本文介绍一种在体外从感觉神经和运动神经中纯化成纤维细胞和施万细胞的方法。
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本文内容
摘要
摘要
周围神经系统中的主要细胞是施万细胞（SCs）和成纤维细胞。这两种细胞在神经营养因子基因表达及其他生物学过程中表现出明显不同的感觉和运动表型，从而影响神经再生。本研究建立了一种快速获取高纯度大鼠感觉源性和运动源性施万细胞及成纤维细胞的实验方案。分离出生7天大幼鼠的腹根（运动神经）和背根（感觉神经），进行细胞解离后培养4–5天，随后依次联合使用差异消化法与差异贴壁法，分别分离感觉源性和运动源性成纤维细胞及施万细胞。免疫细胞化学和流式细胞术分析结果显示，所获得的感觉源性和运动源性施万细胞及成纤维细胞纯度均>90%。该方案可更快速地获得大量感觉源性和运动源性成纤维细胞/施万细胞，有助于感觉与运动神经再生机制的深入研究。
引言
在周围神经系统中，神经纤维主要由轴突、施万细胞（SCs）和成纤维细胞组成，还包含少量巨噬细胞、微血管内皮细胞和免疫细胞1。施万细胞以1:1的比例包裹轴突，并被一层称为神经内膜的结缔组织所包绕。随后，轴突被聚集成束，形成称为神经束的结构，每个神经束又被一层称为神经束膜的结缔组织包裹。最后，整个神经纤维由一层结缔组织包裹，这层结构称为神经外膜。在神经内膜中，全部细胞群体中施万细胞约占48%，其余细胞中有相当一部分为成纤维细胞2。此外，成纤维细胞是所有神经结构区室的重要组成部分，包括神经外膜、神经束膜和神经内膜3。许多研究表明，施万细胞和成纤维细胞在周围神经损伤后的再生过程中发挥关键作用4,5,6。当周围神经被切断后，神经束膜中的成纤维细胞通过施万细胞与成纤维细胞之间的ephrin-B/EphB2信号通路调控细胞分选，进一步引导轴突穿过损伤部位再生5。周围神经来源的成纤维细胞分泌tenascin-C蛋白，并通过β1-整合素信号通路促进施万细胞在神经再生过程中的迁移7。然而，上述研究中所使用的施万细胞和成纤维细胞均来源于坐骨神经，而坐骨神经同时包含感觉神经和运动神经。
在周围神经系统中，感觉神经（传入神经）将感觉信号从感受器传导至中枢神经系统（CNS），而运动神经（传出神经）则将信号从中枢神经系统传导至肌肉。既往研究表明，施万细胞（SCs）表现出不同的运动和感觉表型，并分泌神经营养因子以支持周围神经的再生8,9。根据最近的一项研究，成纤维细胞也表现出不同的运动和感觉表型，并影响施万细胞的迁移10。因此，探究运动与感觉神经成纤维细胞/施万细胞之间的差异，有助于我们研究周围神经特异性再生的复杂分子机制。
目前，纯化施万细胞（SCs）和成纤维细胞的方法有很多，包括使用抗有丝分裂剂、抗体介导的细胞溶解11,12、连续免疫淘选13以及层粘连蛋白基质法14。然而，上述所有方法均是去除成纤维细胞而仅保留施万细胞。通过流式细胞术分选技术可获得高纯度的施万细胞和成纤维细胞15，但该技术耗时较长且成本较高。因此，本研究建立了一种简便的差速消化与差速贴壁方法，用于纯化和分离感觉神经与运动神经来源的成纤维细胞及施万细胞，以更快速地获得大量成纤维细胞和施万细胞。
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方案
本研究遵循南通大学的机构动物护理指南进行。所有涉及动物实验的操作均由中国江苏省实验动物管理委员会在伦理上批准。
1. 运动和感觉神经成纤维细胞及施万细胞的分离与培养
- 使用中国南通大学实验动物中心提供的七日龄 Sprague-Dawley (SD) 大鼠（n=4）。将大鼠置于含有 5% 异氟烷的容器中麻醉 2–3 分钟，待动物呼吸缓慢且无自主活动后，用 75% 乙醇消毒，随后进行断头处理。
- 用剪刀沿背部皮肤剪开约 3 cm，取出脊柱。小心打开椎管以暴露脊髓。
- 将脊髓置于盛有 2–3 mL 冰冷 D-Hanks 平衡盐溶液（HBSS）的 60 mm 培养皿中保存。
- 根据解剖结构，在解剖显微镜下分离腹根（运动神经），然后分离背根（感觉神经）。随后将其置于冰浴的 D-Hanks 平衡盐溶液（HBSS）中。
- 去除 HBSS 后，用剪刀将神经剪成 3–5 mm 的小段，加入 1 mL 0.25%（w/v）胰蛋白酶，在 37 °C 下消化 18–20 分钟。随后加入 3–4 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 终止消化。
- 用移液器轻柔吹打混合液约 10 次，于 800 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 2–3 mL 含 10% FBS 的 DMEM 中。
- 用 400 目滤网过滤细胞悬液，接种至 60 mm 培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。培养 4–5 天后，当细胞融合度达到 90% 时，分离第 0 代（p0）成纤维细胞和施万细胞（SCs）。
- 施万细胞（SCs）的分离与培养（图 1）
- 用 1× PBS 洗涤细胞一次。每 60 mm 培养皿加入 1 mL 0.25%（w/v）胰蛋白酶（37 °C），室温消化 8–10 秒。随后加入 3 mL 含 10% FBS 的 DMEM 终止消化。
- 用移液器轻柔吹打，使施万细胞脱落。收集细胞并以 800 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，将沉淀物重悬于 3 mL 含 10% FBS、1% 青霉素/链霉素、2 µM 福斯科林（forskolin）和 10 ng/mL HRG 的 DMEM 中，接种至未包被的 60 mm 培养皿中。在 37 °C 培养 30–45 分钟后，成纤维细胞（少量成纤维细胞随施万细胞一同被消化）贴附于皿底。
- 将上清液（含施万细胞）转移至另一经多聚-L-赖氨酸（PLL）包被的培养皿中，于 37 °C 培养 2 天。
- 成纤维细胞的分离与培养（图 1）
- 去除施万细胞后（如步骤 1.8 所示），用 1× PBS 洗涤培养皿中残留的成纤维细胞，每皿加入 1 mL 0.25%（w/v）胰蛋白酶，在 37 °C 下消化 2 分钟。
- 加入含 10% FBS 的 DMEM 终止消化。用移液器吹打成纤维细胞，收集后以 800 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，将沉淀物用 2 mL 含 10% FBS 的 DMEM 重悬，接种至未包被的 60 mm 培养皿中。成纤维细胞在 37 °C 培养 30–45 分钟后贴附于皿底。弃去上清液（含少量施万细胞）。向成纤维细胞培养皿中加入 3 mL 含 10% FBS 的 DMEM，于 37 °C 培养 2 天。
- 当第 1 代（p1）细胞融合度达到 90% 时进行传代，并参照步骤 1.8 和 1.9 所述方法通过差异消化与差异贴壁法再次纯化。
- 将培养 2 天后的第 2 代（p2）成纤维细胞和施万细胞进行消化，收集细胞，计数后以每孔 1 × 105 个细胞的密度接种至经多聚-L-赖氨酸（PLL）包被的载玻片上，用于免疫细胞化学（ICC）检测。
2. 免疫细胞化学法鉴定细胞纯度
- 将细胞在 37 °C 下培养 24 小时，对运动和感觉成纤维细胞及施万细胞进行差异消化和差异贴壁后，进行免疫细胞化学染色。
- 用 1× PBS 洗涤运动和感觉成纤维细胞及施万细胞，然后每孔加入 200 µL 的 4% 多聚甲醛（pH 7.4）在室温下固定 18 分钟。
- 用 PBS 洗涤三次后，施万细胞样品使用含 5% 正常山羊血清和 0.1% Triton X-100 的 0.01 M PBS 封闭缓冲液封闭，成纤维细胞样品使用含 5% 正常山羊血清的 0.01 M PBS 封闭缓冲液在 37 °C 下封闭 45 分钟。
- 弃去封闭液，加入以下一抗：成纤维细胞使用鼠单克隆抗 CD90 抗体（成纤维细胞特异性标志物）（1:1000），施万细胞使用鼠抗 S100 抗体（施万细胞特异性标志物）（1:400），4 °C 孵育过夜。
- 弃去一抗，用 PBS 洗涤三次，然后加入以下二抗：成纤维细胞使用 Alexa Fluor 594 标记的山羊抗小鼠 IgG（1:400），施万细胞使用 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG（1:400），室温孵育 1.5 小时。
- 用 PBS 洗涤三次，加入 5 µg/mL Hoechst 33342 染料在室温下染核 10 分钟。再用 1× PBS 洗涤三次，将样品用封片剂（每片 20 µL）封片于载玻片上。
- 使用共聚焦激光扫描显微镜在每孔中随机选取三个视野拍摄细胞图像。统计细胞核总数、CD90 阳性细胞数和 S100 阳性细胞数，并分别计算 CD90 阳性细胞和 S100 阳性细胞的百分比。实验重复三次。
3. 用于鉴定细胞纯度的流式细胞术分析（FCA）
- 按照先前FCA16所述方法评估运动源和感觉源成纤维细胞及施万细胞的纯度。简言之，用0.25% (w/v) 胰蛋白酶消化第2代运动源和感觉源成纤维细胞及施万细胞，重悬细胞沉淀，并在室温下用固定液孵育15分钟。
- 将细胞分别在穿膜液中孵育后，加入针对成纤维细胞的小鼠单克隆抗CD90抗体（0.1 µg/106 细胞，200 µL）和针对施万细胞的小鼠抗S100抗体（1:400，200 µL），于室温下孵育30分钟。
- 加入488标记的山羊抗小鼠IgG抗体，孵育30分钟。使用FACS caliber仪器进行流式细胞术检测，并用Cell Quest软件分析数据。
- 仅加入488标记的山羊抗小鼠IgG抗体（成纤维细胞组）和小鼠IgG1 kappa [MOPC-21]（FITC）同型对照抗体（施万细胞组）作为阴性对照。
4. 统计分析
- 所有数据均以均值 ± 标准误表示。使用 GraphPad Prism 6.0 软件通过非配对 t 检验评估数据间的统计学差异，统计学显著性设定为 p<0.05。所有实验均重复三次。
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结果
光镜观察
施万细胞（SCs）和成纤维细胞是从神经组织原代细胞培养中获得的两种主要细胞群体。接种1小时后，大多数细胞贴附于培养皿底部，细胞形态由圆形变为椭圆形。培养24小时后，施万细胞呈现双极或三极形态，长度范围为100至200 µm。培养48小时后，细胞出现聚集和增殖现象，许多细胞以首尾相连、肩并肩、漩涡状或栅栏状方式排列。另一种成纤维细胞比施万细胞更大，呈扁平且不规则形状。随着培养时间延长，施万细胞和成纤维细胞的数量逐渐增加。施万细胞成簇聚集于成纤维细胞之间的空隙中，或位于成纤维细胞表面（图2A, 2B）。通过差速消化和差速贴壁法对成纤维细胞和施万细胞进行分离。消化8–10秒后，施万细胞呈圆形且容易被吹打脱落，而成纤维细胞则呈扁平状并牢固贴附于培养皿底部（图2C, 2D）。经过两次差速消化和差速贴壁处理后，成功分离出原代培养的施万细胞和成纤维细...
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讨论
周围神经的两种主要细胞群体包括施万细胞（SCs）和成纤维细胞。原代培养的成纤维细胞和施万细胞可准确辅助模拟周围神经发育与再生过程中成纤维细胞和施万细胞的生理状态。研究表明，P7 大鼠坐骨神经细胞中约含有 85% 的 S100 阳性施万细胞、13% 的 OX7 阳性成纤维细胞，以及仅 1.5% 的 OX42 阳性巨噬细胞13。尽管成纤维细胞数量少于施万细胞，但其初始增殖速率快于施万细胞。因此，阿糖胞苷（Ara-C）是许多研究中用于清除成纤维细胞最常用的抗有丝分裂试剂。然而，Ara-C 并非特异性作用于细胞有丝分裂，它也可抑制施万细胞在活跃分裂阶段的增殖。采用抗体介导的细胞溶解或免疫贴壁法时，成纤维细胞会丢失或死亡。虽然流式细胞术分选技术可同时获得高纯度的成纤维细胞和施万细胞，但该方法需要大量细胞，且细胞回收率仍然较低。据我们所知，本研究首次报道了感觉性与运动性施万细胞及成纤维细胞的纯化方法。
本研究通过依次结合差速消化和差速贴壁的方法，同时获得了大量感觉和运动来源的成纤维细胞及施万细胞（SCs），且对细胞无损伤。免疫细胞化学染色和流式细...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到中国国家重点研发计划（项目编号：2017YFA0104703）和国家自然科学基金（项目编号：31500927）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | 稀释比例：1:400 |
| CoraLite488 标记的 Affinipure 山羊抗小鼠 IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | 稀释比例：1:400 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest 软件 | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's 平衡盐溶液 | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| 体视显微镜 | Olympus | SZ2-ILST | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10099-141C | |
| 佛司可林（Forskolin） | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield 封片剂 | Abcam | ab104135 | |
| 固定液/通透液 | 联科生物技术有限公司（Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD） | GAS005 | |
| 流式细胞术 | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| 小鼠 IgG1 kappa [MOPC-21]（FITC）同型对照 | Abcam | ab106163 | 稀释比例：1:400 |
| 小鼠单克隆抗 CD90 抗体 | Abcam | ab225 | 免疫细胞化学中稀释比例为 1:1000，流式细胞术中每 10µg 对应 106 个细胞 |
| 小鼠抗 S100 抗体 | Abcam | ab212816 | 稀释比例：1:400 |
| 多聚赖氨酸（PLL） | Sigma | P4832 | |
| 重组人 NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF 结构域蛋白 | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) 胰蛋白酶 | Gibco | 25200-072 |
参考文献
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