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TMT 样本制备用于蛋白质组学平台送样及后续数据分析

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DOI：

10.3791/60970

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2020年6月8日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Florida

本文内容

摘要

我们提出了一种优化的串联质量标签（TMT）标记实验方案，其中包含以下各个步骤的详细信息：蛋白质提取、定量、沉淀、消化、标记、提交至蛋白质组学平台以及数据分析。

摘要

蛋白质组学技术是强大的研究方法，可通过提供疾病、治疗或其他条件对整个蛋白质组影响的全局视图，帮助我们理解生物系统中的作用机制。本报告提供了一种详细的蛋白质样品提取、定量、沉淀、消化、标记及后续数据分析的实验方案。我们优化后的TMT标记方案所需标签试剂浓度更低，并能获得稳定可靠的数据。我们已应用该方案评估了多种小鼠组织（如心脏、骨骼肌和脑）以及体外培养细胞中的蛋白质表达谱。此外，我们还展示了如何从所得数据集中分析数千种蛋白质。

引言

“"蛋白质组学"”一词最初被定义为对细胞、组织或生物体中全部蛋白质组进行大规模表征的研究领域1。蛋白质组学分析利用蛋白质表达水平的相对定量技术，能够研究疾病发展、治疗通路以及健康系统中涉及的机制和细胞过程2。此类研究的最初描述发表于1975年，展示了使用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）实现这一目标的方法1,3。二维电泳技术根据蛋白质的电荷（等电聚焦，IEF）和分子质量（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE）进行分离4。多年来，2D-PAGE 与随后对每个凝胶组分进行的串联质谱分析相结合，是最常用的非靶向蛋白质表达分析方法，已鉴定出大量此前未知的蛋白质表达谱5,6。2D-PAGE 方法的一般缺点包括耗时较长、对疏水性蛋白质分离效果不佳，以及由于灵敏度较低而限制了可检测蛋白质的总数7,8。

细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）方法已成为鉴定和定量样品中蛋白质丰度的又一流行方法9。该方法通过代谢标记细胞实现，即将细胞培养在缺乏某种标准必需氨基酸、但添加了该特定氨基酸的同位素标记形式的培养基中10。该技术的优势在于其高效性和精确的标记能力9。SILAC 方法的主要局限性在于同位素标记的掺入会降低细胞生长速率，这在用于模拟人类疾病的相对敏感的细胞系中尤为具有挑战性11。

2003年，一种新颖且高效的蛋白质组学技术被引入该领域，该技术涉及串联质谱标签（TMT）等压标记12。TMT标记是一种功能强大的方法，因其能够更灵敏地检测相对蛋白质表达水平及翻译后修饰13。截至本文发表时，已开发出可同时标记6、10、11或16个样品的TMT试剂盒。因此，可在同一实验中同时检测多种条件下含生物学重复的肽段丰度14,15,16。我们近期利用TMT技术对Barth综合征（BTHS）小鼠模型的心脏蛋白质组谱进行了表征17。通过该研究，我们能够证明接受基因治疗的BTHS小鼠心脏谱的广泛改善，并鉴定出受BTHS影响的新蛋白质，揭示了与心肌病相关的新型治疗通路。

本文介绍了一种利用组织样本或细胞沉淀进行多重TMT定量蛋白质组学分析的详细方法。在将样本提交至核心实验室之前，先完成样本制备和标记具有诸多优势：标记后的胰蛋白酶消化肽段比原始冷冻样本更稳定，且并非所有核心实验室都具备处理各类样本的经验；在研究实验室内完成样本制备可为核心实验室节省时间，而这些实验室通常存在较长的样本积压。有关该流程中质谱部分的详细描述，请参见Kirshenbaum等和Perumal等18,19。

样品制备方案包括以下主要步骤：提取、定量、沉淀、消化和标记。该优化方案的主要优势在于降低了标记成本，提高了蛋白质提取效率，并能稳定地产生高质量数据。此外，我们还介绍了如何分析TMT数据，以在较短时间内筛选数千种蛋白质。我们希望本方案能够鼓励其他研究团队考虑将这一强大方法应用于其研究中。

方案

佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会批准了所有动物实验研究。

1. 试剂的准备

  1. 配制 CHAPS 裂解缓冲液（150 mM KCl、50 mM HEPES pH = 7.4、0.1% CHAPS，每 50 mL 缓冲液加入 1 片蛋白酶抑制剂混合物）。不含蛋白酶抑制剂的缓冲液可在 4 °C 下保存最长 6 个月，含蛋白酶抑制剂的缓冲液可在 -20 °C 下保存最长 1 年。
  2. 配制 100 mM 三乙基碳酸氢铵（TEAB）：将 500 µL 的 1 M TEAB 加入 4.5 mL 超纯水中。
  3. 配制 200 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）：将 70 µL 的 0.5 M TCEP（一种变性试剂）加入 70 µL 超纯水中，然后加入 35 µL 的 1 M TEAB。
  4. 配制 5% 羟胺溶液：将 50 µL 的 50% 羟胺加入 450 µL 的 100 mM TEAB 中。

2. 蛋白质提取

  1. 根据IACUC批准的方案，从安乐死的小鼠中分离股四头肌。将组织在-80 °C下冷冻保存，或立即进行后续实验步骤。
  2. 取约10 mg新鲜或冷冻的小鼠股四头肌组织进行分离。处理骨骼肌时，使用镊子分离肌纤维。若使用细胞培养物，则将约3 × 106个细胞重悬于300 µL CHAPS裂解缓冲液中，并直接跳至步骤2.4。
  3. 使用珠磨破碎仪进行组织匀浆，采用2 mL离心管，内含约200 µL 1 mm氧化锆/二氧化硅珠和500 µL CHAPS裂解缓冲液。根据需要适当调整比例（例如，5 mg组织使用250 µL CHAPS裂解缓冲液）。
  4. 进行超声处理（在冰上以50%振幅每次超声10秒，重复10次，每次间隔30秒），以释放与DNA结合的蛋白质。也可通过注射器裂解法（将裂解液经连接1 mL注射器的21 G针头反复推注10次）或使用苯甲酸酶（44 U/mL）在37 °C孵育30分钟，达到相同的DNA降解效果。
  5. 在4 °C下以16,000 × g离心10分钟，将上清液转移至新的离心管中。

3. 蛋白质测定

  1. 使用已建立的方案测定上清液的蛋白质浓度（参见 材料表）。
    注意：最好使用浓度 ≥2 µg/µL 的样品，但也可使用浓度较低的样品。若使用浓度较低的样品，则需在步骤 5.1 中相应调整还原/烷基化试剂的体积。
  2. 使用 CHAPS 裂解缓冲液配制 BSA 标准曲线稀释液。
  3. 按照制造商说明书操作，15 分钟后在 750 nm 处读取吸光度。

4. 还原/烷基化试剂处理

  1. 将每种条件下的 200 µg 蛋白质转移至新的离心管中，并使用 CHAPS 裂解缓冲液调整终体积至 100 µL。当蛋白质浓度过低时，可将体积放大至 200 µL，但需注意相应调整还原/烷基化试剂的体积。
  2. 加入 5 µL 的 200 mM TCEP，并在 55 °C 下孵育样品 1 小时。
  3. 使用前立即配制 375 mM 碘乙酰胺溶液：将一管碘乙酰胺（即 9 mg）溶解于 132 µL 的 100 mM TEAB 溶液中。该溶液需避光保存。
  4. 向样品中加入 5 µL 的 375 mM 碘乙酰胺，在室温（RT）下避光孵育 30 分钟。

5. 甲醇/氯仿沉淀20

  1. 向每 100 µL 蛋白质样品中加入 400 µL 甲醇，并短暂涡旋混匀。
  2. 在室温下以 9,000 × g 离心 10 秒。此步骤旨在使附着在样品管壁上的液体重新进入溶液。
  3. 向混合物中加入 100 µL 氯仿，并短暂涡旋。若样品中磷脂含量较高，则使用 200 µL 氯仿。
  4. 在室温下以 9,000 × g 离心 10 秒。此步骤旨在使附着在样品管壁上的液体重新进入溶液。
  5. 加入 300 µL 水，并剧烈涡旋。确保获得均一溶液至关重要。
  6. 在室温下以 9,000 × g 离心 1 分钟。将试管转移至试管架时需格外小心，避免扰动分层。
    注意：此时试管中应出现三层：1）上层（即上清液），为水与甲醇的混合物；2）中层（即中间相），为白色沉淀的蛋白质；3）下层（即底层），为氯仿。
  7. 小心移除上清液。
  8. 向剩余的中间相和底层中加入 300 µL 甲醇，并剧烈涡旋。
  9. 在室温下以 9,000 × g 离心 2 分钟。将试管转移至试管架时需格外小心，避免扰动分层。
  10. 小心移除上清液。
  11. 在气流下（例如使用真空浓缩仪）于室温轻轻抽吸，尽可能去除液体，直至沉淀物仅轻微湿润（约 10 分钟）。由于每个样品所需时间可能不同，建议每 2 分钟检查一次。将沉淀物储存于 -80 °C，待后续处理。

6. 蛋白质消化

  1. 用100 µL TEAB裂解缓冲液重悬沉淀的蛋白质沉淀。
    注意：此步骤可选择性测定蛋白质浓度。
  2. 使用前立即配制1 µg/µL胰蛋白酶：将100 µL胰蛋白酶储存液（50 mM乙酸）加入100 µg胰蛋白酶玻璃小瓶底部，室温孵育5分钟。将剩余试剂分装为单次使用剂量，于-80 °C保存。
  3. 每100 µg蛋白质加入2.5 µL胰蛋白酶。在37 °C下过夜消化样品。此步骤对蛋白质的完全溶解至关重要，不得更改条件。消化完成后，可选择使用标准蛋白质检测方法测定蛋白质浓度。

7. 肽段标记

  1. 使用前立即 将 TMT 标记试剂盒的试剂平衡至室温。
  2. 向每管中加入 41 µL 无水乙腈，溶解各 0.8 mg 的 TMT 标签小瓶。在室温下孵育试剂 5 分钟，期间偶尔涡旋混匀。短暂离心各管。
    注意：通常 0.8 mg 的 TMT 标签量足以标记两组样品。然而，其他研究者已证明，该浓度还可进一步降低，仍可获得可靠的数据15。
  3. 小心地将 41 µL 的 TMT 标记试剂加入每个 100 µL 的样品中。
  4. 在室温下孵育反应 1 小时。
  5. 向样品中加入 8 µL 的 5% 羟胺溶液，孵育 15 分钟以终止反应。
  6. 将样品等量分装至新的离心管中，并在 -80 °C 下保存。
    注意：在此步骤中，样品稳定，可直接用于质谱分析。此时可选使用标准蛋白测定方法测定样品浓度。

8. 质谱分析

  1. 将样品提交至蛋白质组学平台（本研究使用了佛罗里达大学ICBR蛋白质组学核心设施），所有样品将在该平台使用C18离心柱进行合并和纯化。
    注意：在制备样品前，请事先与核心设施沟通样品提交方式，以确认其偏好的具体提交流程。
  2. 针对每个合并后的多重样品，申请以下操作流程：固相萃取、高效液相色谱（强阳离子交换色谱SCX、尺寸排阻色谱SE）、Zip Tip脱盐、液相色谱-串联质谱LC-MS/MS（用于蛋白质鉴定的2小时梯度，若仪器为>10QE Plus）。
  3. 数据采集完成后，核心设施将使用厂商提供的软件对RAW文件进行处理，以实现蛋白质鉴定。

9. 数据分析

  1. 数据通常以 7z 格式从核心设施返回给用户，每个数据集大约需要 16 GB 的磁盘空间（本案例中共有 11 个样本）。进行数据处理时，请确保使用至少 3.4 GHz 主频的计算机。
  2. 使用 7-Zip 文件管理器解压文件。解压后的文件包含 RAW 数据、pdStudy 格式文件和 pdResultView 格式文件。保存所有文件以供后续分析。
  3. 使用 Proteome Discovery 2.2 软件打开文件。
    注意：文件格式为 "文件名.pdStudy"。如果 "文件名.pdResultView" 打开后无法选择对照样本。
  4. 选择对照样本 "样品" 面板
  5. 打开 结果 通过选择 ID 开启 "分析结果" 面板
  6. 导出至电子表格软件。
  7. 保存原始数据（所有鉴定出的蛋白质）。
  8. 打开电子表格软件文件，其中将包含所有已鉴定的蛋白质。
  9. 在电子表格软件文件中使用 "过滤" 功能筛选 "蛋白质FDR置信度：合并" 在 高 (B列), "#独特肽段" 高于 2 (第 K 列），以及以下其中之一 "丰度比" 空白专属（仅限空白）柱 S 高达 W).
  10. 插入一列用于 "p值" 使用函数进行计算
    =TTEST(对照组, 实验组, 尾部, 类型)
  11. 插入一列用于 "统计学显著性" 其功能
    =IF(p值<0.05, "意义","NS")
  12. 使用 "过滤" 功能筛选 "统计学显著性" 显示 "意义"结果显示了对照组和实验组中具有统计学意义的分析蛋白。
  13. 确定实验组中蛋白质表达丰度相较于对照组显著升高或降低，并插入一列用于 "调控" 其功能
    =IF(AVERAGE(对照组)>实验组平均值"上调","下调")

10. 评估显著性结果的方法

  1. 为了鉴定 TMT 研究中发现的显著性靶点之间的蛋白质-蛋白质相互作用，使用相互作用基因/蛋白质检索工具（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins, STRING）版本 11.021：https://string-db.org/
  2. 为了按类别（即分子功能、生物过程和蛋白质类别）进行分类，使用进化关系中的蛋白质分析（Protein Analysis through Evolutionary Relationships, PANTHER）本体分类软件22：http://www.pantherdb.org/
  3. 为了鉴定多种信号通路中的蛋白质相互作用，使用通路分析软件23。

11. 将蛋白质组学数据上传至存储库

  1. 向蛋白质组学鉴定数据库（Proteomics IDEntifications Database，PRIDE）或质谱交互式虚拟环境（Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment，MassIVE）提交蛋白质组学数据时，需包含以下信息：峰列表文件（以标准格式处理的质谱文件，例如 mzXML、mzML 或 MGF）、结果文件（以标准格式记录的谱图鉴定结果，例如 mzIdentML 或 mzTab）以及原始谱图文件（以非标准或仪器特有格式存储的原始质谱文件，例如 .RAW 或 .WIFF 文件）。
  2. 提交时，需创建账户并填写相关信息，如所属单位和项目详情。随后，选择第 11.1 步中列出的文件并上传。
  3. 为创建正式数据集，需对这些已上传文件运行提交工作流程。
    注意：提交后，该数据集将在存储库中保持私有状态。在私有模式下，数据仅对授权用户开放。此外还提供两种其他选项：1）共享数据集，可允许期刊审稿人和合作者访问；或 2）公开数据集，可在公共数据集检索中被发现。这些存储库的另一重要功能是支持更新已上传数据，并将后续发表的论文与现有数据集相关联。

结果

健康细胞和病变细胞在CHAPS缓冲液中裂解，缓冲液的配制方法详见我们的TMT标记方法，随后送至佛罗里达大学跨学科生物技术研究中⼼（UF-ICBR）蛋白质组学核心实验室进行液相色谱-串联质谱分析。在核心实验室完成数据采集并交付后，使用厂商提供的软件打开数据集，并应用以下筛选条件：每种蛋白质至少含有≥2个独特肽段、每个蛋白质样品在所有通道中均含有报告离子，并且仅保留显著改变的蛋白质（p ≤ 0.05）。表1总结了数据结果：共鉴定出39,653个总肽段，其中7,211个含有两个或更多独特肽段，3,829个在所有通道中均含有报告离子。对这3,829个肽段采用Student's t检验计算p值，p ≤ 0.05被认为具有统计学显著性。此外，还设定了倍数变化阈值，用于确定病变细胞相对于健康细胞中蛋白质的相对分布情况：下调（蓝色）或上调（红色）（图1）。

使用 PANTHER 本体分类系统和 STRING 分析评估了显著失调的蛋白质表达列表。Panther 分析根据分子功能对蛋白质进行了分类，列出了在疾病细胞中丰度显著降低（图 2A）或升高（图 2B）的蛋白质。对丰度显著降低（图 2C）和升高（图 2D）的蛋白质进行的 STRING 分析识别出多个蛋白质之间的相互作用和强关联关系。

火山图；基因表达分析；倍数变化 vs. P值；差异表达结果。
图1：火山图显示在疾病细胞与健康对照细胞之间，蛋白丰度无显著变化（黑色）、显著降低（蓝色）或显著升高（红色）的情况。 请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质功能分布；饼图（A, B）和网络图（C, D），分子活性分析。
图 2：通过 PANTHER（A, B）和 String（C, D）对显著差异表达的蛋白质进行的代表性功能分析结果，包括丰度显著降低或升高的蛋白。 请点击此处查看该图的高清版本。

总肽段数总鉴定数≥ 2 条唯一肽段定量蛋白质显著变化蛋白质
低表达高表达
39653721144573829296108

表1：每组数据集分析中定量蛋白质的代表性表格。

讨论

为了成功制备用于基于TMT的同重同位素标记方法进行蛋白质组学分析的样品，必须在4 °C下小心进行蛋白质提取，并使用含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液24,25。蛋白酶抑制剂混合物是一种关键试剂，可避免蛋白质消化过程中发生意外的蛋白质降解。我们的方案与供应商当前提供的方案之间的一个关键区别在于，根据我们对哺乳动物细胞和组织的操作经验，我们强烈推荐使用CHAPS裂解缓冲液。我们还建议对细胞沉淀和组织均采用甲醇/氯仿蛋白质沉淀法。

理想情况下，蛋白质提取、定量、还原/烷基化试剂处理以及甲醇/氯仿沉淀应于同一天内完成。遵循此建议可获得更准确的蛋白质浓度，以便后续标记。蛋白质沉淀步骤对于去除会干扰串联质谱分析的试剂至关重要。包含沉淀步骤可显著提高TMT26的分辨率。总之，本TMT实验方案的主要优势在于对不同类型的样本均具有高效的标记效率、良好的可重复性以及可靠的实验数据。

随着这种TMT非靶向蛋白质组学策略的多重检测能力不断扩展，它将逐步增强各个领域研究人员做出新发现的能力。特别是在生物医学领域，我们及其他研究者发现，该技术在探索疾病新作用机制以及不同治疗手段相对影响的研究中，提供的信息日益丰富。基于上述诸多原因，这一强大技术补充了现代研究中所采用的其他组学方法的不足，并提供了可指导进一步治疗开发的关键信息。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢佛罗里达大学分子生物学与生物技术研究中心（UF-ICBR）蛋白质组学平台对本研究样品的处理。本研究部分得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）R01 HL136759-01A1项目（CAP）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M 三乙基碳酸氢铵（TEAB），50 mLThermo Fisher90114用于蛋白质标记的试剂
50% 盐酸羟胺，5 mLThermo Fisher90115用于蛋白质标记的试剂
乙酸SigmaA6283用于蛋白质消化的试剂
无水乙腈，LC-MS 级Thermo Fisher51101用于蛋白质标记的试剂
苯甲酸酶核酸酶Sigma-AldrichE1014用于DNA剪切
Bond-Breaker TCEP溶液，5 mLThermo Fisher77720用于蛋白质标记的试剂
BSA标准品Thermo23209用于蛋白质定量的试剂
CHAPSThermo Fisher28300用于蛋白质提取的试剂
氯仿FisherBP1145-1用于蛋白质沉淀的试剂
cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂Roche4693132001用于蛋白质提取的试剂
DC蛋白质测定试剂盒BioRad500-0116用于蛋白质定量的试剂
ExcelMicrosoft Office用于数据分析的软件
加热金属块VWR analog12621-104用于蛋白质消化孵育的设备
HEPESSigmaRDD002用于蛋白质提取的试剂
甲醇FisherA452-4用于蛋白质沉淀的试剂
Pierce胰蛋白酶，MS级Thermo Fisher90058用于蛋白质消化的试剂
氯化钾Sigma46436用于蛋白质提取的试剂
Sigma Plot 14.0Sigma Plot 14.0用于数据分析的软件
超声破碎仪Fisher ScientificFB120用于DNA剪切
Spectra Max i3x 多功能检测平台Molecular Devices用于蛋白质定量的酶标仪
Thermo Scientific Pierce 定量比色肽测定试剂盒Thermo Fisher23275用于蛋白质定量的试剂
Thermo Scientific Pierce 定量荧光肽测定试剂盒Thermo Fisher23290用于蛋白质定量的试剂
Thermo Scientific Proteome Discoverer 软件Thermo FisherOPTON-30945用于数据分析的软件
TMT 10plex 同重同位素标记试剂盒，0.8 mg，足够进行一次10重同重同位素实验Thermo Fisher90110用于蛋白质标记的试剂
TMT11-131C 标记试剂，5 mgThermo FisherA34807用于蛋白质标记的试剂
水，LC-MS级Thermo Fisher51140用于蛋白质提取的试剂

参考文献

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