基于共聚焦显微镜的斑马鱼中间神经丘细胞激光消融与再生检测方法

摘要

激光消融是一种广泛适用于研究生物系统再生的技术。本方案描述了如何使用标准的激光扫描共聚焦显微镜对斑马鱼侧线中的中间神经丘细胞进行激光消融，并随后进行再生过程的延时成像。

摘要

毛细胞是介导听觉的机械感受细胞。这些细胞在人类中受损后无法再生，但在斑马鱼等非哺乳脊椎动物中能够自然地得到补充。斑马鱼侧线系统是研究感觉毛细胞再生的一个有用模型。侧线系统由含有毛细胞的器官——神经丘（neuromasts）组成，这些神经丘通过一串中间神经丘细胞（INMCs）连接在一起。INMCs在发育过程中作为前体细胞，产生新的神经丘。INMCs还能够修复因 细胞死亡而在侧线系统中形成的缺损。本文描述了一种利用常规激光扫描共聚焦显微镜和在INMCs中表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼选择性消融INMCs的方法。随后通过延时显微成像监测INMCs的再生过程，并测定缺损闭合的速率。该方法提供了一种无需特殊设备（如高功率脉冲紫外激光器）即可实现细胞消融的便捷实验方案。该消融方案可能具有更广泛的应用价值，因为它可被用于消融其他类型的细胞，且所用工具已为许多研究人员所具备。该技术将进一步促进在不同条件和不同遗传背景下对INMCs再生特性的研究，从而推动对感觉前体细胞再生机制的理解。

引言

大多数进行性听力损失的核心问题是感觉毛细胞的破坏，这些细胞负责将外界听觉刺激转化为大脑可感知的神经冲动。耳蜗毛细胞的死亡会导致永久性听力损失，因为成年哺乳动物在毛细胞受损后无法再生这些细胞。相反，非哺乳动物脊椎动物（如斑马鱼）则能够再生因声学创伤或耳毒性损伤而丢失的毛细胞。斑马鱼的机械感觉侧线是一种结构简单且易于操作的器官系统，可用于研究毛细胞的再生过程^1,2,3。

侧线系统由称为神经丘的小型感觉斑块组成，这些神经丘在发育过程中通过一串细长的细胞（称为中间神经丘细胞，INMCs）相互连接。由于INMCs具有增殖能力，表现出明显的干细胞特性，并能产生新的含毛细胞器官，因此其行为受到研究领域的广泛关注^4,5。目前关于INMCs的大量研究揭示了周围包裹侧线神经的施万细胞对其增殖的抑制作用，这种抑制可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路实现^6,7,8。尽管INMCs的增殖及其向新神经丘分化的调控机制已有较充分的描述，但在细胞被消融后INMCs再生的机制仍不清楚。本实验方案提供了一种消融单个INMCs并分析其后续再生行为的方法。

已有多种方法被发表，用于破坏毛细胞、支持细胞以及完整的神经丘，并伴随有监测其再生过程的技术。化学消融法对毛细胞的清除效果良好，但若要清除侧线系统的其他类型细胞，则需显著提高诸如CuSO₄等有毒化学物质的剂量⁹。虽然在荧光显微镜下进行电消融是研究内耳神经丘细胞（INMC）再生的一种有效且简便的破坏手段，但其靶向范围难以精确控制，因此很可能造成显著的附带损伤。这可能会掩盖INMC特异性行为的某些方面^10,11。激光消融方案也曾被采用，但需要使用特殊设备，而这些设备在普通实验室或成像平台中未必具备（例如高功率脉冲紫外激光器¹²）。本文所述方法则可利用任何配备常见405 nm激光器的激光扫描共聚焦显微镜完成，该激光器通常用于DAPI及其他蓝色荧光染料的成像。该方法的一个优势在于，可在细胞损伤前后立即进行共聚焦成像，无需启用额外的激光控制系统，也无需转移至配备脉冲激光器的其他显微镜设备。

已有类似方法被用于斑马鱼脊髓中神经元的消融¹³。然而，先前的方法需要使用FRAP模块进行细胞消融，而本方案无需该模块。此外，鉴于不同类型细胞具有不同的特性（例如转基因荧光的亮度、在体内的深度以及细胞形态），针对不同细胞类型可能需要进行显著的方案调整。本文详述的方案更适用于位置较表浅的细胞，这一点已通过采用相同方法成功消融感觉毛细胞得到验证。此外，本文还概述了一种再生检测方法，用于评估消融后肠内神经肌间细胞（INMC）的恢复速率，而前述研究并未包含这一检测手段。

本文详细介绍了一种基于激光的细胞消融方案，通过优化激光参数、消融前后的成像以及延时显微镜观察，全面捕捉INMCs的再生能力。这些要素共同实现了对INMC再生及缺损闭合过程的完整呈现。尽管本方案在此用于破坏INMCs，但也可应用于其他需要可靠且高效评估细胞消融效果的研究。此外，该技术具有良好的可及性，可在任何配备405 nm激光器的共聚焦显微镜上实施。

方案

所有动物实验均经佩斯大学机构动物护理和使用委员会根据方案2018-1批准。

1. 斑马鱼幼鱼的制备

1. 在进行实验前3–5天设置交配，以便在进行激光消融时，胚胎的孵化后年龄为2至4天。
   注意：Et(krt4:EGFP)sqEt20（简称为ET20）增强子捕获品系中，中间神经丘细胞被增强型绿色荧光蛋白（eGFP）清晰标记，便于细胞识别与消融^11,14。为验证激光消融的特异性与灵活性，可将ET20鱼与Tg(neuroD:tdTomato)鱼杂交，后者侧线神经被红色荧光蛋白标记，或与Tg(myo6b:βactin-GFP)鱼杂交以用GFP标记感觉毛细胞^15,16。
2. 次日收集胚胎后，将胚胎置于含0.0001%亚甲蓝的E3培养基中，在28.5 °C条件下孵育，直至准备麻醉并固定。

2. 低熔点琼脂糖和三卡因溶液的制备

1. 取一个 250 mL 玻璃锥形瓶，加入 48 mL 1x E3 培养基、2 mL 15 mM 三卡因储备液和 0.5 g 低熔点琼脂糖。
2. 将溶液在微波炉中高火加热 30 秒，然后摇动（佩戴防热手套）以溶解琼脂糖。重复 30 秒加热步骤，直至琼脂糖完全溶解。
3. 将琼脂糖储存于 42 °C 的培养箱中，待用。

3. 斑马鱼幼虫的麻醉

1. 取一个50 mL锥形管，加入24 mL的1× E3培养基和1 mL三卡因储备液（15 mM），使终浓度为600 µM。轻轻旋转混匀。
2. 将8 mL含有600 µM三卡因的E3培养基加入平底细胞培养板的六个孔之一中。
3. 使用移液器将斑马鱼幼鱼转移至底部带有74 µm筛网的转移插件中。
4. 将带筛网的转移插件放入六孔板中含有E3加三卡因溶液的孔中。让幼鱼在孔中静置至少3分钟，或直至完全麻醉。可通过轻敲插件检测麻醉效果：幼鱼不应因敲击而受惊或游动。

4. 麻醉斑马鱼幼虫的荧光筛选

1. 将每孔一个麻醉后的幼虫移至12孔疏水涂层载玻片上，用于筛选。确保各孔中形成的弯月面曲率最小，以减少筛选时的光学畸变。可在放置幼虫后，从每孔中移除少量E3培养基来实现此目的。
2. 在直立显微镜下使用10倍物镜（配备汞弧灯、金属卤化物灯或LED光源以及合适的滤光立方体），筛选在侧线系统的神经丘及神经丘间细胞中表达eGFP的幼鱼。
   1. 选择 eGFP 荧光更强的幼虫，这些幼虫可能为转基因纯合子。
      注意：在ET20品系中，eGFP在每个神经丘周围的一圈外套细胞中表达 以及 连接这些器官的狭窄的神经丘间细胞带。更强的eGFP表达（更亮的荧光）有助于更有效的消融。
   2. 为了检测消融的特异性，使用同时携带 ET20 和 Tg(neuroD:tdTomato) 转基因。如果筛选 Tg(neuroD:tdTomato) 载体，使用RFP滤光片组识别耳部后方明亮的红色区域，该区域代表后侧线神经节。
   3. 为了消融侧线感觉丘中的毛细胞，使用 Tg(myo6b:βactin-GFP) 转基因品系，并在每个神经丘中心筛选GFP定位。
3. 选择具有典型丘状感觉器间距的幼虫。丘状感觉器之间间距的差异可能提示发育过程中感觉器沉积异常，暗示侧线原基的迁移行为或细胞增殖存在缺陷。¹⁷此类缺陷还可能影响INMCs在消融后的迁移或再生行为。
   注意：常见的间距缺陷包括由第一迁移性原基（prim1L1）沉积的最前部神经丘与同一原基沉积的第二个神经丘（prim1L2）之间距离异常增大，通常伴随后部神经丽数量拥挤。

5. 激光消融与成像用幼虫的制备

1. 用移液器将3-4条麻醉后的幼鱼转移到盖玻片底培养皿（直径35 mm，内含14 mm直径1.5号盖玻片）中央的一小滴E3/三卡因溶液中。吸去多余液体，使幼鱼保留在一小滴溶液中，液滴大小以刚好容纳幼鱼为宜。
2. 将培养皿置于体视显微镜载物台上，调节变倍和焦距，使所有幼鱼均位于视野范围内。
3. 从加热培养箱中取出装有低熔点琼脂糖的锥形瓶，用移液管将琼脂糖溶液转移至盖玻片上，形成一层薄层。吸除多余琼脂糖，直至液体刚好填满培养皿底部的凹槽，注意避免吸入任何幼鱼。
4. 使用毛刀或毛环迅速在琼脂糖溶液中排列幼鱼，使其相互对齐，并将头端朝向左侧。
5. 用毛刀轻轻将幼鱼压向玻璃表面，使其以侧卧姿势固定，右侧朝下。超过3天的幼鱼由于鳔已充气，容易上浮，因此可能需要反复将其压向玻璃表面，直至琼脂糖开始凝固。
6. 约60秒后 ，琼脂糖将开始固化，此时幼鱼无法再调整方向。在室温下继续静置约5分钟，使盖玻片上的琼脂糖 完全凝固。琼脂糖完全固化后，用移液管向培养皿中加入含1×三卡因的E3溶液，加至半满。

6. 定位潜在靶点及消融前成像

1. 打开激光扫描共聚焦显微镜系统的电源，并通过集成成像软件进行初始化。选择63倍平场复消色差油镜（数值孔径1.40）或类似物。滴加浸油，并将培养皿固定在圆形载物台插板中，使幼鱼的头侧朝左。
2. 在明场或微分干涉差（DIC）照明下，选择一个已固定的幼鱼用于成像。调节焦距旋钮，使靠近盖玻片一侧鱼体的皮肤处于焦点位置，可通过表皮细胞指纹状的排列模式进行识别。
3. 一旦聚焦完成，切换至GFP荧光通道的落射荧光照明。通过水平肌隔处的GFP表达定位后侧线。成环状排列的荧光细胞为神经丘外套细胞，而细长链状排列的细胞为神经丘间细胞。
4. 从通常位于卵黄背侧的primIL1神经丘开始，使用载物台控制摇杆或其他载物台移动装置，沿水平肌隔向尾部方向进行视觉扫描。
   1. 沿神经丘间细胞链追踪，直至到达primIL3与primIL4（L3和L4）神经丘之间的区域（图1A）。
      注：也可选择其他区域，但躯干和尾部的这一区段通常最接近盖玻片，因此最适合进行消融。
   2. 若需对多个幼鱼成像，先设定第一个载物台位置，然后取消勾选相应复选框，关闭多位置成像功能。
   3. 对每个目标载物台位置（每条幼鱼）重复步骤6.4.1–6.4.2。
5. 在L3–L4区域的细胞体被识别后，切换至采集模式。
   1. 使用488 nm或491 nm激光激活GFP成像通道。
   2. 在“成像设置”下拉菜单中，勾选T-PMT复选框，为已激活的488 nm激光通道添加透射光（透射光光电倍增管或T-PMT）通道。
   3. 将激光功率设为6%，针孔大小设为1个艾里单位（Airy unit），数字增益设为750，用于ET20幼鱼的成像。具体增益和激光功率可能因幼鱼在盖玻片下的贴附程度及其荧光亮度而有所差异。调节增益，使细胞体达到饱和，以捕捉较暗的突起和丝状伪足。
   4. 将参数调整为帧尺寸1024像素 × 1024像素，数字放大倍数0.7（图像尺寸为145.2 µm × 145.2 µm）。将平均扫描次数设为2，以提高图像质量。
6. 勾选z-stack选项，调出z轴位置下拉菜单。在快速扫描过程中，调节焦距直至神经丘间细胞刚好脱离焦点。设定第一层切片，然后继续沿样品聚焦，直到神经丘间细胞再次脱离焦点，设定最后一层切片。确保z轴堆栈范围约为25 µm。将成像间隔设为1 µm。
7. 开始实验，采集消融前的z轴堆栈图像（图1B）。若已添加多个载物台位置，关闭位置选项，仅对当前位置进行成像。图像采集完成后立即保存文件。

7. 细胞体的激光消融

1. 点击“Show all Tools”。此选项位于采集界面的顶部。
2. 点击“Imaging Set Up”的下拉菜单。在“Imaging Set up”中，点击“Add a new track”（显示为“+”）。
3. 在“Imaging Set Up”中，点击“Dye”的下拉菜单，选择 DAPI 作为染料。
4. 点击“Channels”的下拉菜单，并取消选中所有其他通道的复选框，确保仅选中 DAPI 通道。
5. 在 DAPI 通道中，点击“Laser setting”设置为 405。将激光功率增加至 75%。在扫描待消融细胞体时，取消选中 DAPI 通道以关闭激光。
6. 将神经丘间细胞的细胞体置于视野中央，将扫描框放大至 20x–22x。放大过程中可能需要调整框的位置，以保持细胞体居中。一旦细胞体充满整个视野，立即停止实时扫描。
   注意：细胞体应占据整个视野。在此放大倍数下，GFP 会迅速漂白。应尽快操作以最小化激光暴露时间。使用放大功能而非选择感兴趣区域，以在小范围内提高激光功率分布。
7. 勾选 405 nm 激光快门框以激活该通道。将激光功率调整为 75%。设置 45 秒计时器。启动连续扫描并开始计时。在 45 秒时立即停止扫描。

8. 消融后成像与延时显微镜技术用于研究再生过程

1. 点击“通道”的下拉菜单。在通道设置中，取消勾选“DAPI”轨道以关闭消融激光。然后点击“采集模式”的下拉菜单。
2. 在采集模式中，选择“缩放”。
3. 通过滑块或直接输入“0.7”将缩放倍数降低至0.7。
   1. 为确保细胞消融成功，将增益调至900，并快速扫描视野。
      注意：目标细胞内不应有可见的GFP荧光。若仍观察到荧光信号，请返回步骤7.1–7.3重新操作。
   2. 使用与消融前成像相同或类似的设置，采集并保存消融后的图像（图1C）。如果图像显示仍有荧光细胞残留或存在其他需要清除的细胞体，请重复激光消融步骤，以在成串的中间神经丘细胞中形成清晰可见的空缺。
   3. 检查T-PMT通道的图像以进一步确认细胞损伤情况。受损细胞将呈现颗粒状外观，且细胞核常出现肿胀或形态不规则（图2）。
4. 在完成每个独立载物台位置的消融前成像、按需进行细胞消融以及消融后成像后，启动延时显微镜成像，激活载物台位置和时间采集选项。将时间参数设置为24小时或其它所需终点，时间间隔设为15分钟。开始实验以采集图像，并在实验结束后（通常为次日）保存结果文件。
5. 若需继续培养或研究幼鱼，请使用精细镊子小心将其从琼脂糖中取出，转移至不含三卡因的E3培养基中恢复。若不再使用，则根据批准的动物实验规程实施安乐死（常用方法为长时间浸入冰浴中），并按照机构规定进行妥善处理。

9. 图像分析

1. 在首选的图像处理软件中打开消融后的 z-stack 文件（材料表）。将各通道拆分，使每个通道位于独立的视窗中。
2. 在 GFP 通道窗口中，使用直线工具在剩余的 INMC 末端之间画一条直线。可通过上下滚动 z-stack 图像或在绘制直线前进行最大强度投影来辅助操作。
3. 使用“测量”工具获取 INMC 末端在 x 和 y 平面上的距离。
4. 在原始 z-stack 中逐层滚动 z 切片，以确定 INMC 在 z 平面上的距离。
5. 利用勾股定理（a² + b² = c²）计算 INMC 末端之间的总距离。斜边即为总距离（或间隙大小）。
6. 将测得的距离数据输入电子表格软件，用于数据分析。
7. 使用共聚焦系统自带的成像软件或免费的图像分析软件，回顾第 8.2–8.3 步采集的时间序列显微图像文件。确定由细胞突起填充 interneuromast 细胞间间隙的时间点。可通过检查多个 z 切片，确认间隙在所有维度上均已闭合，以辅助判断。
8. 为最准确地测量间隙闭合所需时间，应以消融后图像的时间戳（在 Finder 或文件资源管理器中可见）作为零时间点；若从时间序列图像堆栈的起始点开始计时，可能低估闭合所需时间，具体取决于消融其他视野位置所耗费的时间等因素。
9. 通过将原始间隙大小（µm）除以完全闭合所需的时间（小时或分钟），即可计算出闭合速率。

结果

为了消融INMC并记录其再生过程，将表达GFP的ET20转基因品系斑马鱼幼鱼在受精后2天或3天时按照步骤5.4所述进行固定，以进行消融。可同时固定多条鱼，以便在单次实验中获取多个时间序列图像。确定位于primIL3与primIL4神经丘之间的侧线区域，并按照步骤6.5–6.7采集消融前图像（图1A,B）。

选取三个细胞体进行激光消融，以在INMC细胞链中制造一个约40 µm的间隙。消融后采用高增益扫描及后续成像确认消融区域内已无残留的细胞体，仅在相邻INMC的细长突起之间留下一个间隙（图1C）。通过观察消融后的T-PMT通道进一步验证了细胞死亡。受损和正在死亡的细胞表现为细胞核肿胀、形态不规则，并呈现颗粒状外观（图2，轮廓标示）。在某些情况下，延时成像还显示有大型变形虫样细胞被募集至该区域，这些细胞很可能是巨噬细胞（图2，星号标示）。消融的INMC周围出现的暗区表明其上方的表皮细胞发生了光漂白。这些细胞在本实验中并未表现出受损或破坏迹象；相反，其荧光信号仅暂时性减弱。延时显微观察表明，这些细胞通常在消融后可恢复正常，且未发生形态改变或其他损伤表现（Volpe等，未发表结果）。

为了验证INMC消融的特异性，在双转基因ET20和Tg(neuroD:tdTomato)幼鱼中进行了消融实验，其中侧线神经（位于神经丘间细胞下方仅数微米处）被标记为红色荧光蛋白。对多个细胞进行消融，导致INMC串中出现明显间隙，但根据红色荧光观察，侧线神经几乎未受影响（图3）。该技术在消融浅表定位细胞方面的灵活性通过选择性破坏侧线神经丘内的单个感觉毛细胞得到了验证。采用与上述（第7和第8节）基本相同的方案，可在转基因Tg(myo6b:βactin-GFP)幼鱼中特异性消融单个毛细胞，而周围细胞未见明显损伤（图4）。经激光消融的毛细胞在延时显微镜观察下未恢复荧光信号，且其细胞核在激光照射后明显呈现颗粒状并形态异常（图4B）。与INMC消融类似，激光照射部位常有明显的巨噬细胞被募集（Volpe等，未发表结果）。

激光消融及消融后图像采集完成后，使用免费的图像分析软件测量了间隙大小。测量工具显示，间隙大小从几微米到100微米不等，具体取决于单个肠神经肌间细胞（INMC）的宽度以及被选中进行消融的细胞数量（图5）。采用延时显微镜记录再生过程中的INMC行为。在50次实验中，有15个间隙（30%）在24小时内通过再生实现闭合。大多数能够恢复的INMC在成像开始后的最初几小时内即完成修复。恢复定义为相邻细胞的突起相互接触的时间点；对于约40 µm的间隙，该过程发生在消融后16小时（视频1）。仔细检查Z层扫描图像，以确保细胞间接触发生在同一Z平面内，避免因Z投影导致的可能假象。逻辑回归分析显示，间隙闭合的概率与间隙大小相关（p = 0.0453），较小的间隙更有可能愈合。55.5 µm的间隙闭合概率为50%（图5）。

在70%的情况下，内侧神经嵴细胞（INMCs）无法完全闭合消融所造成的间隙。然而，即使在这些情况下，我们仍能够观察到邻近的INMCs形成较长的突起，这些突起在某些方面类似于延伸中的神经元生长锥（影片2）。因此，这些实验也可为损伤后INMCs的行为提供 insights。

图 1：通过激光照射选择性消融神经丘间细胞。（A）选择位于神经丘 primIL3 与 primIL4 之间的神经丘间细胞进行消融。这些细胞具有典型的纺锤形形态，其细长的突起与相邻细胞体相互重叠。（B）消融前成像确定了可被消融以形成空缺区域的细胞体。（C）消融后成像证实消融成功，表现为该空缺区域内细胞体的缺失。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：消融后成像显示GFP标记的中间神经丘细胞在激光照射下发生细胞死亡。透射光光电倍增管成像（T-PMT）显示存在具有颗粒状外观的坏死细胞（圆圈标示），以及被募集的不规则形状细胞，这些细胞很可能是巨噬细胞（*）。GFP与T-PMT通道的合并图像证实，细胞死亡和巨噬细胞活动发生在消融部位。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：中间神经丘消融的特异性。（A）双转基因 Tg(ET20;NeuroD:tdTomato) 幼体中，消融前的 GFP 标记中间神经丘细胞（绿色）和 tdTomato 标记的侧线神经（红色）。靠近侧线神经的细胞体被选为消融靶点。（B）消融后成像显示靶向细胞体被成功消融，而侧线神经保持完整。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：利用共聚焦显微镜消融感觉毛细胞。（A）消融前成像确定了在双转基因Tg(ET20; myo6b:βactin-GFP)斑马鱼中一个被GFP标记并作为消融目标的感觉毛细胞（*）。透射光光电倍增管（T-PMT）成像显示毛细胞形态正常，横截面呈圆形。（B）消融后成像证实目标毛细胞已被成功消融。T-PMT图像显示激光照射后毛细胞形状不规则且颗粒增多，提示细胞死亡而非光漂白。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：Logistic 回归模型将间隙闭合概率作为间隙宽度（单位：µm）的函数。评分为 0 表示间隙完全闭合，评分为 1 表示间隙未完全闭合。结果表明，间隙宽度对神经丘间细胞闭合相应间隙能力的影响具有统计学显著性（p = 0.0453，n = 24 总计；其中 n = 12 为闭合间隙，n = 12 为未完全闭合间隙）。请点击此处查看此图的放大版本。

视频 1：延时显微成像显示 16 小时后间隙闭合（约 40 µm）。 每 15 分钟采集一次图像，并对所有时间点进行最大强度 z 投影。 请点击此处下载该视频。

视频 2：未闭合的 INMC 间隙的时间推移显微镜图像。 显示了残留 INMCs 的细长且分支状突起。请点击此处下载该视频。

讨论

本方案描述了一种通用的激光细胞消融方法，可在任何配备近紫外激光器（波长405 nm）的共聚焦显微镜上进行。该方案克服了以往方法的局限性，例如电消融（会导致更广泛的损伤¹¹）和脉冲紫外激光消融（需要额外的专用设备¹²）。消融前后的共聚焦成像可快速反馈实验是否成功。后续的时间序列显微观察为感官系统发育中一种关键细胞类型的再生提供了简便的检测手段。

预先筛选在神经丘和内侧线神经母细胞（INMCs）中强烈表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因斑马鱼至关重要。具有明亮荧光且由primI发育而来的神经丽数目分布大致均匀的幼鱼是进行激光消融的理想候选对象。即使在这些鱼中，偶尔也存在荧光较弱的INMCs，可能在初次观察时难以被发现。这些细胞可能在激光消融后残留，从而阻碍INMCs之间真正间隙的形成。在消融前成像过程中，应调整数字增益以显现这些荧光较弱的细胞，以便同样能用405 nm激光对其进行靶向消融（步骤8.2）。

类似地，激光靶向有时并不能完全摧毁细胞，而只是淬灭其荧光，导致无法形成真正的空缺区域。这些细胞通常会在延时显微成像过程中荧光强度逐渐增强。在消融后的成像步骤中调整增益，并结合T-PMT成像（图2），有助于确保所有被靶向的细胞均已被有效清除。通常需要对两到三个单独的细胞进行消融，才能在INMC细胞串中形成一个空缺。细胞死亡可通过细胞出泡或出现颗粒状形态来判断；不过，这可能需要在激光照射后短暂等待一段时间（在某些情况下，随后可迅速观察到明显的凋亡或坏死特征）。

该方法的一个局限性在于，可能需要经过多次实验尝试才能优化激光条件并成功实现INMC再生。对于不同样本，可能需要对激光功率和激光总停留时间进行微调。研究发现，过度使用激光会损害侧线自我修复的能力。这包括：1）单个细胞暴露于激光照射的时间过长，可能对周围组织造成额外损伤；以及2）细胞串中被消融的细胞过多，导致形成较大的间隙。操作者必须在充分照射以确保细胞被彻底破坏与避免过度暴露之间取得平衡，因为后者可能减缓甚至阻止再生过程。在适当参数设置下，已发现可去除INMC而不会对后侧线神经造成可见损伤，表明本方案可将附带损伤降至最低，这一点不同于电消融法¹¹。在所有实验中均未观察到间隙内有新的感觉斑形成，推测原因是侧线神经保持完整，且其下方的胶质细胞仍然存在，从而抑制了INMC的增殖^6,7,8,11。

研究表明，这种共聚焦激光消融方法也可应用于其他细胞类型，特别是位于动物体表的细胞，如感觉毛细胞（图4）。类似方案可用于消融皮肤细胞以研究伤口修复，或消融神经元以开展轴突再生研究，如前所述¹³。预计该技术将成为拥有共聚焦显微镜但无其他专用激光消融设备的实验室中一种有用的实验手段补充。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12孔PTFE印刷载片	Electron Microscopy Sciences	63425-05
15 mM Tricaine 储存液	Sigma	E10521	将 Tricaine 溶于反渗透水中，配制成 15 mM 溶液
1X E3 + 600 µM Tricaine			将 15 mM Tricaine 储存液用 1X E3 培养基稀释 25 倍
1X E3 培养基			将 60X E3 培养基用反渗透水稀释至 1X（16.7 ml/L）
60X E3 培养基	所有组分购自 Sigma-Aldrich		在 1 升反渗透水中加入 34.4 g NaCl、1.52 g KCl、5.8 g CaCl2·2H2O、9.8 g MgSO4·7H2O
配备汞灯荧光装置的 Bx60 复式显微镜	Olympus
配备 405 nm、488 nm 及 555 或 561 nm 激光器的 LSM 700 共聚焦显微镜	Carl Zeiss Microscopy, LLC		使用 5 mW 的 405 nm 激光进行消融；消融和成像均通过数值孔径（NA）为 1.40 的 63× Plan-Apochromat 物镜完成
FIJI/ImageJ 图像处理软件	多位贡献者		可从 https://fiji.sc/ 下载
改装为毛刀的解剖针	Fisher Scientific	19010	将一根睫毛粘附于木质手柄解剖针的末端
Microsoft Excel 软件	Microsoft Corp.		Google 表格是 Microsoft Excel 的免费替代方案
带 1.5 号盖玻片、20 mm 观察窗的玻璃底 35 mm 培养皿	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm 培养皿，带 20 mm 玻璃观察窗
Immersol 518F 浸油	Fisher Scientific	12-624-66A
低凝胶温度琼脂糖	Sigma Life Science	A9414-256
Corning Netwell 插件，含 74 µm 聚酯网，24 mm 插件	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio 软件	Rstudio PBC		可从 https://rstudio.com/ 下载
SMX-168-BL 体视显微镜	Motic
移液吸头	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN 软件	Carl Zeiss Microscopy, LLC