脑片及原代细胞培养中锥体神经元的弹道标记

摘要

我们提出了一种标记和分析锥体神经元的方案，这对于评估可能介导神经化学和行为异常的神经元及树突棘形态学改变至关重要。

摘要

已有报道称，树突棘的大小和形状与其结构可塑性相关。为了鉴定锥体神经元及树突棘的形态结构，可采用弹道标记技术。在本实验方案中，使用DiI C18(3)染料对锥体神经元进行标记，并利用神经元重建软件分析神经元形态和树突棘。为研究神经元结构，进行树突分支分析和Sholl分析，分别用于推断树突分支复杂性和神经元树突丛的复杂性。树突棘的评估采用重建软件内置的自动辅助分类算法，将树突棘分为四类（即细长型、蘑菇型、短粗型和丝状伪足型）。此外，还选取另外三个参数（即长度、头部直径和体积）来评估树突棘形态的变化。为验证弹道标记技术广泛应用的潜力，成功标记了体外细胞培养中的锥体神经元。总体而言，弹道标记方法独特且有效，可用于可视化大鼠不同脑区的神经元，结合先进的重建软件，有助于研究人员阐明神经认知功能障碍的潜在机制。

引言

2000年，Gan 等人描述了一种用于神经系统中单个神经元和胶质细胞的快速标记技术，该技术结合了多种疏水性染料，可同时以不同颜色标记大量脑细胞^1,2。最近，Seabold 等人³描述了一种弹道式标记技术，可将荧光染料（Dil）导入脑切片中的神经元。作为一种多功能的染色技术，弹道式标记因其适用于多种动物物种及广泛年龄段而受到青睐。此外，该技术还可与免疫染色结合使用，以鉴定脑细胞的不同亚群³。与传统技术（如 Golgi-Cox 银浸染法、显微注射法）⁴相比，弹道式标记能够更清晰地分辨形态学特征，包括树突棘，这一特性对于推断神经元复杂性及突触连接性至关重要⁵。

兴奋性锥体神经元的特征是具有单个较大的顶树突、多个较短的基底树突以及数千个树突棘⁶。锥体神经元存在于多个与高级认知功能相关的脑区，包括前额叶皮层（PFC）和海马体。在前额叶皮层中，锥体神经元分布于II/III层和V层，各层神经元具有独特的形态。具体而言，前额叶皮层II/III层的锥体神经元其顶树突较短，分支较少，相较于V层的锥体神经元⁶。在海马体中，锥体神经元位于CA1和CA3区域，且各区域表现出不同的形态特征。具体而言，CA1区域的锥体神经元具有更为明显的顶树突，其分支点距离胞体较CA3区域更远⁶。

前额叶皮层（PFC）和海马体中的锥体神经元上的树突棘是兴奋性突触的主要部位⁷。树突棘的形态特征通常被分为三大类（即细长型、短粗型和蘑菇型⁸），这些特征与兴奋性突触的大小相关⁹。细长型树突棘具有细长的颈部、较小的球状头部以及较小的突触后密度，其结构较不稳定，形成的连接较弱。相比之下，蘑菇型树突棘具有较大的头部，因其体积较大而被认为能够形成更强的突触连接。截然不同的是，短粗型树突棘缺乏明显的棘颈，其头部与颈部的体积比大致相等⁸。在海马体中还可观察到分枝型树突棘，即同一树突棘颈部延伸出多个头部¹⁰。因此，树突棘的形态变化可能反映其功能特性与结构能力。此外，研究已表明树突棘的大小和形状与其结构可塑性相关，由此提出小树突棘参与学习与注意力过程，而更大、更稳定的树突棘则参与包括记忆在内的长期过程¹¹。另外，树突棘在树突上的分布可能与突触连接性相关^5,12。

因此，本方法学论文具有三个目标：1）介绍我们的弹道标记技术方案，该方案的成功率（即符合筛选标准且适合分析的神经元比例）达到83.3%^5,12,13，并已应用于多个脑区（如前额叶皮层、伏隔核、海马）；2）展示该技术的可推广性及其在体外培养神经元中的应用；3）详细说明神经元重建软件中所采用的方法学，以及由此类数据可得出的推论。

方案

所有动物实验方案均经南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会审查并批准（联邦保证编号：D16-00028）。

1. DiI/钨珠毛细管的制备

1. 将100 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶于10 mL去离子水（ddH₂O）中，轻轻涡旋混匀PVP溶液。
2. 用PVP溶液（见材料表）填充导管，并静置20分钟。然后使用10 mL注射器从导管另一端将PVP溶液排出。
3. 将170 mg钨微载体珠与250 µL二氯甲烷混合，充分涡旋使钨珠悬浮液混匀。
4. 将6 mg脂溶性DilC18(3)染料与300 µL二氯甲烷混合，充分涡旋使DilC18(3)染料溶液混匀。
   注意：步骤1.3–1.4需在通风橱中操作。
5. 用移液器将250 µL钨珠悬浮液转移至载玻片上，静置使其自然风干（约3分钟）。
6. 在已风干的钨珠悬浮液层上加入300 µL DilC18(3)染料溶液，用移液器枪头充分混匀DiIC18(3)染料溶液与钨珠悬浮液，随后静置风干（约3分钟）。
7. 待完全干燥后，使用剃刀片将混合物分装至两个1.5 mL离心管中，并向管中加水至充满。
8. 在水浴超声仪（Amp I，100%功率）中超声处理至均匀（约5分钟），确保超声探头直接接触装有珠悬液的离心管管壁。
9. 将两个1.5 mL均质混合物合并至一个15 mL锥形管中，再继续超声处理3分钟。
10. 使用10 mL注射器将钨珠-DilC18(3)染料混合物吸入已涂覆PVP的导管中，并将导管送入制备工作站（见材料表）。
11. 在制备工作站上旋转1分钟，随后用10 mL注射器小心抽除导管中所有水分。
12. 打开氮气，调节氮气流速至约0.5升/分钟（LPM），在制备工作站上旋转导管，并用氮气干燥30分钟。
13. 从制备工作站取下导管，使用导管切割器切成13 mm长度（与弹夹加载尺寸匹配），将13 mm长的导管段置于闪烁瓶中，避光保存。

2. 脑切片的制备

注意：成年雄性F344/N大鼠在12小时光照/12小时黑暗循环的受控环境中成对饲养，可自由获取食物和水。所有动物的饲养和管理均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中规定的原则。

1. 使用5%七氟烷深度麻醉大鼠。
2. 当大鼠对有害刺激无反应且反射消失时，进行下一步操作。
3. 将大鼠仰卧位固定于化学通风橱内。
4. 沿胸骨中线切开皮肤，分离膈肌并用剪刀打开胸腔，将20 G × 25 mm针头插入左心室。
5. 立即用剪刀剪开右心房，以5 mL/min流速灌注50 mL 100 mM PBS，随后灌注100 mL用100 mM PBS配制的4%多聚甲醛。
6. 灌注结束后立即取出整脑。
7. 将整脑用4%多聚甲醛后固定10分钟。
   注意：后固定时间不得超过30分钟，否则会影响标记效果。
8. 使用大鼠脑切片模具（见材料表）切割500 µm厚的冠状切片。进行第一次切割后保持刀片位置不变，使用第二把刀片进行第二次切割，并垂直移出第一把刀片，使组织保留在刀片表面。
9. 将脑切片放入24孔板中，每孔加入1 mL 100 mM PBS。重复此过程直至所有切片完成。

3. 脑切片的弹道标记与可视化

1. 移除每个目标孔中的 PBS。
2. 将一段 DiI/钨珠管装入进样器中，并将其放入施加装置。
3. 在两层网筛之间放置一张滤纸。将施加装置连接至氦气管路。调节氦气输出压力至 90 磅每平方英寸（psi）。
4. 用手将施加装置垂直放置在目标孔的中心位置，样品与网筛之间的距离为 1.5 cm。发射 DiI/钨珠管。
   注意：射击前务必完全移除目标孔中的 PBS。
5. 装入下一段 DiI/钨珠管。持续对剩余的脑片进行射击。
6. 向 24 孔板中加入 100 mM PBS 溶液。用 500 µL 新鲜的 100 mM PBS 洗涤 3 次。洗涤过程中避免脑片翻转。
7. 加入 500 µL 新鲜的 100 mM PBS，将脑片置于 4 °C 避光保存 3 小时。
8. 使用细刷将脑片转移至载玻片上。
   注意：每张载玻片上可放置三片脑组织切片。
9. 立即在每一片脑组织上加入 1 mL 抗荧光淬灭封片剂。覆盖 22 mm × 50 mm 的盖玻片。将载玻片置于避光环境中干燥 2 天。
10. 开启共聚焦显微镜系统，并切换至 60× 物镜。
11. 设置共聚焦显微镜系统的放大倍数为 60×（A/1.4，油镜），Z 轴步进间隔为 0.15 μm（针孔大小 30 μm，后投影针孔半径 167 nm）。使用 543 nm 激光波长采集目标神经元的图像。
12. 根据脑区边界及神经元的形态学特征，获取目标神经元类型的 Z 轴层扫图像。
    注意：每只动物至少采集三幅图像。

4. 细胞培养中该方法的应用

1. 采用已报道的方法¹⁴，从出生后第一天的 F344/N 大鼠中分离原代皮层神经元。
2. 将原代皮层神经元培养于 35 mm 玻璃底培养皿中一周。分离后第三天，更换一半培养基为新鲜的神经元生长培养基。用 1 mL 的 100 mM PBS 洗涤玻璃底培养皿 2 次。
3. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。重复步骤 3.2–3.6，以实现细胞的弹道标记。
4. 用 1 mL 的 100 mM PBS 洗涤 3 次。加入 500 µL 新鲜的 100 mM PBS，置于 4 °C 避光保存 3 小时。
5. 加入 200 µL 抗荧光淬灭封片剂。
6. 根据步骤 3.10 中的参数，获取每个目标神经元的 Z 轴层扫图像。

5. 神经元分析与树突棘定量

1. 使用代码编号对神经元进行盲化处理，以防止实验者产生偏倚。
2. 根据感兴趣的脑区建立神经元的选择标准。
   注意：神经元的选择标准包括连续的树突染色、低背景信号、细胞内无染料聚集、DiI染料向细胞外空间的扩散最小化，以及锥体神经元形态正确（图1）。
3. 打开神经元重建软件（参见附带的 视频1）。
4. 点击左上角的“文件夹图标”以加载图像文件。
5. 点击“胞体”，并在图像上标记神经元的胞体。
6. 点击“树状结构”，然后选择“用户引导”模式。
7. 追踪所有感兴趣的树突分支。
   注意：对于具有一个顶端树突和多个基底树突的锥体神经元，仅需追踪顶端树突。确保所有连接的分支彼此相连。
8. 点击“树突棘”。
9. 定义检测参数，然后点击“全部检测”。
   注意：对于脑切片，跨脑区一致使用的参数为：2.0（外侧范围）、0.3（最小高度）、100%（检测器灵敏度）和10（最小计数）。对于细胞培养样本，需提高检测器灵敏度并降低最小计数。
10. 通过选择“全部分类”对树突棘进行分类。
    注意：树突棘的分类由神经元重建软件内置的算法完成¹⁵。
11. 通过点击左上角的磁盘图标保存追踪结果。
12. 进行神经元及树突棘形态学分析。
    1. 打开神经元重建定量分析软件（参见附带的 视频2）。
    2. 点击“文件”和“打开数据文件”以加载图像。
    3. 点击“分析”和“分支结构分析”，以分析神经元形态和树突棘形态。
    4. 对于神经元形态分析，点击“树状结构总计”，并选中“树突总计”选项框。
    5. 对于树突棘形态分析，点击“树突棘”，然后选中“树突棘详细信息”选项框。
    6. 右键点击输出表格，选择“保存到文件”，将结果保存为文本（.txt）文件。
    7. 点击“分析”和“Sholl分析”。
    8. 将起始半径设为10 μm，半径增量设为10 μm。
    9. 勾选“树突”选项框，然后点击“显示”。
    10. 右键点击输出表格，选择“保存到文件”，将结果保存为文本（.txt）文件。

6. 数据分析

1. 分析神经元形态学数据（即树突分支复杂性）。
   1. 将每个分支级次的树突数量相加，再除以树突总数，乘以100，计算每个分支级次树突数量的相对频率。
2. 分析Sholl分析数据，以评估神经元树突分支的复杂性及树突棘的连接情况。
   1. 计算每个半径处交点数量的平均值及平均值的标准误差。
   2. 根据树突棘类型（即细长型、短粗型、蘑菇型）分别统计每个半径处的树突棘数量，再除以该类型树突棘的总数，乘以100，计算每个半径处各类型树突棘数量的相对频率。

结果

在图2A中，通过弹道标记技术鉴定了大鼠脑切片海马区典型的锥体神经元，其特征为具有一条较大的顶端树突以及胞体周围若干较小的基底树突。图2B展示了在神经元重建定量分析软件中检测到胞体、追踪树突分支并识别树突棘后的神经元。随后，使用神经元重建定量分析软件对数据进行分析，从而能够评估树突分支复杂性（图2C）和神经元树突丛复杂性（图2D）。

在图2C中，我们采用来自“Tree Totals”输出的离心分支分级方法，统计沿每条树突所经过的段数，并确定分支级数。对1–15级分支的各分支级段的相对频率进行了分析。当各组间树突分支分布出现变化时，可推断树突分支复杂性发生改变。此外，为进一步评估神经元树突分支复杂性，进行了Sholl分析，即在每个样本切片中量化从胞体起每10 µm处树突相交的次数（

讨论

在本实验方案中，我们描述了一种适用于大鼠脑组织神经元及体外培养神经元的通用标记技术。此外，我们还介绍了如何使用神经元重建软件和神经元重建定量分析软件来评估神经元形态和树突棘的方法。对神经元形态和树突棘的评估有助于揭示树突分支复杂性、神经元树突结构复杂性、树突棘形态以及突触连接性的变化。

在实施该方案时，研究人员应特别注意以下几个步骤。首先，使用4%多聚甲醛（PFA）后固定时间过长会破坏脂溶性膜的完整性，导致染料从细胞内泄漏。其次，与脑切片中仅靶向神经元的弹道标记特异性相比，在体外对原代皮层神经元进行标记时会引入胶质细胞的非特异性标记，因为脑切片中的弹道标记并不特异于某一种神经元类型（例如锥体神经元、中等棘状神经元或颗粒细胞）。因此，应将Bregma坐标、形态学评估或特异性细胞标志物与弹道标记方法结合使用。第三，脑切片的厚度可在200–500 µm之间；为获得最佳效果，应对此进行优化。第四，标记效率和染料渗透程度受多种因素影响，包括氦气压力、弹道喷射后的孵育时间、DiI/钨珠比例、网格筛与脑切片表面之间的距离等，因此该方案应根据每项研究的具体情况进行优化。第五，在制备过程中必须避免出...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20Gx25mm 精密针头	BD	305175
24 孔细胞培养板	Costar	3562
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek 公司	P35G-1.5-20-C
抗生素-抗真菌素溶液	Cellgro	30004CI	100X
B-27 添加剂	Life Technologies	17504-044	50X
枪管衬管	BIO-RAD	165-2417
硼砂	Sigma	B9876
硼酸	Sigma	B0252
弹匣架	BIO-RAD	165-2426
共聚焦成像软件	Nikon	EZ-C1	版本 3.81b
共聚焦显微镜	Nikon	TE-2000E
盖玻片	VWR	637-137
DilC18(3)	Fisher Scientific	D282
DMEM/F12 培养基	Life Technologies	10565-018
Dumont #5 镊子	World Precision Instruments	14095
Dumont #7 镊子	World Precision Instruments	14097
F344 大鼠	(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
葡萄糖	VWR	101174Y
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
HBSS	Sigma	H4641	10X
Helios 扩散屏	BIO-RAD	165-2475
Helios 基因枪试剂盒	BIO-RAD	165-2411
Helios 基因枪系统	BIO-RAD	165-2431
氦气软管组件	BIO-RAD	165-2412
虹膜镊	World Precision Instruments	15914
虹膜剪	World Precision Instruments	500216
二氯甲烷	Fisher Scientific	D150-1
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103-049
Neurolucida 360 软件	mbf bioscience		树突棘分析
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127-500G
多聚甲醛	Sigma	P6148
聚-L-赖氨酸	Sigma	P9155
聚乙烯吡咯烷酮	Fisher Scientific	5295
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Fisher Scientific	P36930	封片介质
大鼠脑切片模具，300 - 600 g，冠状位，0.5 mm	Ted Pella	15047
七氟烷	Merritt Veterinary Supply	347075
碳酸氢钠	Life Technologies	25080
SuperFrost Plus 载玻片	Fisher Scientific	12-550-154%
注射器套件	BIO-RAD	165-2421
Tefzel 管路	BIO-RAD	165-2441
胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	15400-054
管路切割器	BIO-RAD	165-2422
管路预处理站	BIO-RAD	165-2418
钨 M-25 微载体 1.7 µm	BIO-RAD	165-2269
Vannas 剪刀	World Precision Instruments	500086