标准化外科小鼠模型中骨关节炎的组织形态计量学评估

摘要

本方案建立了一种严格且可重复的方法，用于量化伴随骨关节炎发生的关节形态学变化。该方案的应用在监测骨关节炎疾病进展和评估治疗干预效果方面具有重要价值。

摘要

骨关节炎（OA）是美国最常见的关节疾病之一，其特征是髋关节和膝关节的关节软骨发生进行性退变，严重影响患者的活动能力和生活质量。迄今为止，尚无能够减缓或抑制软骨退变的治愈性疗法。目前，大量研究正在致力于阐明骨关节炎的病理机制，并探索可有效减缓、阻止甚至逆转骨关节炎进展的新型治疗策略或药物。因此，建立一种定量且可重复的方法，以准确评估关节软骨、滑膜及软骨下骨中与骨关节炎相关的病理改变，显得尤为关键。目前，骨关节炎的严重程度和进展主要通过国际骨关节炎研究学会（OARSI）或Mankin评分系统进行评估。尽管这些评分系统具有重要意义，但它们属于半定量方法，易受操作者主观判断的影响。更重要的是，它们难以准确评估疾病早期阶段或治疗初期软骨中那些细微但重要的变化。本文所描述的方案采用一种计算机化、半自动化的组织形态计量学软件系统，建立了一套标准化、严谨且可重复的定量方法，用于评估骨关节炎中的关节改变。该方案是对现有评估体系的有力补充，能够更高效地检测关节中的病理变化。

引言

骨关节炎（OA）是美国最常见的关节疾病之一，其特征是髋关节和膝关节的关节软骨发生进行性退变，严重影响患者的活动能力和生活质量^1,2,3。关节软骨是滑膜关节中一种特化的结缔组织，其功能在于减少摩擦、促进运动并承受关节压缩力⁴。关节软骨主要由两种成分构成：软骨细胞和细胞外基质。软骨细胞是一类特化的、代谢活跃的细胞，在细胞外基质的发育、维持和修复过程中起主要作用⁴。软骨细胞肥大（CH）是骨关节炎发展过程中的主要病理特征之一，表现为细胞体积增大、蛋白聚糖生成减少以及软骨基质降解酶的生成增加，最终导致软骨退变^5,6,7。此外，关节软骨下骨和滑膜的病理改变在骨关节炎的发生和发展中也发挥着重要作用^{8,9,10,11,<....}

方案

十二周龄雄性C57BL/6小鼠购自Jax Labs。所有小鼠以每笼3–5只的密度饲养于微隔离笼中，饲养环境维持12小时光照/12小时黑暗循环。所有动物实验操作均依照美国国立卫生研究院（NIH）规定进行 实验动物护理和使用指南 并经宾夕法尼亚州立大学动物护理与使用委员会批准。

1. 创伤后骨关节炎（PTOA）手术模型

1. 通过腹腔注射使用氯胺酮（100 mg/kg）/赛拉嗪（10 mg/kg）组合麻醉小鼠，通过腹腔注射给予布托啡诺（1 mg/kg）以缓解疼痛，并剃除膝关节区域的毛发。在开始手术前检查小鼠是否缺乏足底反射。
2. 按照先前描述的方法进行内侧半月板失稳（DMM）手术^22,23。
   注：有关更详细的手术方案信息，请参阅 Glasson 等人和 Singh 等人的参考文献^22,23。
   1. 从右侧膝关节髌骨远端至胫骨平台近端做一条3 mm的纵向切口。使用缝线将髌腱移位。
   2. 在肌腱内侧切开关节囊，并移动髌下脂肪垫，以暴露髁间区域、内侧半月板及半月板胫骨韧带²³。
   3. 切断内侧....

结果

DMM诱导的骨关节炎导致关节软骨退变和软骨细胞丢失
与假手术小鼠相比，DMM诱导的骨关节炎（OA）导致OARSI评分显著升高，其特征表现为明显的表面糜烂和软骨丢失（图1A，D）。本文详述的组织形态测量分析方法检测到了多种与OA相关的改变，包括总软骨面积和未钙化软骨面积的减少（图1A，B，E，G）；总软骨细胞数量减少；以及关键性的基质生成型软骨细胞的丢失（图1H，I）。关节表面的改变可反映糜烂的严重程度，通过软骨纤维化指数进行评估。总体而言，DMM小鼠的纤维化指数升高（图1C，K，L）。然而，也需注意，在OA晚期阶段，由于软骨表.......

讨论

近年来，骨关节炎研究加深了我们对关节内不同组织之间相互作用及其在疾病发生或进展中所起作用的理解^8,9,10,35,36。因此，显然骨关节炎的评估不应局限于软骨分析，还应包括对软骨下骨和滑膜的分析。尽管如此，关节软骨仍是骨关节炎半定量评分的主要关注点^15,37,38。虽然计算组织形态计量学已应用于肌肉骨骼研究的多个领域^{39,40,41,<.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 磷酸缓冲福尔马林	Fisher Chemical	SF100-20	用于收获后样本的固定
冰醋酸（分析纯，经认证符合 ACS 标准）	Fisher Chemical	A38S-212	用于脱钙缓冲液及染色用醋酸溶液的配制
Cintiq 27QHD 创意数位屏	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	用于组织形态计量分析与成像
Cintiq Ergo 支架	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	用于组织形态计量分析与成像
乙二胺四乙酸四钠盐二水合物，99%	Acros Organics	AC446080010	用于脱钙缓冲液的配制
快绿染液	SIGMA Life Sciences	F7258	用于样本染色
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher	12-550-15	用于样本切片的收集
HistoPrep 二甲苯	Fisherbrand	HC-700-1GAL	用于样本脱蜡和染色
Histosette II 组织包埋盒——组合盖与底座	Fisher	15-182-701A	用于样本处理与包埋
HP Z440 工作站	HP	Product number: Y5C77US#ABA	用于组织形态计量分析与成像
手动旋转式切片机	Leica	RM 2235	用于样本切片
标记笔	Leica	3801880	用于样本、包埋盒和载玻片的标记
OLYMPUS BX53 显微镜	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/	用于组织形态计量分析与成像
OLYMPUS DP 73 显微镜相机	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/	用于组织形态计量分析与成像（已停产）
ORION STAR A211 pH 计	Thermo Scientific	STARA2110	用于脱钙缓冲液的配制
OsteoMeasure 软件	OsteoMetrics	https://www.osteometrics.com/index.htm	用于组织形态计量测量与分析
Perfusion Two 自动压力灌注系统	Leica	Model # 39471005	用于小鼠膝关节的收获
PRISM 7 软件	GraphPad	Institutional Access Account	统计分析
番红O染液	SIGMA Life Sciences	S8884	用于样本染色
ThinkBoneStage — 旋转显微镜载物台	Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics（供应商）	http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php	用于组织形态计量分析与成像
Wacom Pro Pen 触控笔	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	用于组织形态计量分析与成像
Weigert 铁苏木素 A 液	Fisher	5029713	用于苏木素染色
Weigert 铁苏木素 B 液	Fisher	5029714	用于苏木素染色