需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

活细胞成像观察微管细胞骨架及微机械操控 拟南芥 茎尖分生组织

4.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/60936

⸱

2020年5月23日

 , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

本文内容

摘要

本文介绍了一种对茎尖分生组织中皮层微管细胞骨架进行活细胞成像并监测其对物理力变化响应的实验方案。

摘要

多年来，细胞和组织水平上生长与形态发生的调控机制一直是生物学研究的前沿课题。分子和成像技术的进步使我们得以深入了解生化信号如何影响形态发生事件。然而，越来越多的证据表明，除了生化信号外，机械信号也在细胞和组织生长的多个方面发挥重要作用。拟南芥茎尖分生组织（SAM）是一种穹顶状结构，负责产生所有地上器官。介导植物细胞壁中纤维素沉积的皮层微管细胞骨架在空间上具有明确的分布特征。对皮层微管排列模式进行可视化和定量分析，对于理解SAM区域细胞的生物物理特性至关重要，因为纤维素是植物细胞壁中最刚性的组分。皮层微管组织的典型模式也是SAM中广泛存在的组织尺度物理力的结果。干扰这些物理力并随后监测皮层微管的组织变化，有助于鉴定参与介导机械感知与信号转导的候选蛋白。本文介绍了一种用于研究此类过程的实验方案。

引言

植物细胞被一层由多糖和糖蛋白组成的细胞外基质所包围，其力学特性类似于一种纤维增强复合材料，能够动态改变其机械性能1。植物细胞的生长由水分进入细胞所驱动，导致细胞壁上同时产生张力。为响应此类张力，细胞壁物理状态的改变使得细胞得以扩展。具有初生壁的细胞相较于含有次生壁的细胞能够更快地生长，这主要归因于两者细胞壁内多糖化学组成的差异。初生壁主要由纤维素、半纤维素和果胶以及糖蛋白组成，并且不含木质素，而木质素是次生壁中的组分2。纤维素是一种通过β-1,4糖苷键连接的葡萄糖聚合物，是细胞壁的主要成分。它形成纤维状结构，能够承受细胞生长过程中产生的高强度张力3。除了抵抗张力外，沿特定方向的机械增强作用会导致细胞在纤维素微纤丝净取向的垂直轴方向上由膨压驱动扩展。纤维素微纤丝的排列受到皮层微管细胞骨架的影响，因为后者可引导位于质膜上的纤维素合成复合体进行定向移动4。因此，利用与荧光分子融合的微管相关蛋白或微管蛋白来监测皮层微管的排列，可作为观察植物细胞中纤维素分布模式的间接手段。

皮层微管细胞骨架的排列受细胞和组织形态所衍生的机械力调控。在 SAM 顶端的细胞中，皮层微管的组织结构随时间推移并无特定取向；而在 SAM 周围区域以及 SAM 与新生器官交界处的细胞中，皮层微管则形成稳定且高度有序的跨细胞阵列5。目前已发展出多种方法用于物理干扰细胞的力学状态。改变渗透压状态，以及使用影响细胞壁刚性的药理学或酶学化合物，均可导致细胞所受张力的相应变化6,7。另一种替代方法是使用可逐步增加组织所受压缩力的装置8。施加离心力也被证明可在不与细胞发生物理接触的情况下影响其机械力9。然而，目前最广泛使用的方法是利用所有表皮细胞均处于张力状态这一特性，通过物理消融细胞，局部消除膨压并破坏细胞间黏附，从而改变邻近细胞所受的张力。该操作可通过聚焦高功率脉冲紫外激光或使用细针实现。

本文详细阐述了在 SAM 处对皮层微管行为进行成像和评估以实施机械扰动的过程。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 植物生长

  1. 将表达微管结合域与绿色荧光蛋白融合蛋白（MBD-GFP）10 的拟南芥（Arabidopsis）种子播种于土壤中，在长日照（16 小时光照 / 8 小时黑暗）、20 °C/6 °C 条件下培养 1 周以完成萌发。
  2. 萌发后，将幼苗转移至具有充足生长空间的新花盆中，以促进旺盛的营养生长。将植株置于短日照（8 小时光照 / 16 小时黑暗）、20 °C/16 °C 条件下培养 3–5 周。
  3. 将植株转移至长日照（16 小时光照 / 8 小时黑暗）、20 °C/16 °C 条件下培养，直至植株抽薹（2–3 周）。让花序生长至 2–5 cm 长。

2. 培养基制备

  1. 用2%琼脂糖填充小型培养皿（直径约5.5 cm，深度约1.5 cm）至其深度的一半，以制备解剖培养皿。这些解剖培养皿也可用于单时间点成像。
  2. 制备生长培养基。
    1. 配制50 mL的1,000倍维生素母液，其中包含5 g肌醇、0.05 g烟酸、0.05 g盐酸吡哆醇、0.5 g盐酸硫胺素和0.1 g甘氨酸。
    2. 配制生长培养基，成分为½ Murashige和Skoog培养基、1%蔗糖、1.6%琼脂、1倍维生素，pH = 5.8。经高压灭菌后冷却备用。
    3. 在无菌洁净工作台上，将铰链式塑料盒（约5.2 cm × 5.2 cm × 3 cm）浸入70%乙醇中15分钟进行灭菌。
    4. 在无菌洁净工作台上，待培养基冷却至适宜温度后，加入N6-苄基腺嘌呤至终浓度为200 nM，并加入1/1,000稀释的PPM（植物防腐剂混合物），充分混匀。将灭菌后的塑料盒填充约一半深度的培养基。

3. 分离 SAM

  1. 用锋利的镊子剪下花序，并从花梗基部剥除较老的花蕾，直至肉眼难以分辨。
  2. 用镊子在解剖皿中的琼脂糖上切开一条切口，将花序基部插入厚实的琼脂中，以提供稳固支撑，便于在解剖镜下进一步精细解剖较年轻的花组织，从而暴露茎尖分生组织（SAM）。
  3. 在解剖显微镜下，用镊子从最老的花蕾开始，依次向较年轻的发育阶段轻轻下压，去除剩余的花蕾，直至茎尖分生组织（SAM）可见。通常在去除发育至第6至第7阶段的较老花蕾后，SAM 即可暴露。一旦 SAM 暴露，应迅速进入下一步操作，避免样品脱水。

4. 培养的自组装单分子膜的转移与生长

  1. 将新鲜解剖的样本按照第1节所述方法接种到长方形塑料铰链培养盒的培养基中，使茎尖分生组织（SAM）刚好暴露在培养基表面之上。在培养盒边缘滴加几滴无菌去离子水，然后盖上盖子以维持盒内湿度。注意所加的水不可淹没茎尖分生组织（SAM）。
  2. 盖紧盖子，并用微孔胶带将培养盒密封。将培养盒置于22 °C的长日照或连续光照条件下培养12–24 h，使茎尖分生组织（SAM）从解剖操作中恢复，并适应培养环境。

5. SAM 的成像

  1. 用无菌去离子水填充含有 SAM 的培养盒，使水完全覆盖样品。在解剖显微镜下检查，并使用 1 mL 移液枪对准样品强力喷射水流，以去除任何气泡。
  2. 将培养盒放置在直立式共聚焦显微镜的载物台上。注意确保培养盒不与显微镜物镜接触。使用数值孔径为 0.8–1 的长工作距离 40x 或 60x 水浸物镜，该物镜适用于无需盖玻片的成像。
  3. 将物镜浸入水中，并检查物镜前端是否形成气泡。如有气泡，应降低载物台，用光学擦拭纸轻轻擦拭镜头，并用巴斯德移液管向物镜前端添加少量水，然后重新浸入水中。
  4. 使用共聚焦显微镜的 GFP 滤光片和落射照明模块，调节 XY 控制器以定位样品。调节目镜位置，将 SAM 置于光源正下方，并沿 Z 轴调焦直至找到顶端分生组织。
    注意：切勿直视紫外光。
  5. 找到样品后，使用能够激发 GFP 的激光（例如 488 nm 或 496 nm 激光源）进行照射。调节显微镜的光学变倍，使整个 SAM 及第 1 阶段花原基均位于视野范围内。进一步调节激光输出功率和增益设置，以确保获得最佳的信噪比。
    注意：激光强度过高会导致样品发生光漂白。利用欠曝光与过曝光调色板有助于更准确地调整这些参数。
  6. 让样品静置 2–5 分钟。以约 0.3 µm 的像素尺寸分辨率，以 0.25 µm–0.5 µm 的 Z 轴切片间隔采集样品的共聚焦 Z 堆栈图像。确保从样品浸入水中开始，至完成图像采集为止，单个样品的总成像时间不超过 10 分钟。
  7. 立即吸除水分，并将培养盒移回生长室。长时间将样品浸泡在水中会影响细胞的渗透状态。

6. SAM 的微机械扰动

  1. 按照第5节所述设置成像条件，获取皮层微管组织的消融前图像序列。
  2. 倒掉培养皿中的水。使用洁净的注射针头（0.4 mm × 20 mm）进行消融操作。
    1. 在解剖显微镜下，小心持握针头，缓慢接近茎尖分生组织（SAM）。
      注意：屏住呼吸并以放松的手势持针有助于避免抖动。
    2. 用针尖短暂接触 SAM 顶端穹顶，以确认完成消融。建议在 SAM 边缘区域进行消融，以便观察穹顶中央区域无序排列的皮层微管的行为及其转变过程。
  3. 重新向培养皿中加入无菌去离子水，并加入碘化丙啶（10 µg/mL）。除监测 GFP 标记的皮层微管信号外，使用独立通道观察碘化丙啶可清晰标记被消融细胞的区域。碘化丙啶可使用561 nm或其他合适波长的激光激发，发射光信号采集范围为600–650 nm。
  4. 消融后立即采集图像序列（见第6节），之后每2小时重复采集一次，持续6小时。每次采集完成后，将培养皿连同样品放回培养箱中。确保培养基表面保留少量水分，并用微孔胶带封住培养皿以防止干燥。

7. 数据可视化与定量分析

  1. 使用免费软件（如 MORPHOGRAPHX11、FIJI12 或宏工具 SurfCut13）生成表面投影。
  2. 在 FIJI 中使用 FibrilTool14 宏工具提取皮层微管的各向异性。
    注意：相关软件使用的详细方案可从对应的参考文献中获取。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

图1展示了来自MBD-GFP品系的典型投影图像，其中位于穹顶中心的细胞其皮层微管排列紊乱，而位于边缘区域的细胞则呈环状分布（图1A,B）；相比之下，边界区域细胞的皮层微管则沿细胞长轴平行排列。这些观察结果揭示了茎尖分生组织（SAM）不同区域之间皮层微管空间分布的差异。延时成像显示，在消融处理后6小时内，皮层微管的排列从高度无序状态逐渐转变为更有序的结构（图1C,D）。利用FibrilTool生成的张量可叠加于皮层微管图像上，张量越长表示各向异性程度越高，同时也能反映皮层微管排列的主要方向。提取的信息可通过绘制随时间变化的平均各向异性值来表示（图1E）15。建议每种处理或基因型的样本量为四到...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

评估机械信号转导事件对于鉴定参与机械感知和信号转导通路的分子调控因子至关重要。本文所述方案通过利用拟南芥（Arabidopsis）茎尖分生组织（SAM）中皮层微管的响应作为该过程的读出指标，提供了对这类事件的定量观察视角。此处描述的实验步骤已在多种组织类型的研究中被常规应用16,17,18,19。在所有组织类型中，微管各向异性在4小时范围内均表现出显著增加。

该实验方案中最关键的步骤是确保微管结构不会因长时间浸入水中而发生改变，因为水本身会导致细胞膨压升高。因此，应尽量缩短成像时间。尽管这可能会影响图像分辨率，但能够更准确地反映扰动处理的结果。第二重要的步骤是小心地解剖茎尖分生组织（SAM）。由于其尺寸极小，在操作过程中极易受损。如果较老器官的花梗未完全去除，则后续器官将更难移除。最后，在解剖过程中应避免SAM...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FibrilToolBoudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJISchindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
甘氨酸Merck1.04201.1000
Leica SP8 共聚焦显微镜LeicaDM6000 CS
MAP4-GFPMarc, J. et al., Plant Cell 1998
微孔胶带Leukopor02482-00
MorphographXStrauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019
肌醇SigmaI5125
N6-苄基腺嘌呤SigmaB3408
烟酸SigmaN4126
塑料铰链盒Electron microscopy sciences64312
PPM（植物防腐剂混合物）Plant Cell TechnologyPPM
碘化丙啶SigmaP4864
盐酸吡哆醇SigmaP9755
SURFCUTErguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
盐酸硫胺素SigmaT4625

参考文献

  1. Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
  2. McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
  3. Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
  4. Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
  5. Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864(2015).
  6. Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
  7. Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).
  8. Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
  9. Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
  10. Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
  11. Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38(2019).
  14. Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
  15. Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
  16. Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
  17. Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967(2014).
  18. Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036(2019).
  19. Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
  20. Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

GFP
活细胞成像观察微管细胞骨架及微机械操控 拟南芥 茎尖分生组织
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。