/毫升）和PMSF（0.1mM）。在冰上孵育30分钟，然后将样品浸入液氮中，冷冻和解冻两次。
   2. 声波悬浮液（30%，15次，30秒:10秒断），并通过离心（4°C，10，000 x g，40 分钟）清除液化 g。
   3. 使用亲和色谱来纯化蛋白质（例如，使用连接到分数收集器的FPLC系统在1 mL镍柱上;参见材料表）。用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，4 M尿素，250~500 mm imidazole）将蛋白质与洗脱液缓冲液（50 mM Tris-HCl）一起，储存在4°C，直到进一步加工。
   4. 通过 SDS-PAGE 分析净化效率。

3. 通过SPAAC对ElPs进行染料改性

1. 粗略估计 ELP 溶液的浓度。 ₂₈₀浓度评估的吸收没有价值，因为pAzF-R40F20序列缺乏紫外线范围内吸收的氨基酸。因此，以前嗜血和加权的ELP两栖动物可以作为SDS PAGE波段比较的参考。通过比较来自ELP溶液的SDS PAGE波段的灰值浓度与已知浓度和样品的粗略浓度可以估计您的样品的粗糙浓度。
2. 将1 μL的荧光染料BDP-FL-PEG4-DBCO（10 mM库存溶液;20μM最终浓度）加入到500μL的ELP溶液（+20μM）。在15°C下孵育反应约10小时，同时摇动并保护光线。
3. 为进一步使用，可分二化反应以去除过多的 BDP。
   1. 将透析膜（例如12 kDa切断）在超纯水中平分10分钟。将透析膜切成正确的尺寸，置于含有点击ELP溶液的反应管开口的顶部。要将透析膜固定在开口处，在开口上放置一个带打孔芯的反应管盖，从而关闭管。
   2. 将反应管倒置在所选缓冲器中。每次透析后，将缓冲液（2~5 L）更换两次，每次至少3小时。清除透析膜和缓冲液之间的任何气泡，以确保透析成功。

4. THF 膨胀协议

1. 用稳定的pH 7.5对磷酸盐或三聚物缓冲液（10 mM）进行硅质的ELP溶液，以去除其标签纯化中的盐和剩余化合物。
2. 准备冻干剂，冷却至开始温度，进行冷冻干燥。
3. 在1.5 mL反应管（每管50~500μL）和液氮中的冲击冻结中，对分蛋白溶液进行分清蛋白溶液。为了避免在冷冻干燥过程中意外混合不同的蛋白质溶液，可以在反应管顶部放置带有小孔的盖子，以将其部分密封。
4. 从液氮中抽取冷冻蛋白样品，并立即将其放入冻干剂中，开始冷冻干燥。当样品完全干燥（约 24~48 h）时，冷冻干燥完成。随后，用干燥的N₂呼吸冻血性嗜血性ELP，然后立即关闭反应管盖，以避免与空气湿气接触。
5. 将纯THF添加到冻干样品（ELP，5~10 μM），并将溶液放入含有冰水的水浴声波器中15分钟，以允许THF中ELP膨胀。
6. 将热循环器预热至 30~60°C，用于囊泡形成或高达 90°C 的纤维形成，并准备含有超纯水或缓冲液的新反应管（50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO_4、50mM NaCl、pH 5-13）。球形锥形在 pH 9–13 内主要在 20°C 下组装。在pH 7和9之间的50~60°C下，囊泡形成受到青睐。纤维形成在pH5和12之间预先诱导超过60°C。
7. 在声波步骤后，将 ELP/THF 溶液以及准备好的超纯水或缓冲液放入热循环器中加热至所需温度 5 分钟。当温度达到时，预热的ELP/THF溶液应在预热的超纯水或缓冲液之上小心分层。应看到具有不同接口的两个阶段的明确分离。
8. 再次将混合物放入热循环器中，孵育20分钟，以便在界面处形成囊泡或纤维。之后，让样品冷却到室温10分钟，然后通过荧光显微镜或透析进行分析。
9. 含有超纯水或缓冲液超分子结构的硅藻溶液（50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO_4、50mM NaCl、pH 7-10）。

5. BuOH 挤出协议

1. 在超纯水或缓冲液中制备 1×50 μM ELP 溶液（50 mM PB pH 7.5，100 mM NaCl，可能含有高达 4 M 尿素）。两栖ELP F20R20-mEGFP和F20R20-mCherry溶液的浓度可以使用摩尔消光系数（F20R20-mEGFP A₂₈₀ = 22015^M-1 cm^-1和 F20R20-mCherry A₂₈₀ = 34380 M^-1 cm^-1）来确定（参见a序列的补充信息）。
2. 加入10%~20%（v/v）1-丁醇，通过上下移液或多次通过注射器绘制溶液，立即混合溶液。可使用带有 0.25 x 25 mm 针的常用 100 μL 移液器或汉密尔顿注射器。混合过程中溶液的浊度应增加，表明囊泡形成。1-辛烷醇 5%~15%（v/v） 也可用于囊泡挤出，而不是 1-丁醇。
3. 为了实现窄尺寸分布，在室温下，使用微型挤出机通过孔径为1 μm的膜进行挤出囊泡。用于挤出的膜尺寸决定了囊泡的上尺寸切口。
4. 如上所述（步骤3.3）对囊泡进行透析，以去除残留的1丁醇。

6. 使用 BuOH 挤出协议进行染料封装

1. 将大约 40 μL ELP 溶液混合在 10 mM Tris-HCl 中，pH 8 与 1 μL Dextran 德州红（0.0025 mg/mL 最终浓度）混合。
2. 在溶液中加入 10 μL 的 BuOH，并通过配备 0.25 x 25 mm 针头的注射器挤出 5~10 次。

7. 利用荧光显微镜分析超分子结构

1. 在玻璃滑轨上放置一个增强环，并将粘合侧牢固地压到玻璃上。
2. 将样品的 5 μL 添加到增强环内部，并在顶部放置盖板。
3. 用指甲油密封样品盖玻片边缘，避免样品在分析过程中蒸发。
4. 进行荧光显微镜，如前所述^8。

结果

囊泡生产协议开发
图 1概述了两种不同的囊泡制备方法。左侧的 THF 膨胀方法由连续三个步骤组成，并根据温度产生不同的超分子总成。在图1中，外荧显微镜图像显示由BDP-R20F20组装的囊泡和从BDP-R40F20组装的纤维结构。在右侧图示的BuOH方法专门导致ELP囊泡的形成，与THF膨胀方法相比，产生约两个数量级的囊泡。原理图图显示了 BuOH 囊泡的制备过程。对于图 1B BDP-R40F20 中的囊泡制备，与 10-15% （v/v） BuOH 混合，通过混合物的挤出制备囊泡。

引导超分子自组装到不同的结构
图 2显示了通过 THF 膨胀协议从 BDP-R40F20 组装的不同超分子结构的原理图和表位荧...

讨论

在遵循所述协议以组装定义的超分子结构时出现故障，主要导致非特异性聚合体的形成（图2，IV），或导致均匀分布的ELP-两栖动物。协议的关键步骤如下:

对于两栖ELP的高表达率，相对低温20°C是最佳选择。为了成功纯亲性ELP进行亲和纯化，在溶质缓冲液中尿素浓度为4M，经验证可最好地溶解两栖ELP，提高可溶性洗脱分数中的蛋白质产量。如果需要在水解缓冲液中降低尿素浓度，则必须针对各个构造测试亲和力纯化。2 M 尿素也适用于某些结构，尤其是对于那些 His-tag 被融合到亲水领域，因此仍然能够结合树脂的构造。 通过尺寸排除色谱法在其标签纯化后，额外的纯化步骤也可以增加囊泡产量。

在应用 THF 膨胀协议的情况下，需要用荧光有机染料标记对两栖 ELP 进行可视化。重要的是，通过SPAAC对两栖ELP的BDP标签（参见含有UAA pAzF的氨基酸序列的补充资料）是所有净化缓冲液中不存在任何还原剂，如TCEP、DTT或β-汞酮乙醇。这是必要的，以避免在SPAAC反应

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 和微;m 和 0.2 µm 消毒过滤器	VWR
1,4-二硫苏糖醇	默克
1-丁醇。>99.5% p.a.	Roth
2log DNA 分子量标准	NEB
2-巯基乙醇	Roth
50 mL Falcon 管	VWR
79249 炔烃 Mega Stokes 染料	Sigma Aldrich
醋酸 冰川	VWR
乙腈，无水，99.8%	Sigma-Aldrich
氨苄青霉素钠盐，99%	Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO	Jena Bioscience
Biofuge	Heraeus
瓶顶过滤器，带 PES 膜（45 µm， 22 & micro;m）	Thermo Scientific
Brillant Blue G250 （Coomassie）	Roth
BspQI	NEB
相机 DS Qi1	尼康
离心机 5417r	Eppendorf
离心机 5810r	Eppendorf
CF-400-Cu 方网铜网格	EMS
氯霉素	Roth
CompactStar CS 4	VWR
葡聚糖，德克萨斯红，3000 MW，中性	Life Technologies
数字超声器	Branson
二甲基亚砜 （DMSO）	Applichem
Dnase I	Applichem
EarI	NEB
EcoRI-HF	NEB
环境摇床培养箱 ES-20	Biosan
乙醇无水	Roth
溴化乙锭溶液	Roth
过滤器支持	Avanti
玻璃板	Bio-Rad
甘油蛋白质组学级	Amresco
甘氨酸	Applichem
H4-叠氮基-苯-OH	Bachhem
加热板 MR HeiTec	Heidolph
HindIII	NEB
HisTrap FF 粗柱	GE 生命科学		镍柱
盐酸盐酸发烟，37%，每年			默克
照明器 ix 20	INTAS
照明器 LAS-4000	富士胶片
咪唑	默克
显微镜浸油	默克
培养箱 摇床 Unimax 1010	Heidolph
Inkubator 1000	Heidolph
IPTG，>99%	Roth
卡那霉素硫酸盐	Roth
L（+）-阿拉伯糖	Roth
实验室秤扩展 ed2202s/224s-OCE	赛多利斯
LB-培养基	Roth
冻干剂 Alpha 2-4 LSC	基督
溶菌酶，20000 U/mg	Roth
显微镜 CM 100	飞利浦
显微镜 Eclipse TS 100	尼康
显微镜 盖玻片 （15 x 15 mm）	VWR
显微镜载玻片	VWR
Microwave	Studio
迷你挤出机套装	Avanti 极性脂质
氯化钠，>99.5%，年利率	Roth
Natriumhydroxid 沉淀	Roth
Ni-NTA 琼脂糖，PerfectPro	5 Prime
核孔径迹蚀刻膜	Avanti
PH 计 766 杯形	Knick
苯甲基磺酰氟化物 （PMSF）	Roth
聚丙烯色谱柱 （1 mL）	Qiagen
PowerPac 碱性	BioRad
丙醇-2-ol	Emplura
蛋白质分子量标准 10-250 kDa	NEB
循环冷却器 F12	Julabo
加固环	Herma
SacI HF	NEB
SDS 颗粒	Roth
磷酸钠二氢二水合物，NaH2PO4	VWR
无菌针式过滤器 0.2 mm 醋酸纤维素	VWR
T4 DNA 连接酶	NEB
TEMED	Roth
TexasRed 葡聚糖偶联物	MolecularProbes
Thermomix comfort	Eppendorf
THF， >99.5% p.a.	来自 Casein Roth 的 Acros
Triton X 100	Roth
Trypton			/Pepton
超声波清洗机	VWR
Urea p.a.	Roth
真空泵 2.5	真空
XbaI	NEB
XhoI	NEB
ZelluTrans 再生纤维素管状膜 （12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V）	Roth