用于单个DNA分子大规模并行蛋白质合成的飞升级液滴阵列

摘要

本实验方案的总体目标是在1 cm²的平面基底上制备超过一百万个有序、均一、稳定且具有生物相容性的飞升级液滴，可用于无细胞蛋白合成。

摘要

科学仪器在空间分辨率和检测灵敏度方面的进步使得小型反应器在生物与化学研究中的应用成为可能。为满足对高性能微反应器的需求，我们开发了一种飞升液滴阵列（FemDA）装置，并展示了其在大规模并行无细胞蛋白合成（CFPS）反应中的应用。利用两步油封协议，可在手指大小的区域内轻松生成超过一百万个均一的液滴。每个液滴均被固定在由亲水底部和疏水侧壁构成的飞升级微腔中。这种亲水-疏水混合结构，结合专用的封堵油和表面活性剂，对于在无蒸发损失的情况下稳定保留飞升级水相溶液至关重要。FemDA装置的飞升级结构和简单设计显著降低了试剂消耗。液滴反应器尺寸的高度均一性使得大规模定量分析和时间序列测量结果具有说服力且可靠。FemDA技术将CFPS反应的蛋白产量与每个液滴中的DNA分子数量相关联。我们优化并简化了装置的微加工流程、飞升级液滴的形成过程以及显微图像数据的采集与分析步骤。该详细操作方案运行成本低，使得任何具备标准洁净室设施和常规荧光显微镜的研究人员均可便捷地使用FemDA技术。

引言

研究人员使用反应器进行生物/化学反应。为了降低试剂消耗并提高工作效率，人们已做出大量努力来缩小反应器的体积并提高实验通量。这两个方面均旨在减轻研究人员的繁重工作负担，降低研究成本，并加快研发进程。从反应体积和通量的角度来看，反应器技术的发展具有清晰的历史脉络：单个烧杯/烧瓶/试管、毫升级试管、微升级试管、微升级8联管、微升级96/384/1536孔板，以及微流控纳升级/皮升级/飞升级反应器^{1,2,3,4,5,6,7}。正如过去几十年中半导体行业集成电路芯片上晶体管特征尺寸不断缩小一样，生物/化学微反应器也正经历着体积缩小和系统集成的过程。这类小型化工具对基于细胞或无细胞的合成生物学、生物制造以及高通量原型构建与筛选产生了深远影响^8,9,10,

方案

1. 飞升微腔阵列基底的微加工

注意：在洁净室中进行以下微加工实验。进入洁净室前需佩戴手套并穿上洁净室防护服。

1. 清洁盖玻片基底
   1. 将盖玻片置于盖玻片染色架上。在8 M氢氧化钠（NaOH）溶液中室温（RT）超声处理盖玻片15分钟。
      警告：高浓度的 NaOH 对皮肤和眼睛具有强腐蚀性。操作时应轻柔，避免飞溅。
   2. 将架子从 NaOH 溶液中取出，用水冲洗盖玻片十次。将盖玻片保存在纯水中。
      注意：将碱性废液弃置到指定的废液桶中。NaOH 溶液可回收至原瓶，最多可重复使用五次。
   3. 用吹气枪将每片盖玻片吹干。
   4. 将干燥的盖玻片置于加热板上，200 °C 烘烤 5 分钟。在后续操作过程中，保持玻璃基底上表面方向一致。
2. 玻璃表面的硅烷化
   1. 将清洗后的盖玻片重新放置于干燥的染色架上。
   2. 向聚四氟乙烯烧杯中加入150 mL乙醇。使用配有22 G × 70 mm针头的1 mL注射器吸取0.075 mL (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，并立即注入乙醇中（即0.05 vol %）。反复抽吸数次以冲洗注射器内部。用针头搅拌溶液使其均匀混合。
      注意：(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷在密封条件下可于室温及1 atm压力下保存两年。无水乙醇使用后应严格密封。不建议使用任何过期....

结果

微加工工艺包括基底清洗、表面功能化、CYTOP 涂覆、光刻、干法刻蚀、光刻胶剥离以及最终清洗。重要的是，本方案实现了在微腔内完全去除疏水性 CYTOP 聚合物（图 3A），从而在标准盖玻片基底上形成高度平行的亲水-疏水结构。借助油封方案，通过在微腔中包封荧光溶液验证了所生成液滴的均匀尺寸（图 3B）。利用所开发软件提取的荧光强度是液滴尺寸的良好指标。荧光强度的变异系数（CV）为 3%，反映了整个阵列中液滴尺寸分布狭窄（图 3C）。由共聚焦显微镜重建的三维图像也显示液滴体积在时间上的稳定性（图 3D，补充影片 1）⁴⁴。相比之下，广泛使用的 FC-40 油所产生的液滴其荧光强度差异可达数倍⁴⁵。FemDA 中形成的液滴在室温下至少可稳定维持 24 小时（

讨论

基于 FemDA 中高度均一、稳定且具有生物相容性的液滴所实现的高定量测量，使得离散分布成为可能，这是本研究区别于其他研究的独特特征。本文系统优化并详细描述了微加工和液滴形成过程。在 established protocol 中包含若干关键步骤。

首先，在矩形薄玻璃基板上均匀涂覆高黏度的 CYTOP 聚合物，很大程度上决定了最终基板的质量。鉴于高倍物镜的通常工作距离较短（见步骤 6.1），必须使用薄盖玻片。在薄而柔性的基板上实现高质量的旋涂通常较为困难。我们尚未测试所有可能的设计，但发现使用具有相同矩形尺寸的多孔真空卡盘在旋涂过程中效果良好。将 CYTOP 聚合物滴加在盖玻片基板中心后，应立即开始旋涂（见步骤 1.3.2）。操作难度主要与聚合物的黏度有关，而与基板形状关系较小。CYTOP 产品线提供多种不同浓度的市售包装，包装中附带的稀释剂也可用于将原液稀释至更低的黏度。本实验所用的 CYTOP 816 是市售产品中浓度最高、可在溶剂中稳定溶解聚合物的型号。若需更厚的涂层，可采用较低的旋涂速度，或进行多次涂覆与固化。当在新环境中使用新的旋涂仪时，强烈建议绘制特征厚度与旋涂速度的关系.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich	440140
1 mL 注射器	Terumo	SS-01T
2-丙醇	关东化学	EL 级	EL：用于电子行业。
三维激光扫描共聚焦显微镜	Lasertec	OPTELICS HYBRID	其他类似显微镜（例如 Keyence VK-X1000、Olympus LEXT OLS5000）也可使用。
50 mL 注射器	Terumo	SS-50LZ
6,8-二氟-4-甲基伞形磷酸酯	Thermo Fisher Scientific	D6567	用二甲基亚砜配制 5 mM 储存液
丙酮	关东化学	EL 级	EL：用于电子行业。 纯度 99.8%。
气吹仪	Hozan	Z-263
铝块	BIO-BIK	AB-24M-02
铝制微量离心管架	BIO-BIK	AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000	AGC	(测试样品)	向 AGC 咨询可获取免费测试样品。
BEMCOT PS-2 擦拭纸	Ozu	028208
带推杆的活检打孔器	Kai	BPP-10F
盖玻片	松内玻璃	No. 1 (24 mm × 32 mm，厚度 0.13~0.17 mm)	可按尺寸定制。
盖玻片染色架	中村	803-131-11
CRECIA TechnoWipe 清洁擦拭纸	日本纸业 Crecia	C100-M
切割垫	GE Healthcare	WB100020
CYTOP	AGC	CTL-816AP
脱泡混合器	Thinky	AR-100
台式切割机	Roland	STIKA SV-8
显影液	AZ 电子材料	AZ 300 MIF	AZ 电子材料现已被默克收购。 其他碱性显影液也可使用，但需优化显影条件（时间、温度等）。
双面胶聚酰亚胺薄膜胶带	寺冈精工	7602 #25
乙醇	关东化学	EL 级	EL：用于电子行业。 纯度 99.5%。
Fiji			版本：ImageJ 1.51n
扁平电缆切割器	东京 IDEAL	MT-0100
氟化油 Fomblin	Solvay	Y25 或 Y25/6	向 Solvay 咨询可获取免费测试样品。若 Y25 不易获得，Y25/6 可作为替代品。
加热板	AS ONE	TH-900
注射针头	Terumo	NN-2270C	22G × 70 mm
倒置荧光显微镜	尼康	Eclipse Ti-E	需具备落射荧光功能、CCD 或 sCMOS 相机、电动载物台、自动对焦系统和高数值孔径物镜。
KaleidaGraph	Synergy		版本：4.5
掩模对准器	SUSS	MA-6	只要具备真空接触模式，其他掩模对准器也可使用。
MICROMAN 移液器	GILSON	E M250E	毛细管活塞吸头：CP250
Microsoft Excel	Microsoft		版本：16.16.15
小型真空腔室	AS ONE	MVP-100MV
无核酸酶水	日本基因	316-90101
Parafilm 封口膜	Amcor	PM-996
PCR 管	日本遗传学	FG-021D/SP
培养皿	AS ONE	GD90-15	直径 90 mm，高度 15 mm。
光刻胶	AZ 电子材料	AZ P4903	AZ 电子材料现已被默克收购。AZ P4620 可作为替代品。
酶标仪	BioTek	POWERSCAN HT
聚乙烯手套	AS ONE	6-896-02	商品名：Saniment。
PURExpress 体外蛋白质合成试剂盒	新英格兰生物实验室	E6800S 或 E6800L	用于无细胞蛋白质合成反应。
反应离子刻蚀系统	Samco	RIE-10NR	其他 RIE 系统也可使用，但需优化刻蚀条件（气体流速、腔室压力、射频功率、刻蚀时间等）。
RNase 抑制剂	新英格兰生物实验室	M0314S
透明胶带	3M	810-1-18D
氢氧化钠溶液	富士胶片和光纯药	194-09575	浓度 8 M；有危险性。
旋涂仪	Oshigane	SC-308
SURFLON S-386 表面活性剂	AGC	(测试样品)	向 AGC 咨询可获取免费测试样品。
SYLGARD 184 硅橡胶弹性体	陶氏	Sylgard184	化学成分：聚二甲基硅氧烷。默认混合比例为基料 : 固化剂 = 10 : 1（质量比）。
镊子	Ideal-tek	2WF.SA.1 2A
超声波清洗机	AS ONE	ASU-2M
真空吸盘	Oshigane	(定制)	材质：聚甲醛；带多个孔的矩形样品台（48 个孔，每个孔直径 1 mm）；尺寸根据盖玻片（24 mm × 32 mm）定制。