标准化外科小鼠模型中骨关节炎的组织形态计量学评估

摘要

本方案建立了一种严格且可重复的方法，用于量化伴随骨关节炎发生的关节形态学变化。该方案的应用在监测骨关节炎疾病进展和评估治疗干预效果方面具有重要价值。

摘要

骨关节炎（OA）是美国最常见的关节疾病之一，其特征是髋关节和膝关节的关节软骨发生进行性退变，严重影响患者的活动能力和生活质量。迄今为止，尚无能够减缓或抑制软骨退变的治愈性疗法。目前，大量研究正在致力于阐明骨关节炎的病理机制，并探索可有效减缓、阻止甚至逆转骨关节炎进展的新型治疗策略或药物。因此，建立一种定量且可重复的方法，以准确评估关节软骨、滑膜及软骨下骨中与骨关节炎相关的病理改变，显得尤为关键。目前，骨关节炎的严重程度和进展主要通过国际骨关节炎研究学会（OARSI）或Mankin评分系统进行评估。尽管这些评分系统具有重要意义，但它们属于半定量方法，易受操作者主观判断的影响。更重要的是，它们难以准确评估疾病早期阶段或治疗初期软骨中那些细微但重要的变化。本文所描述的方案采用一种计算机化、半自动化的组织形态计量学软件系统，建立了一套标准化、严谨且可重复的定量方法，用于评估骨关节炎中的关节改变。该方案是对现有评估体系的有力补充，能够更高效地检测关节中的病理变化。

引言

骨关节炎（OA）是美国最常见的关节疾病之一，其特征是髋关节和膝关节的关节软骨发生进行性退变，严重影响患者的活动能力和生活质量^1,2,3。关节软骨是滑膜关节中一种特化的结缔组织，其功能在于减少摩擦、促进运动并承受关节压缩力⁴。关节软骨主要由两种成分构成：软骨细胞和细胞外基质。软骨细胞是一类特化的、代谢活跃的细胞，在细胞外基质的发育、维持和修复过程中起主要作用⁴。软骨细胞肥大（CH）是骨关节炎发展过程中的主要病理特征之一，表现为细胞体积增大、蛋白聚糖生成减少以及软骨基质降解酶的生成增加，最终导致软骨退变^5,6,7。此外，关节软骨下骨和滑膜的病理改变在骨关节炎的发生和发展中也发挥着重要作用^8,9,10,11,12。迄今为止，尚无能够抑制软骨退变的治愈性疗法^1,2,3,13,14。因此，目前有大量研究致力于阐明骨关节炎的病理机制，并探索能够延缓甚至阻止疾病进展的新型治疗策略。相应地，迫切需要一种定量且可重复的方法，以准确评估关节软骨、滑膜和软骨下骨中与骨关节炎相关的病理变化。

目前，骨关节炎（OA）的严重程度和进展主要通过OARSI或Mankin评分系统进行评估¹⁵。然而，这些评分系统仅为半定量方法，且可能受到操作者主观性的影响。更重要的是，它们无法准确评估疾病过程中或在基因操作或治疗干预后关节内发生的细微变化。文献中偶有报道描述对软骨、滑膜或软骨下骨进行组织形态计量学分析^{16,17,18,19,20,21}。然而，目前仍缺乏针对这些关节组分进行严格且可重复的组织形态计量学分析的详细操作方案，该领域尚存未满足的需求。

为了通过组织形态计量学分析研究骨关节炎（OA）的病理变化，我们采用了一种手术诱导的OA小鼠模型，通过内侧半月板失稳（DMM）来诱导OA。在已建立的小鼠OA模型中，本研究选择了DMM模型，因其造成的损伤机制创伤较小^{22,23,24,25,26}。与半月板-韧带损伤（MLI）或前交叉韧带损伤（ACLI）手术相比，DMM诱导的OA进展更为缓慢，更类似于人类OA的发展过程^22,24,25,26。在DMM手术后12周处死小鼠，以评估关节软骨、软骨下骨和滑膜的改变。

本实验方案的目标是建立一种标准化、严谨且定量的方法，用于评估伴随骨关节炎（OA）发生的关节变化。

方案

十二周龄雄性C57BL/6小鼠购自Jax Labs。所有小鼠以每笼3–5只的密度饲养于微隔离笼中，饲养环境维持12小时光照/12小时黑暗循环。所有动物实验操作均依照美国国立卫生研究院（NIH）规定进行 实验动物护理和使用指南 并经宾夕法尼亚州立大学动物护理与使用委员会批准。

1. 创伤后骨关节炎（PTOA）手术模型

1. 通过腹腔注射使用氯胺酮（100 mg/kg）/赛拉嗪（10 mg/kg）组合麻醉小鼠，通过腹腔注射给予布托啡诺（1 mg/kg）以缓解疼痛，并剃除膝关节区域的毛发。在开始手术前检查小鼠是否缺乏足底反射。
2. 按照先前描述的方法进行内侧半月板失稳（DMM）手术^22,23。
   注：有关更详细的手术方案信息，请参阅 Glasson 等人和 Singh 等人的参考文献^22,23。
   1. 从右侧膝关节髌骨远端至胫骨平台近端做一条3 mm的纵向切口。使用缝线将髌腱移位。
   2. 在肌腱内侧切开关节囊，并移动髌下脂肪垫，以暴露髁间区域、内侧半月板及半月板胫骨韧带²³。
   3. 切断内侧半月板胫骨韧带以完成DMM并使关节失稳^22,23。使用钉书针或缝线关闭切口。
3. 假手术组采用类似操作步骤，但不切断内侧半月板胫骨韧带。
   注：小鼠被随机分配接受DMM手术或假手术。根据已发表的文献，小鼠在DMM手术后12周会发展出显著的创伤后骨关节炎（PTOA）^22,23,24。

2. 小鼠安乐死与样本采集

1. 小鼠安乐死
   1. 在DMM手术后12周，通过腹腔注射使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）组合对小鼠进行麻醉。
   2. 沿胸廓正中线切开皮肤，牵开肋骨以暴露心脏，进行灌注固定²⁷。
      注：有关啮齿类动物正确固定的方案以及设备组装和操作流程的视频演示，请参阅Gage等人的参考文献²⁷。
   3. 根据制造商的说明设置灌注装置。
   4. 通过左心室灌注肝素化生理盐水，直至血液完全清除、肝脏变为苍白色，随后灌注10%中性缓冲福尔马林，直至小鼠全身完全固定。
      注：成功完成灌注的小鼠身体会变得僵硬。使用自动泵系统的平均灌注时间为5–7分钟。
2. 样本采集与制备
   1. 在股骨和胫骨中段处切断骨骼，分离周围肌肉组织，以分离膝关节。
   2. 将膝关节置于室温下的10%中性缓冲福尔马林中继续固定24小时，随后在4 ˚C下固定6天。
   3. 将样本置于EDTA脱钙缓冲液中，在室温下轻微震荡孵育1周进行脱钙²⁸。每3天更换一次脱钙缓冲液。
      注：脱钙缓冲液的配制方法为将140 g超纯EDTA四钠溶解于850 mL蒸馏水与15 mL冰醋酸的混合液中，逐滴加入冰醋酸调节pH至7.6。当pH达到7.6后，用蒸馏水定容至1 L。脱钙缓冲液需新鲜配制，并在配制后1周内使用。
   4. 依次用50%乙醇和70%乙醇各洗涤膝关节15分钟，然后进行包埋前处理。
      注：液体转移处理由宾夕法尼亚州立大学米尔顿·S·赫尔希医学中心分子与组织病理学核心实验室完成。有关最佳样本处理建议，请咨询所在机构的组织学核心实验室。
   5. 将小鼠膝关节包埋于石蜡中，使关节内侧面向石蜡块底面。包埋过程中对胫骨侧关节施加轻微压力，以确保胫骨和股骨表面尽可能处于同一平面。

3. 切片机切片与玻片选择

1. 切片机切片
   1. 使用切片机样品夹上的平面调节旋钮，确保样品块的切面方向正确。
   2. 修整石蜡包埋块，使股骨远端、胫骨近端以及内侧半月板的前角和后角处于同一平面，以便收集切片（补充图1A）。当内侧半月板的前角与后角开始分离时，开始在载玻片上收集切片。
   3. 通过比较各结构的大小，确认胫骨、股骨和半月板处于同一平面。胫骨与股骨的大小应相近，两个半月板角的大小和形状也应相似（补充图1A）。若某一结构相对于其对应结构显得过大，则表明需要进一步修面。重要的是，需确认关节腔结构保持完整。
   4. 对石蜡包埋的小鼠膝关节样本，沿内侧关节腔进行5 μm厚的矢状面切片，并将切片收集于载玻片上。每个石蜡块收集约30张切片。
2. 载玻片选择
   1. 从第5张切片开始，每隔50 μm选取一张具有代表性的切片，每个样本共选取三张（即第5、15和25张切片）。所选载玻片将用于后续染色、OARSI评分及组织形态计量学分析。
      注意：对于共30张切片的石蜡块，应从切片集合的起始段（第5–10张）、中段（第15–20张）和末段（第25–30张）中选取，以充分代表整个样本。不同样本之间应选择相同深度水平的切片。

4. 苏木精、沙黄和固绿染色

1. 用三次更换的二甲苯对所选切片进行脱蜡。依次用两次更换的100%乙醇、两次更换的95%乙醇和一次更换的70%乙醇对切片进行水化。
2. 用苏木精染色7分钟，然后用流水冲洗10分钟。用快绿染色3分钟，再在1.0%冰醋酸中漂洗10秒。用番红O染色5分钟，随后浸入0.5%冰醋酸中快速漂洗。
3. 将切片在两次更换的蒸馏水中漂洗，然后自然晾干。
4. 用三次更换的二甲苯对切片透明处理，每次5分钟，然后使用基于二甲苯的封片介质和盖玻片封片。
   注意：苏木精作为细胞核染料，用于识别骨髓区域。番红O用于染色软骨、蛋白聚糖、黏液和肥大细胞颗粒。快绿用作骨组织的对比染色。

5. 载玻片成像

1. 使用显微镜上连接的相机及基于计算机的成像软件，对番红O-固绿染色的切片进行成像。
2. 打开成像软件（参见材料表），将膝关节感兴趣区域（ROI）置于成像窗口中央。若使用可旋转的显微镜载物台，需调整切片方向，使胫骨表面沿成像区域水平轴方向展开。
3. 在开始成像一组样本前，设置相机的白平衡（补充图2）。以4倍和10倍放大倍数对关节腔进行成像，确保每个图像的感兴趣区域均包含胫骨和股骨关节面以及胫骨下软骨骨组织（补充图1A、B）。保存所选三个层面的图像，用于OARSI评分。
   注意：相机白平衡的设置取决于所使用的软件和相机系统。通常需进入相机选项卡或主成像菜单，向下滚动至设置白平衡选项。点击设置白平衡后，屏幕上应出现一个小光标或图标（补充图2A）。使用该光标选择图像或样本中无染色的区域（如关节腔）以完成白平衡设置。

6. 国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分¹⁵

1. 从所有样本中随机选取三张番红O-快绿染色切片。
2. 由三位观察者以盲法方式进行OARSI评分。简要步骤如下：按随机顺序每次显示一张图像，由三位观察者分别对每张图像进行评分，对应于每个样本所选的三个层面之一。
   注：详细的评分标准请参考OARSI评分表¹⁵。
3. 根据每位观察者的评分结果，计算每个切片的平均得分；再通过三个代表性切片的平均得分，确定每个样本的最终平均评分。

7. 组织形态计量学分析

注意：使用显微镜摄像头在触摸屏显示器上观察膝关节的实时图像，并用触控笔手动勾画感兴趣区域（ROI）。组织形态计量学软件内置的算法将对所定义的感兴趣区域内的指定参数进行量化（见下文方案）。重要的是，用于OARSI评分的同一张番红O-快绿染色切片将用于组织形态计量学分析。

1. 软件设置与测量准备
   1. 打开显微镜、相机、计算机和触摸屏显示器。点击 软件图标 启动软件程序。将玻片放置在显微镜载物台上进行观察。
   2. 将样本置于测量窗口中央。确保测量网格的放大倍数与显微镜所使用的物镜相匹配（补充图3）。
   3. 点击屏幕顶部的 文件 选项卡，向下滚动至 读取设置。打开 设置 窗口，并选择与待测参数相对应的设置文件。
   4. 从屏幕右侧的列表中选择待测参数（补充图3）。使用触控笔或鼠标光标，按照下文所述步骤描记图像，以测量特定组织感兴趣区域（ROI）。每次测量完成后，右键单击 结束当前测量，并继续下一参数的测量。
      注：待测参数列表由一个独立的偏好文件创建，该文件需与软件公司协商设置，用于测量所述的感兴趣区域。有关完整设置的更多细节，请参见讨论部分。
   5. 完成所有测量后，转至软件界面底部的 汇总数据 选项卡（补充图3）。点击屏幕窗口，按下键盘上的 Insert 键，或将数据复制粘贴至另一个电子表格中。
      注：组织形态计量分析应以随机化和盲法方式进行。在完成所有样本的所有参数测量后，整理数据并对每个样本的三张玻片测量值取平均。
2. 总软骨、钙化软骨和非钙化软骨面积的测量
   注：使用市售软件（见 材料表）执行以下步骤。有关本节中讨论的软骨区域、连接处及软骨下骨区域的说明，请参见 补充图1B、C。
   1. 在胫骨软骨表面的上缘处画一条线，即软骨与关节腔交界的位置。在钙化软骨与软骨下骨交界的软骨-骨交界处画第二条线（图1B）。使用软件的 面积 功能自动获取总软骨面积的测量值。
   2. 沿潮线（tidemark）画一条线，该线是天然存在的钙化与非钙化软骨区域的分界线。在钙化软骨与软骨下骨交界的软骨-骨交界处画第二条线（图1B）。使用软件的 面积 功能自动获取钙化软骨面积的测量值。
   3. 通过从总软骨面积中减去钙化软骨面积，计算非钙化软骨面积（图1B）。
3. 软骨细胞数量与表型的确定
   1. 在组织形态计量软件的设置中创建独立的计数功能，以区分产基质和非产基质的软骨细胞（图1B）。
   2. 使用触控笔在表达特定表型的每个软骨细胞上方点一个小点，以确定产基质或非产基质软骨细胞的数量（图1B）。
      注：根据细胞表型进行计数，分为产基质型（即番红O染色强阳性）和非产基质型（即番红O染色极弱或无染色）。
4. 胫骨关节面周长的测量
   1. 通过沿胫骨软骨表面描记一条线，仔细界定各个纤维化区域，测量胫骨关节面的绝对周长（图1C）。
   2. 沿潮线画第二条线，作为各切片平面的内部对照（图1C）。
   3. 通过将胫骨关节面周长除以潮线周长，计算胫骨关节面纤维化指数。
      注：潮线周长在各样本间通常相近，因此无论使用绝对周长还是纤维化指数，假手术组与DMM组之间的关节面周长差异通常较小。
5. 软骨下骨与骨髓腔面积的测量
   1. 使用 面积 功能测量软骨下骨髓腔面积，勾勒出仅被苏木精染色（即快绿染色阴性）的软骨下区域，以确定软骨下骨内的总骨髓腔面积。围绕这些区域的边缘画线，以确定胫骨软骨下骨内所有骨髓腔的总面积（图2B）。
   2. 使用面积功能测量总软骨下骨面积，勾勒出软骨-骨交界处与生长板上缘之间的区域，并向外延伸至前后骨赘区域（图2B）。
   3. 通过从总软骨下骨面积中减去软骨下骨髓腔面积，计算软骨下骨面积（图2B、C）。
6. 前后骨赘面积的测量
   1. 使用 面积 功能描记近端胫骨的前、后骨赘，以测量骨赘面积（图2B、E、F）。
      注：骨赘是位于关节软骨与生长板之间、软骨下区域前或后方的骨性突起。胫骨前、后侧的骨赘面积通过描记软骨下骨前或后方的区域确定。骨赘与软骨下骨之间的交界由一条从关节软骨延伸至生长板的细胞线清晰界定。骨赘与滑膜之间的交界则由骨组织与纤维组织的过渡区定义。
7. 滑膜厚度的测量
   1. 使用 面积 功能测量股骨前方滑膜厚度，从滑膜在股骨上的内侧附着点向其在半月板上的附着点画一条线（图3B）。
   2. 从滑膜在股骨上的外侧附着点向其在半月板上的附着点画第二条线（图3B）。
   3. 通过将总滑膜面积除以滑膜周长，计算滑膜厚度。

8. 统计分析

1. 收集测量参数，并对每个样本的三个代表性区域的结果取平均值。使用非配对的 Student t 检验比较两组，或使用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较三组或更多组。
2. 以均值 ± 均值标准误的形式展示数据。
   注意：当 p ≤ 0.05 时认为具有统计学显著性。

结果

DMM诱导的骨关节炎导致关节软骨退变和软骨细胞丢失
与假手术小鼠相比，DMM诱导的骨关节炎导致OARSI评分升高，其特征明显表现为关节表面糜烂和软骨丢失（图1A，D）。本文详述的组织形态计量学方案检测到多种与骨关节炎相关的改变，包括总软骨面积和未钙化软骨面积的减少（图1A，B，E，G）；总软骨细胞数量减少；以及重要的是，产基质软骨细胞的丢失（图1H，I）。关节表面的改变可反映糜烂的严重程度，通过软骨纤维化指数进行评估。总体而言，DMM小鼠的纤维化指数升高（图1C，K，L）。然而，还需注意的是，在终末期骨关节炎中，由于软骨表面完...

讨论

近年来，骨关节炎研究加深了我们对关节内不同组织之间相互作用及其在疾病发生或进展中所起作用的理解^8,9,10,35,36。因此，显然骨关节炎的评估不应局限于软骨分析，还应包括对软骨下骨和滑膜的分析。尽管如此，关节软骨仍是骨关节炎半定量评分的主要关注点^15,37,38。虽然计算组织形态计量学已应用于肌肉骨骼研究的多个领域^{39,40,41,<...}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 磷酸缓冲福尔马林	Fisher Chemical	SF100-20	用于收获后样本的固定
冰醋酸（分析纯，经认证符合 ACS 标准）	Fisher Chemical	A38S-212	用于脱钙缓冲液及染色用醋酸溶液的配制
Cintiq 27QHD 创意数位屏	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	用于组织形态计量分析与成像
Cintiq Ergo 支架	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	用于组织形态计量分析与成像
乙二胺四乙酸四钠盐二水合物，99%	Acros Organics	AC446080010	用于脱钙缓冲液的配制
快绿染液	SIGMA Life Sciences	F7258	用于样本染色
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher	12-550-15	用于样本切片的收集
HistoPrep 二甲苯	Fisherbrand	HC-700-1GAL	用于样本脱蜡和染色
Histosette II 组织包埋盒——组合盖与底座	Fisher	15-182-701A	用于样本处理与包埋
HP Z440 工作站	HP	Product number: Y5C77US#ABA	用于组织形态计量分析与成像
手动旋转式切片机	Leica	RM 2235	用于样本切片
标记笔	Leica	3801880	用于样本、包埋盒和载玻片的标记
OLYMPUS BX53 显微镜	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/	用于组织形态计量分析与成像
OLYMPUS DP 73 显微镜相机	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/	用于组织形态计量分析与成像（已停产）
ORION STAR A211 pH 计	Thermo Scientific	STARA2110	用于脱钙缓冲液的配制
OsteoMeasure 软件	OsteoMetrics	https://www.osteometrics.com/index.htm	用于组织形态计量测量与分析
Perfusion Two 自动压力灌注系统	Leica	Model # 39471005	用于小鼠膝关节的收获
PRISM 7 软件	GraphPad	Institutional Access Account	统计分析
番红O染液	SIGMA Life Sciences	S8884	用于样本染色
ThinkBoneStage — 旋转显微镜载物台	Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics（供应商）	http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php	用于组织形态计量分析与成像
Wacom Pro Pen 触控笔	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	用于组织形态计量分析与成像
Weigert 铁苏木素 A 液	Fisher	5029713	用于苏木素染色
Weigert 铁苏木素 B 液	Fisher	5029714	用于苏木素染色