我们提出了一种标记和分析锥体神经元的方案，这对于评估可能介导神经化学和行为异常的神经元及树突棘形态学改变至关重要。
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本文内容
摘要
摘要
已有报道称，树突棘的大小和形状与其结构可塑性相关。为了鉴定锥体神经元及树突棘的形态结构，可采用弹道标记技术。在本实验方案中，使用DiI C18(3)染料对锥体神经元进行标记，并利用神经元重建软件分析神经元形态和树突棘。为研究神经元结构，进行树突分支分析和Sholl分析，分别用于推断树突分支复杂性和神经元树突丛的复杂性。树突棘的评估采用重建软件内置的自动辅助分类算法，将树突棘分为四类（即细长型、蘑菇型、短粗型和丝状伪足型）。此外，还选取另外三个参数（即长度、头部直径和体积）来评估树突棘形态的变化。为验证弹道标记技术广泛应用的潜力，成功标记了体外细胞培养中的锥体神经元。总体而言，弹道标记方法独特且有效，可用于可视化大鼠不同脑区的神经元，结合先进的重建软件，有助于研究人员阐明神经认知功能障碍的潜在机制。
引言
2000年，Gan 等人描述了一种用于神经系统中单个神经元和胶质细胞的快速标记技术，该技术结合了多种疏水性染料，可同时以不同颜色标记大量脑细胞1,2。最近，Seabold 等人3描述了一种弹道式标记技术，可将荧光染料（Dil）导入脑切片中的神经元。作为一种多功能的染色技术，弹道式标记因其适用于多种动物物种及广泛年龄段而受到青睐。此外，该技术还可与免疫染色结合使用，以鉴定脑细胞的不同亚群3。与传统技术（如 Golgi-Cox 银浸染法、显微注射法）4相比，弹道式标记能够更清晰地分辨形态学特征，包括树突棘，这一特性对于推断神经元复杂性及突触连接性至关重要5。
兴奋性锥体神经元的特征是具有单个较大的顶树突、多个较短的基底树突以及数千个树突棘6。锥体神经元存在于多个与高级认知功能相关的脑区，包括前额叶皮层（PFC）和海马体。在前额叶皮层中，锥体神经元分布于II/III层和V层，各层神经元具有独特的形态。具体而言，前额叶皮层II/III层的锥体神经元其顶树突较短，分支较少，相较于V层的锥体神经元6<....
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方案
所有动物实验方案均经南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会审查并批准（联邦保证编号：D16-00028）。
1. DiI/钨珠毛细管的制备
- 将100 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶于10 mL去离子水（ddH2O）中，轻轻涡旋混匀PVP溶液。
- 用PVP溶液（见材料表）填充导管，并静置20分钟。然后使用10 mL注射器从导管另一端将PVP溶液排出。
- 将170 mg钨微载体珠与250 µL二氯甲烷混合，充分涡旋使钨珠悬浮液混匀。
- 将6 mg脂溶性DilC18(3)染料与300 µL二氯甲烷混合，充分涡旋使DilC18(3)染料溶液混匀。
注意：步骤1.3–1.4需在通风橱中操作。 - 用移液器将250 µL钨珠悬浮液转移至载玻片上，静置使其自然风干（约3分钟）。
- 在已风干的钨珠悬浮液层上加入300 µL DilC18(3)染料溶液，用移液器枪头充分混匀DiIC18(3)染料溶液与钨珠悬浮液，随后静置风干（约3分钟）。
- 待完全干燥后，使用剃刀片将混合物分装至两个1.5 mL离心管中，并向管中加水至充满。
- 在水浴超声仪（Amp I，100%功率）中超声处理至均匀（约5分钟），确保超声探头直接接触装有珠悬液的离心管管壁。
- 将两个1.5 mL均质....
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结果
在图2A中，通过弹道标记技术鉴定了大鼠脑切片海马区典型的锥体神经元，其特征为具有一条较大的顶端树突以及围绕胞体的数条较小的基底树突。图2B展示了在检测到胞体、追踪树突分支并识别树突棘后，神经元在神经元重建定量分析软件中的形态。随后，利用神经元重建定量分析软件对数据进行分析，从而能够评估树突分支复杂性（图2C）和神经元树突复杂性（图2D）。
在图2C中，我们采用来自“Tree Totals”输出的离心分支排序方法，统计沿每条树突所经过的节段数量，并确定分支级数。对1–15级分支的各分支级数节段的相对频率进行了分析。当各组之间观察到树突分支分布的变化时，可推断树突分支复杂性的改变。此外，进行了Sholl分析作为神经元树突结构复杂性的补充评估指标，即量化每个样本切片中从胞体起始每10 µm处树.......
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讨论
在本实验方案中，我们描述了一种适用于大鼠脑组织神经元及体外培养神经元的通用标记技术。此外，我们还介绍了如何使用神经元重建软件和神经元重建定量分析软件来评估神经元形态和树突棘的方法。对神经元形态和树突棘的评估有助于揭示树突分支复杂性、神经元树突结构复杂性、树突棘形态以及突触连接性的变化。
在实施该方案时，研究人员应特别注意以下几个步骤。首先，使用4%多聚甲醛（PFA）后固定时间过长会破坏脂溶性膜的完整性，导致染料从细胞内泄漏。其次，与脑切片中仅靶向神经元的弹道标记特异性相比，在体外对原代皮层神经元进行标记时会引入胶质细胞的非特异性标记，因为脑切片中的弹道标记并不特异于某一种神经元类型（例如锥体神经元、中等棘状神经元或颗粒细胞）。因此，应将Bregma坐标、形态学评估或特异性细胞标志物与弹道标记方法结合使用。第三，脑切片的厚度可在200–500 µm之间；为获得最佳效果，应对此进行优化。第四，标记效率和染料渗透程度受多种因素影响，包括氦气压力、弹道喷射后的孵育时间、DiI/钨珠比例、网格筛与脑切片表面之间的距离等，因此该方案应根据每项研究的具体情况进行优化。第五，在制备过程中必须避免出.......
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披露
所有作者均无利益冲突需要声明。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 HD043680、MH106392、DA013137 和 NS100624。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20Gx25mm 精密针头 | BD | 305175 | |
| 24 孔细胞培养板 | Costar | 3562 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | MatTek 公司 | P35G-1.5-20-C | |
| 抗生素-抗真菌素溶液 | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 添加剂 | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| 枪管衬管 | BIO-RAD | 165-2417 | |
| 硼砂 | Sigma | B9876 | |
| 硼酸 | Sigma | B0252 | |
| 弹匣架 | BIO-RAD | 165-2426 | |
| 共聚焦成像软件 | Nikon | EZ-C1 | 版本 3.81b |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | TE-2000E | |
| 盖玻片 | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 培养基 | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 镊子 | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 镊子 | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 大鼠 | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| 葡萄糖 | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios 扩散屏 | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios 基因枪试剂盒 | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios 基因枪系统 | BIO-RAD | 165-2431 | |
| 氦气软管组件 | BIO-RAD | 165-2412 | |
| 虹膜镊 | World Precision Instruments | 15914 | |
| 虹膜剪 | World Precision Instruments | 500216 | |
| 二氯甲烷 | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal 培养基 | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 软件 | mbf bioscience | 树突棘分析 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P9155 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮 | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Fisher Scientific | P36930 | 封片介质 |
| 大鼠脑切片模具，300 - 600 g，冠状位，0.5 mm | Ted Pella | 15047 | |
| 七氟烷 | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| 碳酸氢钠 | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus 载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 注射器套件 | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel 管路 | BIO-RAD | 165-2441 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 管路切割器 | BIO-RAD | 165-2422 | |
| 管路预处理站 | BIO-RAD | 165-2418 | |
| 钨 M-25 微载体 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas 剪刀 | World Precision Instruments | 500086 |
参考文献
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W.
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重印与许可
