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方法文章

用于单个DNA分子大规模并行蛋白质合成的飞升级液滴阵列

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DOI：

10.3791/60945

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2020年6月20日

 ,  ,  ,  , 
1SUGAR Program, X-star, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2Center for Mathematical Science and Advanced Technology, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Deep-Sea Nanoscience Research Group, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

本文内容

摘要

本实验方案的总体目标是在1 cm2的平面基底上制备超过一百万个有序、均一、稳定且具有生物相容性的飞升级液滴，可用于无细胞蛋白合成。

摘要

科学仪器在空间分辨率和检测灵敏度方面的进步使得小型反应器在生物与化学研究中的应用成为可能。为满足对高性能微反应器的需求，我们开发了一种飞升液滴阵列（FemDA）装置，并展示了其在大规模并行无细胞蛋白合成（CFPS）反应中的应用。利用两步油封协议，可在手指大小的区域内轻松生成超过一百万个均一的液滴。每个液滴均被固定在由亲水底部和疏水侧壁构成的飞升级微腔中。这种亲水-疏水混合结构，结合专用的封堵油和表面活性剂，对于在无蒸发损失的情况下稳定保留飞升级水相溶液至关重要。FemDA装置的飞升级结构和简单设计显著降低了试剂消耗。液滴反应器尺寸的高度均一性使得大规模定量分析和时间序列测量结果具有说服力且可靠。FemDA技术将CFPS反应的蛋白产量与每个液滴中的DNA分子数量相关联。我们优化并简化了装置的微加工流程、飞升级液滴的形成过程以及显微图像数据的采集与分析步骤。该详细操作方案运行成本低，使得任何具备标准洁净室设施和常规荧光显微镜的研究人员均可便捷地使用FemDA技术。

引言

研究人员使用反应器进行生物/化学反应。为了降低试剂消耗并提高工作效率，人们已做出大量努力来缩小反应器的体积并提高实验通量。这两个方面均旨在减轻研究人员的繁重工作负担，降低研究成本，并加快研发进程。从反应体积和通量的角度来看，反应器技术的发展具有清晰的历史脉络：单个烧杯/烧瓶/试管、毫升级试管、微升级试管、微升级8联管、微升级96/384/1536孔板，以及微流控纳升级/皮升级/飞升级反应器1,2,3,4,5,6,7。正如过去几十年中半导体行业集成电路芯片上晶体管特征尺寸不断缩小一样，生物/化学微反应器也正经历着体积缩小和系统集成的过程。这类小型化工具对基于细胞或无细胞的合成生物学、生物制造以及高通量原型构建与筛选产生了深远影响8,9,10,11,12。本文介绍了我们在开发一种独特的液滴阵列技术方面的最新进展，并展示了其在CFPS13中的应用，CFPS是合成生物学和分子筛选领域的一项基础技术14。特别地，我们有意提供一种经过优化且低成本的操作流程，以使FemDA装置能够被所有人便捷使用。这种低成本且易于操作的微型化设备方案将有助于高校的教学工作，并推动该技术的普及。

FemDA 可在平面玻璃基底上以每 1 cm2 高达 106 个的超密度制备飞升级液滴。我们在玻璃基底上涂覆了一层疏水性聚合物 CYTOP15，并在预设位置选择性刻蚀（去除）CYTOP，从而在基底上形成微腔阵列。因此，所得到的微腔由疏水侧壁（CYTOP）和亲水底部（玻璃）构成。当依次将水和油流过图案化表面时，水可被截留并密封于微腔内。这种“疏水环境中的亲水结构”对于排斥微腔外的水、隔离各个微反应器以及在飞升级空间内保留微量水溶液至关重要。该独特性质已成功应用于制备水包油液滴和脂双层微区室16,17。与原型装置16相比，我们首先优化了微加工工艺，实现了 CYTOP 聚合物的完全去除以及玻璃底部的充分暴露。CYTOP 是一种特殊的氟聚合物，具有极低的表面张力（19 mN/m），低于玻璃、塑料和硅胶等传统微反应器材料的表面张力。其优异的光学、电学和化学性能已广泛应用于微流控器件的表面处理18,19,20,21,22,23,24。在 FemDA 系统中，为了实现油在 CYTOP 表面的良好润湿，油的表面张力必须低于固体表面的表面张力25，否则与固体表面接触的液态油倾向于形成球状而非在表面铺展。此外，我们发现一些常用的全氟碳油（如 3M FC-40）16 和氢氟醚油（如 3M Novec 系列）会因 CYTOP 的非晶态结构而溶解 CYTOP，这对定量测量极为不利，并可能导致液滴间的交叉污染。幸运的是，我们筛选出一种生物相容且环境友好的油，其表面张力更低（< 19 mN/m）13。我们还发现了一种新型表面活性剂，可溶于所选油相并在低浓度下发挥作用（0.1%，至少比此前报道的常用表面活性剂低 10 倍26,27）13，从而稳定形成的水/油界面。由于该油具有较高的蒸发速率，在用其冲洗后，我们使用另一种生物相容且环境友好的油替换第一种油以密封微腔。我们将第一种油（含 0.1 wt % SURFLON S-386 的 ASAHIKLIN AE-3000）称为“冲洗油”，将第二种油（Fomblin Y25）称为“密封油”。

两步油封策略可在数分钟内实现飞升级液滴阵列的稳定形成，且无需复杂的仪器设备。由于蒸发问题，生成体积小于皮升级的微反应器一直被认为具有挑战性28。FemDA通过系统优化微反应器/液滴制备所用的材料与工艺，解决了这一难题。所获得的液滴具有多项显著特性，包括在飞升级尺度下高度均一（或单分散性）、稳定性及良好的生物相容性。液滴体积的变异系数（CV）仅为3%（显微图像未进行晕影校正），是目前全球所有液滴平台中最小的CV值，确保了高度并行且定量的测量。飞升级液滴在室温下至少可稳定保持24小时，且液滴间无交叉污染，这对于可靠的动态时间过程测量具有重要价值。在生物相容性方面，我们成功在单拷贝模板DNA的基础上，在飞升级液滴中合成了多种蛋白质，而此前该过程被认为难以实现或效率低下29,30。阐明为何某些能在FemDA中合成的蛋白质在其他液滴系统中无法合成，将具有重要意义。FemDA不仅是一项技术进步，更实现了前所未有的定量测量，能够将每个液滴中的蛋白质产量（以液滴荧光强度反映）与模板DNA分子数量直接关联。因此，基于FemDA的无细胞蛋白合成（CFPS）所获得的液滴荧光强度直方图呈现出离散分布，可被完美拟合为一系列峰间距相等的高斯分布之和。此外，含有不同数量DNA分子的液滴出现概率与泊松分布完全吻合31。因此，可根据该离散分布对每个液滴中不同的蛋白质产量进行归一化处理。这一关键特性使我们能够将酶活性信息从表观强度中分离出来，而这是现有其他微反应器平台尚未实现的功能。现有的微流控细胞/液滴分选系统在全自动分选和样品富集方面表现优异，但在分析层面有时仅能输出相对宽泛或长尾分布的直方图32,33。我们高度定量且生物相容性优良的FemDA系统，为微反应器领域的发展设立了新的基准和高标准的分析范式。

可用于制备液滴的油相和表面活性剂种类仍然非常有限34。在 FemDA 中建立的 ASAHIKLIN AE-3000 与 SURFLON S-386 的组合，是不断扩展的水相与油相之间物理化学界面工具库中的新成员13。FemDA 中的这种新界面具有物理稳定性、化学惰性，并且在生物学上兼容多种蛋白质的复杂转录、翻译及翻译后修饰机制13。相比之下，若发现某种蛋白质无法在液滴体系中合成，反而会更加引人关注。此外，与纳升级和皮升级反应器系统相比，飞升级液滴系统在试剂成本节约方面更为显著35,36。特别是，在微流控液滴生成系统中通常存在较大的死体积（主要由管路或外部供液部分引起），而我们的 FemDA 系统则不存在这一问题。阵列式结构还便于对每一个反应器进行重复且详细的显微表征（类似于所谓高内涵分析），而非仅对高速运动物体进行单次快照式观察37。飞升级尺度使得可在手指大小的区域内集成超过一百万个反应器，而相同数量的纳升级反应器（如果存在）则需要超过一平方米的面积，这在制造和使用上无疑极不现实。

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方案

1. 飞升微腔阵列基底的微加工

注意：在洁净室中进行以下微加工实验。进入洁净室前需佩戴手套并穿上洁净室防护服。

  1. 清洁盖玻片基底
    1. 将盖玻片置于盖玻片染色架上。在8 M氢氧化钠（NaOH）溶液中室温（RT）超声处理盖玻片15分钟。
      警告：高浓度的 NaOH 对皮肤和眼睛具有强腐蚀性。操作时应轻柔，避免飞溅。
    2. 将架子从 NaOH 溶液中取出，用水冲洗盖玻片十次。将盖玻片保存在纯水中。
      注意：将碱性废液弃置到指定的废液桶中。NaOH 溶液可回收至原瓶，最多可重复使用五次。
    3. 用吹气枪将每片盖玻片吹干。
    4. 将干燥的盖玻片置于加热板上，200 °C 烘烤 5 分钟。在后续操作过程中，保持玻璃基底上表面方向一致。
  2. 玻璃表面的硅烷化
    1. 将清洗后的盖玻片重新放置于干燥的染色架上。
    2. 向聚四氟乙烯烧杯中加入150 mL乙醇。使用配有22 G × 70 mm针头的1 mL注射器吸取0.075 mL (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，并立即注入乙醇中（即0.05 vol %）。反复抽吸数次以冲洗注射器内部。用针头搅拌溶液使其均匀混合。
      注意：(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷在密封条件下可于室温及1 atm压力下保存两年。无水乙醇使用后应严格密封。不建议使用任何过期试剂。
    3. 在室温下将盖玻片孵育于0.05 vol %氨基硅烷溶液中1小时。
    4. 用纯水将盖玻片冲洗五次。将盖玻片保存在纯水中。
      注意：将废液弃置到指定的废液罐中。
    5. 用吹气枪将每片盖玻片吹干。
    6. 将所有干燥的盖玻片放置在铝箔上，在80 °C的加热板上烘烤5分钟。
  3. 旋涂 CYTOP 全氟聚合物
    1. 将盖玻片置于旋涂仪的定制真空吸盘上（图1A开启真空开关以固定玻璃基板。
      注意：真空吸盘的设计对于在矩形（24 mm × 32 mm）、薄型（0.13–0.17 mm）基底上实现粘性聚合物的均匀涂覆至关重要图1A我们发现，与带有一个中心圆孔的圆形样品台相比，带有多个孔（48个孔，每个孔直径为1 mm）连接至真空通道的矩形样品台效果更佳。
    2. 在玻璃基底中心滴加70-90 µL A型CYTOP聚合物。立即对聚合物进行旋涂（图1B).
      注意：旋涂条件（3,400 rpm，30 s）可获得 3 μm 厚度。使用专为黏稠液体设计的移液器。保持移液器垂直，使聚合物液滴在基底上接近完美的圆形。当活塞向下移动时，移液器吸头内常会产生气泡。请勿将含气泡的最后一点 CYTOP 滴出。
    3. 用手指捏住玻璃基片的边缘，拿起镀膜玻璃，并将其放置在铝箔上。
    4. 重复步骤 1.3.1–1.3.3，对所有剩余的盖玻片进行旋涂。
    5. 将镀膜玻璃在 80 °C 下烘烤 30 分钟，然后在 200 °C 下烘烤 1 小时。
      注意：此处理过程可使 CYTOP 完全固化，并将其共价键合至玻璃表面。若需要，可在烘烤区域覆盖铝箔制成的盖子，以避免长时间烘烤过程中可能产生的灰尘污染。
    6. 从加热板上取下CYTOP包被的盖玻片，冷却至室温。小心取出每片包被的玻璃，检查其包被是否均匀。弃去包被不均匀的基底。
      注意：涂覆良好的 CYTOP 表面应呈现平整状态，无异常的彩虹样条纹（图1C）。从合适的角度进行目视检查，可快速判断平整度及涂层质量。此步骤可暂停。
  4. 旋涂光刻胶
    1. 将涂有CYTOP的盖玻片放置于旋涂仪的真空吸盘上（见步骤1.3.1）。打开真空开关以固定盖玻片。
    2. 在基底中心滴加 0.2–0.3 mL 光刻胶，立即以 6,000 rpm 旋涂 60 s。
      注意：不要滴加含有气泡的最后一滴光刻胶。如果甩胶机支持更高的转速，可将转速提高至7,500 rpm，以获得更薄的涂层。CYTOP表面能较低，导致大多数光刻胶难以在其表面附着。若无法获得AZ P4903光刻胶，AZ P4620光刻胶是一个良好的替代选择。
    3. 用手指捏住基底的两个角，拿起已涂覆的基底。使用浸有乙醇的洁净擦拭纸，擦去基底边缘附近的多余光刻胶（此步骤通常称为去边缘胶，EBR）。图1D将底物置于铝箔上。
      注意：不建议将丙酮用于EBR。
    4. 重复步骤 1.4.1–1.4.3，对剩余的 CYTOP 涂层盖玻片进行光刻胶旋涂。逐片取起已涂覆的玻片，检查涂层是否均匀完整。
      注意：涂覆良好的光刻胶表面应平整，无不规则图案（图1D）。从合适的角度进行目视检查可快速判断薄膜的平整性及涂层质量。若基底出现涂层不均匀的情况，可通过丙酮、2-丙醇和H2O 按顺序进行，并可重复使用。
    5. 将涂覆的基底在热板上于 110 °C 烘烤 5 分钟。
    6. 将涂覆的基底从加热板上取下，并冷却至室温。在相对湿度为40%–60%的条件下静置30分钟，使光刻胶重新水合。
      注意：H2O 是以下光化学反应所必需的。烘焙后的光刻胶失去了 H2光刻胶内部的氧含量。再水合过程允许 H2O从空气中被吸收。相对湿度低于20%或高于80%均不适用于复水过程。
  5. 光刻技术
    1. 在等待复水期间（见步骤 1.4.6），启动掩模对准仪，预热光源，并装入铬版光掩模。
      注意：请按照操作手册使用光刻对准仪。如果具备电子束（EB）光刻设备，可通过电子束光刻技术制备光刻掩模。或者，可将光刻掩模外包给当地公司制作。
    2. 将复水后的底物（完成步骤1.4.6后）装载到卡盘上图1E).
    3. 设置曝光参数。以13 mW/cm的紫外光强度照射基底25秒。2 （h线）处于真空接触模式下。然后卸下基底，将其放置在盖玻片染色架上（与步骤1.1.1中使用的同一支架）。
    4. 重复步骤 1.5.2–1.5.3，以暴露水化底物的其余部分。
  6. 发育
    1. 将底物孵育5分钟，以溶解暴露的光刻胶（图1F）。在此期间，在第4分钟时间点，将架子在显影液中轻轻摇动一次。
      注意：所用显影剂为 AZ 300 MIF。其他碱性显影剂（如 AZ 400 K）通常也可用于显影，但需对显影条件（如时间、温度、搅拌）进行优化。切勿使用玻璃烧杯作为显影剂容器。
    2. 用纯水将基底冲洗十次。将盖玻片保留在纯水中。
      注意：将显影液弃置到指定容器中。
    3. 使用气吹枪将每一块基材彻底吹干。
  7. 反应离子刻蚀
    1. 将干燥后的基底（来自步骤1.6.3）放入反应离子刻蚀（RIE）设备的反应腔室中。
      注意：根据实验室的维护规定，反应离子刻蚀机（RIE）可选择持续开机或每次使用后关闭。若设备开关处于关闭状态，请参照操作手册开启开关。
    2. 用 O₂ 刻蚀未被光刻胶覆盖的 CYTOP2 血浆（图1G).
      注意：RIE 条件如下。O2 气体流速：50 sccm；腔室压力：10.0 Pa；射频功率：50 W；刻蚀时间：27 分钟。刻蚀时间已优化，以完全刻蚀 3 μm 厚度的 CYTOP。
    3. 用镊子从反应室中取出每一片基底材料，并将其放置在盖玻片染色架上。
      注意：根据设施的维护规定，反应室可能需要短暂的 O2 等离子清洗过程（例如：刻蚀时间：5 min），每次运行后保持反应室清洁。
  8. 去除光刻胶并清洗
    1. 在室温下用丙酮超声处理基底5分钟，以溶解残留的光刻胶。
    2. 在室温下将底物在2-丙醇中进行超声处理5分钟。
    3. 用纯水将基底冲洗五次。在室温下对基底进行超声处理5分钟。再用纯水将样品冲洗五次。将基底保存在纯水中。
    4. 用气吹枪将每一块基底材料吹干图1H).
      注意：基底可存放在塑料培养皿中。制备好的基底在室温下至少一年内结构稳定。此处可暂停实验方案。
    5. 通过三维（3D）激光扫描共聚焦显微镜、白光干涉仪（或相干扫描干涉仪）或扫描电子显微镜，表征所制备基底的表面形貌。使用相应的软件测量所形成的微腔的直径和深度。
      注意：使用非接触式、非破坏性的三维激光共聚焦显微镜或白光干涉仪完成表征后，样品可保留用于其他实验。本实验方案可在此处暂停。

2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道的制备

注意：处理聚二甲基硅氧烷（PDMS）时，请勿佩戴乳胶手套，而应佩戴聚乙烯（PE）手套。

  1. 制作微通道母版
    1. 使用台式切割机将双面涂胶的聚酰亚胺（Kapton）胶带切割成预定的微通道形状（3 mm × 19 mm）。
      注：所用Kapton胶带为Teraoka Seisakusho公司的No. 7602 #25，所得通道高度为135 μm。STIKA台式切割机通过Adobe Illustrator插件（可从Roland官网https://www.rolanddga.com获取）运行，依据Adobe Illustrator文件中的图形进行切割。此步骤可暂停。
    2. 将每条切割好的Kapton胶带粘贴至培养皿的平底表面。标准90 mm培养皿可容纳12条胶带。
      注：该凸起结构将作为PDMS复制模塑的母版。若胶带与培养皿基底之间夹有气泡，可用镊子轻轻按压胶带表面以排除。此外，也可采用传统的软光刻技术在硅片上制备母版38。此步骤可暂停。
  2. 在贴有胶带图案的培养皿中固化PDMS树脂
    1. 戴上新的聚乙烯（PE）手套，使用一次性塑料移液管将2.5 g SYLGARD 184硅酮弹性体的固化剂转移至指定的塑料烧杯中（图2A）。
    2. 更换新手套，使用一次性50 mL注射器将25 g SYLGARD 184硅酮弹性体的预聚物基础组分转移至上述塑料烧杯中。
      注：更换手套以防止固化剂对基础组分造成潜在交叉污染。
    3. 使用脱气混合仪混合并脱除气泡（程序：先混合3分钟，再脱气2分钟）。
      注：若无脱气混合仪，可手动搅拌约15分钟，随后将混合物置于真空腔中脱气。
    4. 将PDMS混合物倒入贴有胶带图案的培养皿中（图2B）。将培养皿置于小型真空腔中，对PDMS混合物脱气1–3小时（图2C）。
      注：若1小时后PDMS混合物中仍有残留空气，可将培养皿取出，用气流吹除气泡，再放回真空腔中继续脱气。
    5. 将培养皿置于60 °C烘箱中过夜，以固化PDMS（图2D）。
      注：尽管提高温度可缩短固化时间，但聚苯乙烯培养皿在不发生物理变形的前提下所能耐受的最高温度约为60 °C。
  3. PDMS通道的复制模塑
    1. 将固化的PDMS弹性体从培养皿上剥离（图2E）。
    2. 使用扁平电缆切割器切下每一块PDMS通道块（图2F）。
    3. 将PDMS弹性体放置于切割垫上，使通道面朝上。使用活检打孔器在通道两端各打一个孔（图2G）。
    4. 用透明胶带清洁PDMS通道表面，然后用另一段透明胶带包裹PDMS树脂，以保持其清洁待用。将制备好的PDMS通道储存于洁净的培养皿中。
      注：此步骤可暂停。

3. 飞升微腔阵列装置的组装

  1. 在培养皿内壁放置若干块浸过水的洁净擦拭布，以制成简易的加湿腔。将覆盖有透明胶带的PDMS树脂放入加湿腔中，并用封口膜密封腔体。孵育至少3小时，但不超过一天。
    注意：PDMS是一种多孔材料，允许气体透过树脂39。PDMS的多孔结构会从周围环境中吸收水分子直至达到平衡。此预处理步骤可使水蒸气填充PDMS的孔隙，显著抑制靠近PDMS通道边缘的水相液滴的蒸发。
  2. 从PDMS树脂上取下透明胶带。将PDMS通道对准并放置于基底的微腔阵列区域（图2H）。
    注意：PDMS树脂与CYTOP表面之间具有可逆粘附性。若PDMS树脂与基底之间存在气泡，可用镊子轻轻按压PDMS块以排除气泡。
  3. 将一支200 μL未滤芯的移液枪头插入PDMS通道的一个孔中（作为出口）。
    注意：PDMS与CYTOP之间的粘附强度有限。为避免PDMS树脂发生物理形变或PDMS通道从表面脱落，请勿将移液枪头插入过深。

4. 将反应溶液加入组装好的装置

  1. 将一个铝制微量离心管架放在冰上。在铝架上的1.5 mL微量离心管中预冷冲洗油（ASAHIKLIN AE-3000油与0.1 wt % SURFLON S-386表面活性剂的混合物）。
  2. 将另一块铝块放在冰上。
  3. CFPS反应溶液的制备
    1. 在PCR管中配制CFPS反应溶液。混合CFPS试剂盒的每一种组分以及稀释后的模板DNA（本文以荧光蛋白mNeonGreen为例）40 和 大肠杆菌 碱性磷酸酶41) 溶液以及其他必要组分，具体根据实验需求添加（例如RNase抑制剂、荧光底物、分子伴侣）。
      注意：用于无细胞蛋白表达系统（CFPS）的模板DNA必须根据相应CFPS试剂盒的说明书进行制备。本实验采用基于T7的表达系统。42由于FemDA装置中的试剂消耗量非常小，10 μL已足以充满整个PDMS通道。
    2. 为合成mNeonGreen荧光蛋白，请按以下顺序混合组分：加入2.7 μL无核酸酶水2向6 μL溶液A（来自CFPS试剂盒）中加入0.3 μL RNase抑制剂；加入1.5 μL稀释的模板DNA溶液；短暂混匀后，将混合液转移至4.5 μL溶液B（来自CFPS试剂盒）中。
      注意：总体积为15 μL。由于每份等分试样的量与最终混合物的总体积成正比，若总体积小于10 μL，可能导致体积过小（< 0.2 μL 的某些组分等分试样。
    3. 用于碱性磷酸酶合成时，按以下顺序混合组分：加入 1.2 μL H2加入0至6 µL溶液A；加入0.3 µL RNase抑制剂；加入0.6 μL二硫键增强剂1和2（来自试剂盒）；加入0.3 μL 5 mM 6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸盐（DiFMUP）；加入1.5 μL DNA溶液；短暂混匀后，将混合物转移至4.5 μL溶液B中。
      注意：在碱性磷酸酶检测中，荧光底物DiFMUP在酶切去除末端磷酸基团后，可产生高荧光性的6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素（DiFMU）。
  4. 使用200 μL非滤芯枪头吸取10 μL混合液。将枪头插入PDMS通道的进样孔（参见步骤3.3）。按压移液器推杆，将溶液注入通道，直至液体从出口端溢出（出口端已在步骤3.3中插入另一枪头）。
  5. 将移液器与吸头分离，并使这两个吸头仍保留在入口和出口中。
    注意：移液过程中避免产生气泡。在将移液器与移液头分离之前，切勿松开拇指，以防止溶液回流至PDMS通道内。

5. 为无细胞蛋白合成生成飞升液滴阵列（FemDA）

  1. 将组装好的整个装置转移至预冷的铝块中（参见步骤4.2）。仔细确认微腔阵列区域迅速由半透明（图2I）变为透明（图2J）。
    注意：CFPS反应溶液无法直接进入微腔。气体在水中的溶解度与温度成反比。当装置从室温转移至低温环境时，被困在微腔中的空气会逐渐溶解于溶液中。透明度的变化可作为直观的视觉指示，用于判断溶液是否已进入微腔。
  2. 吸取30 μL预冷的冲洗油（参见步骤4.1），立即从移液枪头顶部开口处将油转移至已插入入口的枪头中。冲洗油进入通道后，会将微腔外部多余的反应溶液排出。每个微腔均被冲洗油隔离。
    注意：反应溶液与冲洗油之间的移动界面清晰可见，有助于观察通道内液体的流动情况。被排出的溶液可收集回原管中，于4 °C保存，用于后续的FemDA装置或平行的体相反应（在微量离心管或微孔板中）。
  3. 预先吸取30 μL密封油（Fomblin Y25）至一支200 μL带滤芯的移液枪头中，并将移液枪垂直悬挂放置。
  4. 同时将两个已插入的移液枪头（参见步骤3.3和4.4）从装置中取出。立即将装置从铝块转移至石蜡膜上。
    注意：在取出移液枪头的过程中，使用镊子固定装置（但避免接触通道区域）于铝块上。
  5. 立即将装有密封油的移液枪头（参见步骤5.3）插入PDMS通道的入口，并向通道内注入油，直至油从出口溢出。
    注意：在将装置转移至室温后应立即执行此步骤。为防止通道内液体回流，在密封油从出口溢出前不要松开拇指。冲洗油一旦从通道出口溢出便会迅速蒸发，而后续的密封油因其极低的蒸发损失会在出口处积聚。
  6. 将移液枪与枪头分离，随后将枪头从装置上取下。使用干净的擦拭纸清洁PDMS表面，并分别在入口和出口处各添加一滴新的密封油。微升体积的液滴由此被油封于各个独立的微腔中。
    注意：在移除移液枪头的过程中，使用镊子固定PDMS通道于基底上（但避免接触通道区域）。
  7. 擦除盖玻片下表面聚集的水分。至此，制备完成的FemDA装置即可用于孵育及显微成像。

6. 显微成像

  1. 启动倒置荧光显微镜，等待相机稳定（冷却）。使用60倍或100倍油浸物镜。将FemDA装置置于电动载物台上，并设置成像参数。
    注意：成像参数包括文件路径、成像通道、滤光片、曝光时间（通常100 ms已足够；也可根据相机性能选择更短或更长的曝光时间）以及光照强度。
  2. 确定焦平面。调节物镜的z轴位置，并使用内置的自动对焦系统固定焦平面。设定待成像的感兴趣区域（ROI；即x、y轴范围）。
    注意：主要显微镜制造商（Nikon、Olympus、Zeiss、Leica）均提供将自动对焦系统与显微镜集成的选项。在自动多区域成像过程中，该自动对焦系统对于保持焦平面恒定至关重要。ROI应覆盖PDMS通道内的FemDA区域。
  3. 采集荧光图像。对每个ROI采集一帧离焦的明场（BF）图像。在对不同通道成像时，不得更改ROI的顺序和坐标。

7. 图像数据分析

注意：使用基于 Fiji（http://fiji.sc）开发的自制插件（名为“FemDA”）分析图像数据，以提取每个液滴的荧光强度43。根据操作系统安装正确版本的 Fiji。Fiji 使用内置插件“Bio-Formats”支持大多数图像文件格式（例如尼康显微镜的 nd2 文件、蔡司显微镜的 czi 文件）。

  1. 插件安装
    1. 将插件文件（可通过联系通讯作者获取，或通过以下机构链接获取：https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ）复制并粘贴到 Fiji 的“plugins”文件夹中。
    2. 启动 Fiji 软件；插件“FemDA”可在 Fiji 的下拉菜单“Plugins”中找到。
  2. 图像数据预处理
    1. 打开失焦的明场图像（见步骤 6.3）。点击 Process | Subtract Background… 以去除图像数据每一帧中的平滑连续背景（图 4B）。点击 Process | Filters | Median 以降低图像数据每一帧的噪声（图 4C）。
    2. 点击 Image | Adjust | Threshold，以检查并分离图像数据每一帧中的前景（表示微腔）与背景（表示微腔外区域）（图 4A-C 中的放大插图）。
      注意：在 Threshold 窗口的下拉列表中选择合适的算法，使得仅微腔区域以及每个微腔的边缘可被识别并作为前景高亮显示。特别地，大多数高亮边缘必须连续无间隙。
  3. 液滴坐标确定
    1. 点击 Plugins | FemDA | FemDA Analysis，打开自定义插件的图形用户界面（GUI）（图 4D 上半部分）。
    2. 输入单个微腔的大致最小和最大像素数。输入微腔预期的最小和最大圆度（0：任意形状；1：完美圆形）。输入起始帧和结束帧的帧号。
    3. 在 GUI 上点击 Generate ROI 以检测每个微腔，成功检测到的 ROI 将在弹出窗口 ROITable 中显示。
    4. 返回 FemDA Analysis 窗口，点击按钮 Apply ROI mask，检查各帧中的微腔是否被正确检测（图 4D 左下部分）。若否，调整部分参数并重复点击 Generate ROI 和 Apply ROI mask；若是，则进入下一步。
      注意：由于前景与背景之间对比度不足，可能有极少数微腔无法通过任何 Threshold 算法被良好识别为 ROI（见 图 4D 下半部分）。从统计学角度看，这并不构成问题。
  4. 荧光强度提取
    1. 打开荧光图像并将其置于前端。再次点击 Apply ROI mask，将已确定的 ROI 应用于荧光图像（图 4D 右下部分）。
    2. 选择 One-Shot 以分析终点图像（以 mNeonGreen 数据为例），或选择 Time-Lapse 以分析时间序列数据（以碱性磷酸酶数据为例）。
    3. 在 Number of top pixels 框中输入 100，表示仅使用每个 ROI 中强度最高的 100 个像素来计算相应液滴的平均强度。若在 Number of top pixels 中输入 0，则使用每个 ROI 中所有像素来计算相应液滴的平均强度。
      注意：明场图像与荧光图像之间可能存在数个像素的漂移，这意味着部分 ROI 内的像素可能属于荧光图像的背景。因此，该插件提供选项，允许指定用于计算每个液滴平均强度的最高强度像素数量。
    4. 对于终点图像的分析（即在步骤 7.4.2 中选择 One-Shot），点击按钮 Measure intensity 以计算所有检测到的液滴的平均强度。ROITable 将更新为来自荧光图像的新数据。同时，一个新的弹出窗口 Histogram 将显示直方图（图 4E）。
      注意：在 Bin Number 框中调整 bin 大小可优化直方图的显示效果。可在开发的 GUI 中对直方图进行高斯分布叠加拟合。Fiji 的弹出日志窗口将显示拟合结果。或者，点击 save as text 按钮导出数据，并使用其他软件进行各种统计分析（图 4F, G）。
    5. 对于时间序列图像的分析（即在步骤 7.4.2 中选择 Time-Lapse），弹出窗口为 Intensity Time Course 而非 Histogram，其中包含对应特定时间点的直方图和时间-强度曲线图（图 5）。也可通过弹出窗口的 File 菜单导出文本数据。

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结果

微加工工艺包括基底清洗、表面功能化、CYTOP 涂覆、光刻、干法刻蚀、光刻胶剥离以及最终清洗。重要的是，本方案实现了在微腔内完全去除疏水性 CYTOP 聚合物（图 3A），从而在标准盖玻片基底上形成高度平行的亲水-疏水结构。借助油封方案，通过在微腔中包封荧光溶液验证了所生成液滴的均匀尺寸（图 3B）。利用所开发软件提取的荧光强度是液滴尺寸的良好指标。荧光强度的变异系数（CV）为 3%，反映了整个阵列中液滴尺寸分布狭窄（图 3C）。由共聚焦显微镜重建的三维图像也显示液滴体积在时间上的稳定性（图 3D，补充影片 1）44。相比之下，广泛使用的 FC-40 油所产生的液滴其荧光强度差异可达数倍45。FemDA 中形成的液滴在室温下至少可稳定维持 24 小时（

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讨论

基于 FemDA 中高度均一、稳定且具有生物相容性的液滴所实现的高定量测量，使得离散分布成为可能，这是本研究区别于其他研究的独特特征。本文系统优化并详细描述了微加工和液滴形成过程。在 established protocol 中包含若干关键步骤。

首先，在矩形薄玻璃基板上均匀涂覆高黏度的 CYTOP 聚合物，很大程度上决定了最终基板的质量。鉴于高倍物镜的通常工作距离较短（见步骤 6.1），必须使用薄盖玻片。在薄而柔性的基板上实现高质量的旋涂通常较为困难。我们尚未测试所有可能的设计，但发现使用具有相同矩形尺寸的多孔真空卡盘在旋涂过程中效果良好。将 CYTOP 聚合物滴加在盖玻片基板中心后，应立即开始旋涂（见步骤 1.3.2）。操作难度主要与聚合物的黏度有关，而与基板形状关系较小。CYTOP 产品线提供多种不同浓度的市售包装，包装中附带的稀释剂也可用于将原液稀释至更低的黏度。本实验所用的 CYTOP 816 是市售产品中浓度最高、可在溶剂中稳定溶解聚合物的型号。若需更厚的涂层，可采用较低的旋涂速度，或进行多次涂覆与固化。当在新环境中使用新的旋涂仪时，强烈建议绘制特征厚度与旋涂速度的关系...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目（编号 JP18K14260）以及日本海洋研究开发机构（JAMSTEC）预算支持。我们感谢出水茂裕（Shigeru Deguchi，JAMSTEC）和池田哲朗（Tetsuro Ikuta，JAMSTEC）提供表征设施。我们感谢高井研（Ken Takai，JAMSTEC）在商业软件支持方面的帮助。微加工实验在东京大学武田先端洁净室（Takeda Sentanchi Supercleanroom）完成，该设施获得以下支持： "纳米技术平台项目" 日本文部科学省（MEXT）资助项目编号 JPMXP09F19UT0087。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷Sigma-Aldrich440140
1 mL 注射器TerumoSS-01T
2-丙醇关东化学EL 级EL：用于电子行业。
三维激光扫描共聚焦显微镜LasertecOPTELICS HYBRID其他类似显微镜（例如 Keyence VK-X1000、Olympus LEXT OLS5000）也可使用。
50 mL 注射器TerumoSS-50LZ
6,8-二氟-4-甲基伞形磷酸酯Thermo Fisher ScientificD6567用二甲基亚砜配制 5 mM 储存液
丙酮关东化学EL 级EL：用于电子行业。
纯度 99.8%。
气吹仪HozanZ-263
铝块BIO-BIKAB-24M-02
铝制微量离心管架BIO-BIKAB-136C
ASAHIKLIN AE-3000AGC(测试样品)向 AGC 咨询可获取免费测试样品。
BEMCOT PS-2 擦拭纸Ozu028208
带推杆的活检打孔器KaiBPP-10F
盖玻片松内玻璃No. 1 (24 mm × 32 mm，厚度 0.13~0.17 mm)可按尺寸定制。
盖玻片染色架中村803-131-11
CRECIA TechnoWipe 清洁擦拭纸日本纸业 CreciaC100-M
切割垫GE HealthcareWB100020
CYTOPAGCCTL-816AP
脱泡混合器ThinkyAR-100
台式切割机RolandSTIKA SV-8
显影液AZ 电子材料AZ 300 MIFAZ 电子材料现已被默克收购。
其他碱性显影液也可使用，但需优化显影条件（时间、温度等）。
双面胶聚酰亚胺薄膜胶带寺冈精工7602 #25
乙醇关东化学EL 级EL：用于电子行业。
纯度 99.5%。
Fiji版本：ImageJ 1.51n
扁平电缆切割器东京 IDEALMT-0100
氟化油 FomblinSolvayY25 或 Y25/6向 Solvay 咨询可获取免费测试样品。若 Y25 不易获得，Y25/6 可作为替代品。
加热板AS ONETH-900
注射针头TerumoNN-2270C22G × 70 mm
倒置荧光显微镜尼康Eclipse Ti-E需具备落射荧光功能、CCD 或 sCMOS 相机、电动载物台、自动对焦系统和高数值孔径物镜。
KaleidaGraphSynergy版本：4.5
掩模对准器SUSSMA-6只要具备真空接触模式，其他掩模对准器也可使用。
MICROMAN 移液器GILSONE M250E毛细管活塞吸头：CP250
Microsoft ExcelMicrosoft版本：16.16.15
小型真空腔室AS ONEMVP-100MV
无核酸酶水日本基因316-90101
Parafilm 封口膜AmcorPM-996
PCR 管日本遗传学FG-021D/SP
培养皿AS ONEGD90-15直径 90 mm，高度 15 mm。
光刻胶AZ 电子材料AZ P4903AZ 电子材料现已被默克收购。AZ P4620 可作为替代品。
酶标仪BioTekPOWERSCAN HT
聚乙烯手套AS ONE6-896-02商品名：Saniment。
PURExpress 体外蛋白质合成试剂盒新英格兰生物实验室E6800S 或 E6800L用于无细胞蛋白质合成反应。
反应离子刻蚀系统SamcoRIE-10NR其他 RIE 系统也可使用，但需优化刻蚀条件（气体流速、腔室压力、射频功率、刻蚀时间等）。
RNase 抑制剂新英格兰生物实验室M0314S
透明胶带3M810-1-18D
氢氧化钠溶液富士胶片和光纯药194-09575浓度 8 M；有危险性。
旋涂仪OshiganeSC-308
SURFLON S-386 表面活性剂AGC(测试样品)向 AGC 咨询可获取免费测试样品。
SYLGARD 184 硅橡胶弹性体陶氏Sylgard184化学成分：聚二甲基硅氧烷。默认混合比例为基料 : 固化剂 = 10 : 1（质量比）。
镊子Ideal-tek2WF.SA.1
2A
超声波清洗机AS ONEASU-2M
真空吸盘Oshigane(定制)材质：聚甲醛；带多个孔的矩形样品台（48 个孔，每个孔直径 1 mm）；尺寸根据盖玻片（24 mm × 32 mm）定制。

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