活细胞成像观察微管细胞骨架及微机械操控 拟南芥 茎尖分生组织

摘要

本文介绍了一种对茎尖分生组织中皮层微管细胞骨架进行活细胞成像并监测其对物理力变化响应的实验方案。

摘要

多年来，细胞和组织水平上生长与形态发生的调控机制一直是生物学研究的前沿课题。分子和成像技术的进步使我们得以深入了解生化信号如何影响形态发生事件。然而，越来越多的证据表明，除了生化信号外，机械信号也在细胞和组织生长的多个方面发挥重要作用。拟南芥茎尖分生组织（SAM）是一种穹顶状结构，负责产生所有地上器官。介导植物细胞壁中纤维素沉积的皮层微管细胞骨架在空间上具有明确的分布特征。对皮层微管排列模式进行可视化和定量分析，对于理解SAM区域细胞的生物物理特性至关重要，因为纤维素是植物细胞壁中最刚性的组分。皮层微管组织的典型模式也是SAM中广泛存在的组织尺度物理力的结果。干扰这些物理力并随后监测皮层微管的组织变化，有助于鉴定参与介导机械感知与信号转导的候选蛋白。本文介绍了一种用于研究此类过程的实验方案。

引言

植物细胞被一层由多糖和糖蛋白组成的细胞外基质所包围，其力学特性类似于一种纤维增强复合材料，能够动态改变其机械性能¹。植物细胞的生长由水分进入细胞所驱动，导致细胞壁上同时产生张力。为响应此类张力，细胞壁物理状态的改变使得细胞得以扩展。具有初生壁的细胞相较于含有次生壁的细胞能够更快地生长，这主要归因于两者细胞壁内多糖化学组成的差异。初生壁主要由纤维素、半纤维素和果胶以及糖蛋白组成，并且不含木质素，而木质素是次生壁中的组分²。纤维素是一种通过β-1,4糖苷键连接的葡萄糖聚合物，是细胞壁的主要成分。它形成纤维状结构，能够承受细胞生长过程中产生的高强度张力³。除了抵抗张力外，沿特定方向的机械增强作用会导致细胞在纤维素微纤丝净取向的垂直轴方向上由膨压驱动扩展。纤维素微纤丝的排列受到皮层微管细胞骨架的影响，因为后者可引导位于质膜上的纤维素合成复合体进行定向移动⁴。因此，利用与荧光分子融合的微管相关蛋白或微管蛋白来监测皮层微管的排列，可作为观察植物细胞中纤维素分布模式的间接手段。

皮层微管细胞骨架的排列受细胞和组织形态所衍生的机械力调控。在 SAM 顶端的细胞中，皮层微管的组织结构随时间推移并无特定取向；而在 SAM 周围区域以及 SAM 与新生器官交界处的细胞中，皮层微管则形成稳定且高度有序的跨细胞阵....

方案

1. 植物生长

1. 将表达微管结合域与绿色荧光蛋白融合蛋白（MBD-GFP）¹⁰ 的拟南芥（Arabidopsis）种子播种于土壤中，在长日照（16 小时光照 / 8 小时黑暗）、20 °C/6 °C 条件下培养 1 周以完成萌发。
2. 萌发后，将幼苗转移至具有充足生长空间的新花盆中，以促进旺盛的营养生长。将植株置于短日照（8 小时光照 / 16 小时黑暗）、20 °C/16 °C 条件下培养 3–5 周。
3. 将植株转移至长日照（16 小时光照 / 8 小时黑暗）、20 °C/16 °C 条件下培养，直至植株抽薹（2–3 周）。让花序生长至 2–5 cm 长。

2. 培养基制备

1. 用2%琼脂糖填充小型培养皿（直径约5.5 cm，深度约1.5 cm）至其深度的一半，以制备解剖培养皿。这些解剖培养皿也可用于单时间点成像。
2. 制备生长培养基。
   1. 配制50 mL的1,000倍维生素母液，其中包含5 g肌醇、0.05 g烟酸、0.05 g盐酸吡哆醇、0.5 g盐酸硫胺素和0.1 g甘氨酸。
   2. 配制生长培养基，成分为½ Murashige和Skoog培养基、1%蔗糖、1.6%琼脂、1倍维生素，pH = 5.8。经高压灭菌后冷却备用。
   3. 在无菌洁净工作台上，....

结果

图1展示了来自MBD-GFP品系的典型投影图像，其中位于穹顶中心的细胞其皮层微管排列紊乱，而位于边缘区域的细胞则呈环状分布（图1A,B）；相比之下，边界区域细胞的皮层微管则沿细胞长轴平行排列。这些观察结果揭示了茎尖分生组织（SAM）不同区域之间皮层微管空间分布的差异。延时成像显示，在消融处理后6小时内，皮层微管的排列从高度无序状态逐渐转变为更有序的结构（图1C,D）。利用FibrilTool生成的张量可叠加于皮层微管图像上，张量越长表示各向异性程度越高，同时也能反映皮层微管排列的主要方向。提取的信息可通过绘制随时间变化的平均各向异性值来表示（图1E）¹⁵。建议每种处理或基因型的样本量为四到.......

讨论

评估机械信号转导事件对于鉴定参与机械感知和信号转导通路的分子调控因子至关重要。本文所述方案通过利用拟南芥（Arabidopsis）茎尖分生组织（SAM）中皮层微管的响应作为该过程的读出指标，提供了对这类事件的定量观察视角。此处描述的实验步骤已在多种组织类型的研究中被常规应用^16,17,18,19。在所有组织类型中，微管各向异性在4小时范围内均表现出显著增加。

该实验方案中最关键的步骤是确保微管结构不会因长时间浸入水中而发生改变，因为水本身会导致细胞膨压升高。因此，应尽量缩短成像时间。尽管这可能会影响图像分辨率，但能够更准确地反映扰动处理的结果。第二重要的步骤是小心地解剖茎尖分生组织（SAM）。由于其尺寸极小，在操作过程中极易受损。如果较老器官的花梗未完全去除，则后续器官将更难移除。最后，在解剖过程中应避免SAM.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FibrilTool			Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJI			Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
甘氨酸	Merck	1.04201.1000
Leica SP8 共聚焦显微镜	Leica	DM6000 CS
MAP4-GFP			Marc, J. et al., Plant Cell 1998
微孔胶带	Leukopor	02482-00
MorphographX			Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019
肌醇	Sigma	I5125
N6-苄基腺嘌呤	Sigma	B3408
烟酸	Sigma	N4126
塑料铰链盒	Electron microscopy sciences	64312
PPM（植物防腐剂混合物）	Plant Cell Technology	PPM
碘化丙啶	Sigma	P4864
盐酸吡哆醇	Sigma	P9755
SURFCUT			Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
盐酸硫胺素	Sigma	T4625