在小鼠中进行结肠镜引导下的钳取活检及后续组织变化评估

摘要

本文详细描述了在小鼠中进行结肠镜引导下钳取活检并实时追踪伤口闭合过程的操作步骤。此外，还提供了用于对伤口床进行组织学、免疫组织化学及分子学分析的组织制备方法。

摘要

研究胃肠道（GI）系统疾病时，了解急性损伤反应以及伤口愈合过程中发生的组织和细胞变化至关重要。小鼠结肠钳夹活检模型是定义这些过程的有效工具，此外还可用于研究肠道腔内容物（如微生物）与结肠之间的相互作用。然而，伤口的诱导以及以可靠方式随时间追踪伤口闭合情况可能具有挑战性。而且，为了充分分析组织学和分子层面的变化，组织制备和定向必须以标准化的方式进行。本文介绍了一种详细的方法，通过重复结肠镜检查来描述活检诱导的损伤及伤口闭合的监测。该方法可确保对伤口大小进行一致且可重复的测量，能够采集伤口床组织用于分子分析，并在组织切片后实现对伤口床的可视化观察。成功实施这些技术，有助于开展针对结肠内急性损伤反应、伤口愈合以及腔内-宿主相互作用的研究。

引言

胃肠道（GI）是一个复杂的器官系统 ，因其具有多种功能、多种宿主细胞类型（例如上皮细胞、免疫细胞、基质细胞等）以及数以万亿计的微生物。鉴于其复杂性，胃肠道疾病通常涉及上述所有因素之间的相互作用。例如，炎症性肠病（IBD）与胃肠道内炎症与缓解周期相关，涉及炎性细胞的活化、菌群失调以及上皮修复^{1,2,3,4,5,6,7}。建立合适的模型系统以研究IBD及其他胃肠道炎症性疾病，对于阐明疾病的发病机制至关重要。目前已有多种模型用于研究IBD的发病机制，包括基因工程小鼠以及在啮齿类动物中使用葡聚糖硫酸钠（DSS）等化学物质^8,9,10。这些模型的局限性包括难以精确控制炎症的诱导过程，以及在评估伤口愈合方面存在困难。因此，开发能够模拟IBD发病机制某些方面的替代方法，可能有助于新疗法的研发。

小鼠结肠镜引导下的钳取活检为研究结肠中炎症反应的发病机制、伤口愈合以及宿主与微生物的相互作用提供了一个有用的模型系统。该方法最早于2009年作为实验工具被使用，证明了其在研究肠道急性炎症反应和伤口愈合中的实用性¹¹。随后的研究利用该技术评估了不同信号通路以及肠道微生物群在结肠伤口愈合中的作用^{11,12,13,14,15,16,17,18}。最近，我们课题组利用该模型研究了鞘氨醇-1-磷酸信号通路和细菌在结肠损伤急性反应中的重要性¹⁹。尽管该方法具有实用性，但在小鼠中实施结肠镜引导下的钳取活检并评估后续组织变化在技术上仍具挑战性。例如，诱导损伤时可能发生肠穿孔，且通过连续结肠镜检查对创面床进行一致测量较为困难。此外，正确地定向结肠组织以在组织学或免疫组织化学分析中清晰观察创面床也存在挑战。尽管目前已有一些关于这些方法的信息^18,20，但提供配有视觉辅助的精确分步操作说明，有望提高该模型的可靠性和广泛应用性。本文中，我们详细介绍了一种在小鼠中实施结肠镜引导下钳取活检的方法，可随时间追踪伤口闭合情况，并制备组织以进行创面床的组织学和分子分析。建立标准化的操作流程，有助于扩展该模型的应用，以研究此前尚未被探索但可能在胃肠道炎症和伤口修复中具有重要作用的介质。

方案

本研究所述所有操作程序均经威尔康奈尔医学院机构动物照护与使用委员会批准。” 更新为：“本研究所述所有操作程序均经威尔康奈尔医学院和石溪大学机构动物照护与使用委员会批准。

1. 结肠镜检查与伤口诱导

1. 预先组装内窥镜的各个部件，首先将1.9 mm刚性内窥镜插入鞘管中（图1A-B）。使用提供的管路将气泵（用于提供结肠充气）连接至鞘管左侧工作通道旁的气体阀图1C).
   注意：尽管此处描述的镜头为0°，但也可使用30°镜头完成此操作。
2. 确保工作通道处于打开状态，将3 Fr活检钳经工作通道插入，并向前推进至鞘管末端（同时确保其不伸出鞘管外）图1C）。根据制造商的说明，将组装好的内窥镜连接至光源和视频成像设备。
3.  在诱导室中使用5%异氟烷与氧气对小鼠进行麻醉。随后将小鼠转移至带有加热系统（防止低体温）的内镜检查平台，仰卧位固定，并通过鼻罩以2%异氟烷与氧气维持麻醉状态。在小鼠眼睛处涂抹兽医用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。通过轻捏后肢足部检测反射，确认小鼠已完全麻醉。
   注：任何品系或任一性别 小鼠可采用此技术；然而，建议小鼠至少为8周龄，以便体型足够大，适合进行该操作。
   1. 麻醉期间在眼部涂抹眼膏以防止干燥。
   2. 通过轻轻捏压小鼠后肢足部以检测反射，确保小鼠已完全麻醉。
4. 用3 mL注射器吸取室温磷酸盐缓冲液（PBS），注射器前端连接大鼠灌胃针。将针头轻轻插入小鼠肛门约1 cm，缓慢注入PBS以清除粪便物质。注入的PBS应带动数粒粪便一同排出小鼠体外。
   注意：注入过量 PBS 可能导致管腔内形成泡沫，从而影响管腔观察。
5. 将组装好的内窥镜插入小鼠肛门内0.5 cm处。推进活检钳进入直肠腔，直至钳子的整个“钳口”（包括铰链部位）完全超出鞘管末端（通过视频监视器观察确认）。补充视频 1）。将镊子旋转90°，使镊尖朝向东-西方向打开（补充视频 1).
6. 进行活检时，打开活检钳并向前推进约1 cm，闭合活检钳，然后在保持闭合状态下，快速平稳地向后回拉活检钳补充视频 1).
   1. 进行活检时应避免过度充气扩张结肠。因此，此步骤中应保持气体阀门右侧开放；但需注意，当钳子打开时，若结肠处于此状态，存在损伤黏膜的风险。

2. 观察并测量创面床

1. 活检后立即踩下结肠镜记录设备上的脚踏板，开始视频录制。通过用食指用力按压气体阀门右侧，完全覆盖开口，将气体强制送入内窥镜，进而充入结肠，实现结肠充分充气。
   注意：尽管本方案描述的是使用手动控制气流的气泵，也可使用带有可控气源的蠕动泵。
2. 在保持活检钳闭合状态下，将其从鞘管中向后退出并进入直肠腔内（补充视频 1）。将活检钳置于伤口正上方的直肠壁处，直至钳头基部与视野顶部边缘对齐（图 2 & 补充视频 1）。持续充分充气，直至能够清晰观察到伤口。
   注意：为确保每次检查小鼠时内窥镜镜头与病灶之间距离一致，应小心地将活检钳伸出足够长度，仅使钳头部分（至基部）可见 （图 2，白色箭头）。
3. 若在同一天对多只小鼠进行活检，在对下一只小鼠造伤前，需使用提供的清洁刷将前一只小鼠的活检组织从活检钳上清除，并用70%乙醇擦拭镜头鞘管以清洁。
   注意：尽管本方案描述的是每只小鼠仅进行一次活检，但只要在每次活检后及时清除活检钳上的组织，即可在同一小鼠上进行多次活检，以确保后续活检取样完整。
4. 操作完成后，将小鼠放入无其他小鼠的笼子中，并置于毛巾上以保持呼吸道通畅，直至其从麻醉中恢复。需监测小鼠，确保其恢复活动能力，表明已从麻醉中苏醒。
   注意：在第0天诱导伤口并观察创面时需要两人配合（一人操作内窥镜，另一人操作活检钳）；但在后续各天观察伤口时仅需一人即可（如下所述）。
5. 在后续时间点进行伤口测量时（通常 为活检后第2、4、6天），按照上述1.1–1.4节所述方法对小鼠和结肠镜检查进行相同准备，但无需再次诱导伤口。
6. 插入内窥镜后，在视频监视器上定位创面，并将处于闭合状态的活检钳推进至创面正上方，充气扩张结肠并开始视频录制，具体操作如2.1和2.2节所述（图 2）。
   注意：活检6天后可能较难定位创面。
7. 在后续各天推进活检钳进入肠腔的距离应与第0天相同，以确保内窥镜镜头与病灶之间的距离在不同时间点保持一致。保持镜头与病灶间距离的一致性将提高随时间变化的测量准确性。
   注意：在这些时间点的测量可由一人独立完成（右手操作内窥镜，左手推进活检钳）。
8. 所有测量完成后，在支持从视频生成静态图像的视频编辑软件中打开系列结肠镜视频文件。
9. 将视频推进至一个可清晰观察创面、闭合的活检钳位于创面上方并与直肠壁接触、且肠壁紧绷的帧画面。截取该帧图像，并对文件名进行编码，以确保后续创面测量在盲法条件下进行。
10. 使用NIH ImageJ软件打开带有编码文件名的图像，以量化创面大小。在分析选项卡下，选择设置测量值，并勾选面积选项。
    1. 从主菜单栏选择自由选择工具，围绕创面绘制边界（见图 2）。在分析选项卡下选择测量，测量值将自动显示在结果窗口中。
11. 完成所有图像测量后，在结果窗口中点击文件选项卡下的另存为，将文件扩展名更改为电子表格格式，导出结果。
12. 在电子表格中计算伤口诱导后各时间点（即第2、4、6天）创面大小相对于第0天（造伤后立即测量）的百分比。具体方法为：将每一天的创面大小除以第0天的大小，并将结果转换为百分比。
    注意：在正常条件下使用该结肠镜观察方法时，创面闭合最显著发生在前2天内（大小减少约75%），第4天和第6天闭合速度逐渐减缓（大小分别减少约80%和约95%）。

3. 用于分子分析的伤口床采集

1. 在活检后的选定日期，采用 CO₂ 窒息法对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位（或等效技术）。
2. 切开皮肤和腹肌以暴露体腔，取出结肠远端。将闭合的剪刀置于结肠下方，轻轻提起以分离其下方的肠系膜，然后在结肠中点及肛门处剪断，将结肠从鼠体中移除。
3. 使用连接20 mL注射器的鼠用灌胃针，以预冷的1×PBS冲洗肠腔内容物，随后将结肠平铺于滤纸上。
4. 在滤纸上沿纵轴剪开结肠，确保肠系膜面朝下紧贴滤纸。当组织仍在滤纸上时，用压滴管将0.2%亚甲蓝溶液滴加至黏膜表面，随后去除多余染液。在解剖显微镜下观察结肠，定位伤口床（图3A）。
5. 使用4英寸微型虹膜剪，在伤口床边缘周围进行剪切（图3A，虚线圆圈），注意避免切透肌层（除非需要保留肌层），然后用精细镊子将分离的伤口床转移至管中，进行速冻或按所需方式储存。
   注意：以此方法获取的组织量足以用于提取RNA，进行RNA-seq或等效分析。

4. 组织样品的制备以用于组织学分析

1. 处死小鼠，并按照步骤 3.1–3.2 所述方法取材结肠。
2. 将结肠沿纵轴在滤纸上剪开，确保肠系膜面朝下紧贴滤纸。使用压头滴管轻轻滴加 4% 多聚甲醛（或其他选择的固定剂），并用封口膜覆盖组织。将滤纸平放于密封容器中，固定 4–6 小时。
3. 将组织转移至 70% 乙醇中保存。当准备处理组织时，移除封口膜，并在滤纸上的组织黏膜面使用压头滴管滴加 0.2% 亚甲蓝溶液，随后吸除多余的亚甲蓝。
4. 在解剖显微镜下观察结肠，定位伤口床（图 3A）。使用带有 #10 刀片的手术刀，直接穿过伤口床中心进行切割，并沿直线继续切开结肠其余部分，使结肠沿长轴被完全切成两半（图 3A，黑色线条）。
5. 对结肠组织进行处理后进行石蜡包埋（可选择切割后保留的一侧或两侧组织），确保手术刀切割的一侧（即分割前伤口床的中心侧）朝下置于石蜡中。随后进行切片，并根据需要进行相应的染色。
6. 若特定染色需要冰冻切片，请按照步骤 3.1 所述方法取材结肠，并在滤纸上沿纵轴剪开，确保肠系膜面朝下紧贴滤纸。
7. 在新鲜取材的结肠中，按照步骤 4.5 所述方法将伤口床一分为二，并将结肠组织（可选择切割后保留的一侧或两侧）包埋，确保手术刀切割的一侧朝下，置于已半充满组织冷冻介质的底模中。
8. 用精细镊子固定组织，将底模放置于干冰上的金属板上，使冷冻介质硬化。当介质底部冻结（且组织已固定到位）后，松开镊子，向底模剩余空间加满冷冻介质，再放回干冰上。
   1. 待整个冷冻介质体积完全冻结后，转移至 -80 °C 超低温冰箱中保存，直至切片。
9. 对于石蜡切片或冰冻切片，在进行特异性染色前，应额外切片并进行 H&E 染色，以确认切片中已包含伤口床。图 3B 展示了一个可清晰观察到伤口床的切片示例。

结果

进行活检所需的微小器械（镜头、套管、活检钳）如图1所示，并附有这些组件正确组装的指示。 图2展示了伤口床可接受视野的代表性图像，用于准确量化伤口床的大小及伤口闭合速率。 图3A显示了伤口床离体观察的示例图像，包括伤口床周界的标记（指示用于分子分析的组织切除区域）以及组织切开位置的指示，以便在切片后能够清晰观察伤口床。 图3B展示了苏木精-伊红（H&E）染色切片的代表性图像，其中可清晰观察到伤口床。 补充视频1提供了从小鼠结肠内部观察活检过程的视角。

讨论

在该模型中，为了有效评估伤口闭合速率，确保活检的一致性和准确性以及伤口尺寸测量的精确性至关重要。因此，应采取多项措施以确保操作正确实施。首先，活检的深度既不能过浅也不能过深。若过浅，则无法提供足够的观察窗口来评估伤口闭合情况。图2展示了第0天理想的活检深度和大小。请注意伤口床周围黏膜与伤口床下方残留组织之间的清晰界限（图2）。若活检过深，则可能发生穿孔，导致小鼠无法用于评估。在第0天活检后进行充气时，若小鼠腹部明显膨胀，则表明已发生穿孔，该小鼠不应继续用于实验，应实施安乐死。为提高一致性，建议由同一操作人员完成同一研究中的所有活检操作。其次，必须确保活检部位位于直肠内，而非更近端的结肠区域。由于直肠壁比结肠近端区域更厚，因此在此处操作可显著降低穿孔风险。应在鞘管外侧距末端0.5 cm处做一标记，并仅将内窥镜插入至该标记处，以确保活检钳不会超出直肠范围。第三，在活检过程中以及观察伤口床时，维持适当的充气量至关重要。活检期间，若结肠过度膨胀，则肠壁会过于紧张，导致可用于取样的黏膜不足。因此，建议操作内窥镜者不要将食指压在气...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
活检钳，3 Fr	Karl Storz	61071ZJ
Coloview 塔式系统	Karl Storz	contact company
检查鞘，9 Fr，套件	Karl Storz	61029DK
Hopkins 望远镜，0'，1.9 mm × 10 cm	Karl Storz	64301AA
异氟烷	Covetrus	2905
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	M9140
微型虹膜剪刀	Integra	18-1619
NIH ImageJ	NIH	N/A	可从以下网址免费下载的软件：https://imagej.nih.gov/ij/
Pawfly MA-60 水族泵	Amazon	N/A
带 #10 刀片的手术刀	Hill-Rom	372610