本文介绍了一种立体定位手术方法，该方法采用倾斜的冠状面入路，可靶向传统方法难以触及的脑区（受限于空间限制）。该方案适用于小鼠和大鼠模型，可广泛应用于多种神经科学研究，包括套管植入和病毒载体的微量注射。
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本文内容
摘要
摘要
立体定位手术是现代神经科学实验室中不可或缺的工具。然而，精确且准确地靶向难以到达的脑区仍然存在挑战，尤其是在靶向中线附近的脑结构时。这些挑战包括避免损伤上矢状窦和第三脑室，以及持续性地靶向特定且独立的脑核团。此外，一些更先进的神经科学技术（例如光遗传学、光纤光度法和双光子成像）依赖于将大量硬件设备植入脑内，而空间限制常常成为实施中的障碍。本文介绍了一种可调整的立体定位手术方案，采用倾斜冠状面入路方式靶向啮齿类动物脑结构。该方案可适用于：1）小鼠或大鼠模型；2）多种神经科学技术；3）多个不同脑区。作为代表性示例，文中包含了为光遗传学抑制实验而靶向小鼠下丘脑腹内侧核（VMN）时立体定位坐标的计算方法。该实验流程首先在Cre依赖型小鼠模型中双侧微量注射编码光敏感氯离子通道（SwiChR++）的腺相关病毒（AAV），随后进行倾斜式双侧光纤套管植入。研究结果表明，激活VMN中特定神经元亚群对于胰岛素诱导低血糖后完整的葡萄糖反调节反应是必需的。
引言
行为、摄食和代谢的神经调控涉及高度复杂、整合且具有冗余性的神经回路之间的协调。神经科学领域的一个核心目标是解析神经元回路结构与功能之间的关系。尽管经典神经科学技术（如损毁、局部药物注射和电刺激）已揭示了特定脑区在调控行为和代谢中的重要作用，但这些技术因缺乏特异性和可逆性而受到限制1。
神经科学领域的最新进展极大地提升了以高时空分辨率、细胞类型特异性方式研究和操控神经环路功能的能力。例如，光遗传学2和化学遗传学3方法能够快速、可逆地调控自由活动动物中基因定义的特定细胞类型的活动。光遗传学技术利用对光敏感的离子通道（称为通道视紫红质）来控制神经元活动。该技术的关键在于将通道视紫红质基因递送至目标细胞，并提供光源以激活视蛋白。常用的基因递送策略包括：1）使用在特定神经元中表达Cre重组酶的转基因小鼠，与2）携带通道视紫红质基因且依赖Cre激活的病毒载体相结合。
尽管光遗传学技术为控制神经元活动提供了一种优雅且高度精确的方法，但该方法的成功依赖于将病毒载体通过立体定位微量注射并准确植入光纤至特定脑区。虽然立体定位操作在现代神经科学实验室中已较为常见（已有多个优秀的实验方案对此进行了详细描述）4,
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方案
所有操作程序均依据美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》获得批准，并已获得华盛顿大学机构动物护理与使用委员会及环境健康与安全部门的批准。
1. 倾斜坐标系的计算
- 使用冠状面脑图谱，标记一个直角三角形，使斜边穿过目标感兴趣区域。在代表性示例中（图1），下丘脑腹内侧核（VMN）的靶向角度为冠状面中线偏转15°。
注意：图 1 中所示旋转轴的位置（即边C的长度）是任意的，可根据需要调整以靶向任意脑区。尽管这看似违反直觉，但本方案后续步骤将调整头部在z轴上的位置，使该点与立体定位旋转中心对齐（见第6节）。然而，由于头固定装置的物理限制，建议冠状面旋转角度不要超过15°。 - 确定所需角度（a）及边B的估计长度，并利用三角函数计算边A和边C的长度。此步骤对于在旋转过程中正确定位头部至关重要。
注意：在 图1 的示例中，使用图谱网格线估算边B的长度，得到其值为7.576 mm。该信息用于计算边A的长度：
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结果
本方案描述了一种用于开展光遗传学研究的手术操作，旨在探究下丘脑腹内侧核（VMN）神经元在血糖调控中的作用9。首先采用标准（非倾斜）立体定位方法，向双侧VMN微量注射抑制性通道视紫红质病毒。尽管倾斜入路同样适用，但本研究选择标准（非倾斜）入路，因其足以精准靶向目标脑区，且操作简便、可靠且可重复。然而，由于VMN靠近中线，空间受限，无法采用非倾斜方式植入双侧光纤，因此必须建立一种手术策略，以精确地以一定角度植入光纤（图6）。
采用这种手术策略，我们将一种表达改良型通道视紫红质阴离子通道并融合荧光报告蛋白的 Cre 依赖性腺相关病毒（AAV），即“SwiChR++”病毒10，双侧微量注射至 Nos1-cre 小鼠的腹内侧下丘脑核（VMN）。随后，在每侧注射位点背外侧、距中线 15° 角的位置植入光纤。结果如预期，病毒表达局限于 VMN，而在其他脑区未检测到表达。
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讨论
神经科学的最新进展加深了人们对脑神经回路活动与功能的理解。这包括应用光遗传学和化学遗传学技术，在活体动物中激活或抑制特定的神经元群体及其投射区域。近年来，这一领域进一步发展出基因编码的钙离子指示剂（例如 GCaMP、RCaMP）以及其他荧光生物传感器（例如多巴胺、去甲肾上腺素传感器），用于在自由活动的动物中记录特定细胞类型的神经元活动。然而，这些技术的有效应用依赖于成功的立体定位手术，以精确靶向目标脑区。尽管已有多种成熟的实验方案可用于靶向多个脑区，但针对中线附近的深部脑区仍面临显著挑战。本文展示了一种通过倾斜立体定位方法靶向特定脑区的详细手术技术。重要的是，该技术可被调整并应用于多种神经科学研究方法（如光遗传学、化学遗传学和光纤光度法）。
采用这种方法，研究显示，急性光遗传学抑制表达神经元型一氧化氮合酶的腹内侧下丘脑神经元（VMNNOS1 神经元）会减弱小鼠胰岛素诱导的低血糖所引发的胰高血糖素反应9。通过略微改进的方法进一步证明，单侧激活 VMNNOS1 神经元可产生两种效应：1）引发显著.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）资助，项目编号为F31-DK-113673（C.L.F.）、T32-GM-095421（C.L.F.）、DK-089056（G.J.M.），美国糖尿病协会创新基础科学研究奖（#1-19-IBS-192，授予G.J.M.），以及由NIDDK资助的华盛顿大学营养与肥胖研究中心（DK-035816）、糖尿病研究中心（DK-017047）和糖尿病、肥胖与代谢培训项目T32 DK0007247（T.H.M）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 光纤套管 | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | 可定制 |
| Kopf Model 1900 立体定位对准系统 | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 中心高度规 | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 对准指示器 | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 立体定位钻孔仪 | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 定位显微镜 | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60度无创耳杆 | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B 小鼠气体麻醉头固定器 | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 微型操纵器 | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 微注射系统 | World Precision Instruments | -- | |
| 小鼠颅骨螺钉 | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| 立体定位套管夹持器，1.25 mm 套管 | Thor Labs | XCL | |
| 手术钻 | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
参考文献
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K.
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