手术小鼠模型中骨关节炎的标准化形态学评价

OA是美国最常见的关节疾病之一，其特征是关节软骨逐渐退化，主要在髋关节和膝关节，对患者的流动性和生活质量产生显著影响^{11，2，3。2,3}关节软骨是二关节的专用结缔组织，旨在最大限度地减少摩擦、促进运动和承受关节压缩^4。关节软骨由两个主要成分组成:软骨细胞和细胞外基质。软细胞是专门、代谢活性细胞，在细胞外基质⁴的开发、维护和修复中起着主要作用。软骨细胞肥大 （CH） 是 OA 发育的主要病理体征之一。其特征是细胞体积增加，蛋白酶产量减少，软骨基质降解酶的产量增加，最终导致软骨退化^{55，6，7。6,7}此外，关节下骨和关节的病理变化在OA^,9,10,11,发育和进展^中起^{重要作用。}迄今为止，目前还没有抑制软骨退化的疗法^{11、2、3、13、14。2,3,13,14}因此，有广泛的正在进行的研究，旨在了解OA病理学和发现新的治疗方法，能够减慢，甚至停止OA。因此，越来越需要定量和可重复的方法，以便准确评估关节软骨、阴骨和下骨的OA相关病理变化。

目前，OA 严重性和进展主要使用 OARSI 或曼金评分系统¹⁵进行评估。然而，这些计分系统只是半定量的，并且可能受用户主观性的影响。更重要的是，它们未能准确评估在疾病期间关节或对基因操纵或治疗干预的反应的细微变化。文献中有零星的报告，描述软骨、阴囊或下骨的形态学分析16、17、18、19、20、21。^{16,17,18,19,20,21}然而，对于所有这些关节成分进行严格和可重复的形态分析的详细协议仍然缺乏，这在现场造成了未满足的需求。

为了研究OA的病理变化，使用组织学分析，我们使用手术OA小鼠模型诱导OA通过中膜半月板（DMM）的不稳定。在已建立的鼠OA模型中，DMM被选作我们的研究，因为它涉及伤害的创伤性较小机制22、23、24、25、26。^{22,23,24,25,26}与男性韧带损伤（MLI）或前十字韧带损伤（ACLI）手术相比，DMM促进OA的逐步进展，类似于OA在人类^{22，24，25，2624,25,26}的发育²²。小鼠在DMM手术后12周被安乐死，以评估关节软骨、下骨和阴离子的变化。

该协议的目标是建立一个标准化、严格和定量的方法，以评估随 OA 附带的联合更改。

十二周大的雄性C57BL/6小鼠是从Jax实验室购买的。所有小鼠都被安置在每微隔离器笼子里3~5只老鼠的组，在一个12小时深沉的房间里。所有动物程序均根据国家卫生研究所（NIH）实验室动物护理和使用指南执行，并经宾夕法尼亚州立大学动物护理和使用委员会批准。

1. 创伤后骨关节炎（PTOA）手术模式

1. 通过腹内注射，用氯胺酮（100毫克/千克）/xylazine（10mg/kg）组合麻醉小鼠，通过腹内注射施用丁丙诺啡（1mg/kg），以缓解疼痛，并扫描膝盖上的头发。在开始手术之前，检查是否缺乏踏板反射。
2. 执行破坏中膜半月板（DMM）手术的不稳定，如先前描述的^{2222，23。23}
   注:请参阅Glasson等人和辛格等人的参考资料，了解更详细的手术方案信息^{22、23。22,}
   1. 从右膝关节的远端骨裂到近端骨高原，进行3毫米纵向切口。使用缝合线来取代跟腱。
   2. 打开关节胶囊中质到肌腱和移动红外体脂肪垫可视化的间孔区域，中膜半月线，和半月韧带^23。
   3. 横断体韧带完成DMM和不稳定的关节^{22，23。22,}用订书钉或缝合线关闭切口部位。
3. 按照类似的程序进行假手术，但不分期进行内侧韧带。
   注:小鼠被随机随机接受DMM或假手术。根据先前发表的文献，小鼠在DMM手术12周后出现显著的PTOA222、23、24。^22,23,24

2. 小鼠安乐死和样品收集

1. 老鼠安乐死
   1. DMM后12周，通过腹内注射，用氯胺酮（100毫克/千克）/xylazine（10mg/kg）组合麻醉小鼠。
   2. 使一个中线切口通过皮肤沿胸部和收回肋骨笼暴露心脏灌注^27。
      注:有关适当啮齿动物固定的协议以及适当设备组装和程序^{的视频描述27，}请参阅Gage等人的参考。
   3. 根据制造商的协议设置灌注装置。
   4. 通过左心室渗透肝素盐水，使小鼠安乐死，直到血液被清除，肝脏变苍白。用 10% 的中性缓冲形式注入鼠标，直到完成鼠标固定。
      注:成功注入鼠标将变得僵硬。使用自动泵系统的平均灌注时间为 5-7 分钟。
2. 样品收集和准备
   1. 通过在股骨中和中头骨处切割骨骼来分离膝盖，并解剖周围的肌肉组织。
   2. 通过在室温下将膝关节储存在10%中性缓冲形式内，然后在4°C下连续6天，继续固定。
   3. 标记骨骼，通过将样品储存在EDTA脱钙缓冲液中1周，在室温下，在微温下^，28。每 3 天更改一次标记缓冲溶液。
      注:脱钙缓冲液通过溶解140克超纯EDTA四钠，在850mL蒸馏水溶液中加上15 mL的冰醋酸。通过在溶液中滴下添加冰醋酸，缓冲液被pH平衡到7.6。达到 pH = 7.6 后，缓冲液与蒸馏水的总体积达到 1 L。脱化缓冲液是新鲜准备的，在准备后1周内使用。
   4. 用50%乙醇清洗膝盖，然后每洗15分钟乙醇，然后加工嵌入。
      注:流体转移处理由宾夕法尼亚州米尔顿·赫希医疗中心的分子和组织病理学核心进行。有关最佳样品处理的建议，请咨询机构的能力学核心。
   5. 将鼠标膝盖嵌入石蜡中，将关节的中段面朝向石蜡块的底部表面。在嵌入过程中，对接头的胎面施加轻微压力，以确保头骨和股骨表面尽可能接近同一平面。

3. 微托姆切片和幻灯片选择

1. 微托姆切片
   1. 使用微缩块支架上的平面调节旋钮，确保样品块的正确面对。
   2. 面对石蜡块，使股骨的远端面、头骨的近端区域以及中腹半月板的前角和后角出现在同一平面上，用于截面收集（补充图 1A）。当中月板的前角和后角开始相互分离时，开始收集幻灯片上的部分。
   3. 通过比较结构尺寸，确保头骨、股骨和月虫在同一平面上出现。头骨和股骨的大小应相当，两个月角在大小和形状上相似（补充图1A）。如果结构与其结构相比显得太大，则表明需要额外的面。重要的是，确认关节空间保持不变。
   4. 在 5 μm 部分中接合，通过中室接取石蜡嵌入小鼠膝盖的凹陷部分，并收集幻灯片上的部分。收集每个石蜡块约30个部分。
2. 幻灯片选择
   1. 从第五节开始的每个样本（即幻灯片 5、15 和 25）为每个样本选择三个 50 μm 的代表性部分。所选幻灯片将用于后续染色、OARSI 评分和态学分析。
      注:从包含 30 个总部分的块中，从设置的开头（幻灯片 5-10）、中间（幻灯片 15+20）和结束（幻灯片 25-30）中选择幻灯片，以便清楚地表示整个样本。从样本之间的相似深度级别选择幻灯片。

4. 赫马托西林、萨夫拉宁橙和快速绿色染色

1. 使用三次二甲苯更改对所选幻灯片进行去石蜡化。用两种变化来补充滑水，包括100%乙醇、两次95%乙醇的变化和一次70%乙醇的变化。
2. 用血氧林染色滑轨7分钟，然后用自来水冲洗10分钟。用快速绿色染色3分钟，用1.0%的冰醋酸冲洗10秒。用Safranin-O染色5分钟，然后迅速冲洗，浸入0.5%的冰醋酸。
3. 用两种蒸馏水冲洗滑轨，让空气干燥。
4. 在三次二甲苯变化中清除幻灯片 5 分钟，然后用基于二甲苯的安装介质和盖玻片安装。
   注:血氧素是识别骨髓区域的核污点。Safranin-O 用于染色软骨、蛋白酶、霉素和乳腺颗粒。快速绿色用作骨骼的反面。

5. 滑动成像

1. 使用连接到显微镜和基于计算机的成像软件的可用相机拍摄 Safranin-O 和快速绿色彩色幻灯片。
2. 打开成像软件（参见材料表），并在成像窗口中心安排感兴趣的膝关节区域 （ROI）。如果使用旋转显微镜滑动阶段，则对齐幻灯片，使头骨表面跨越成像区域水平轴的宽度。
3. 在开始成像一组样本之前设置摄像机的白平衡（补充图 2）。以 4 倍和 10 倍的放大倍数对关节室进行成像，确保骨骼和股骨表面和骨骼下骨都包含在每个图像 RO 中（补充图 1A 、B）。保存用于 OARSI 评分的三个选定级别中的每个级别的图像。
   注: 设置摄像机的白平衡取决于所使用的软件和摄像机系统。通常，导航到"相机"选项卡或主成像菜单，然后向下滚动设置为"设置白平衡"。选择"设置白平衡"，应显示一个小光标或图标（补充图 2A）。使用光标，选择图像/样本中无污渍的区域（如关节空间）来设置白平衡。

6. 国际骨关节炎研究学会（OARSI）得分¹⁵

1. 随机化所有样品中选定的三张萨夫拉宁-O和快速绿色染色幻灯片。
2. 与三名观察者以盲目的方式进行 OARSI 评分。简而言之，以随机顺序一次显示一个图像，并允许三个观察者对每个图像进行评分，并关联于为每个样本选择的三个级别之一。
   注:有关分级等级^表15的详细说明，请参阅 OARSI 评分表。
3. 使用每个观察者的单个分数计算每个部分的平均得分。通过取三个代表部分的平均得分来确定每个样本的平均得分。

7. 形态分析

注:使用显微镜相机在触摸屏监视器上查看膝关节的实时图像，并使用手写笔手动跟踪 RO。组织学软件的内置算法量化了定义的 ROIs 中的指定参数（请参阅下面的协议）。重要的是，OARSI评分中使用的相同Safranin-O和快速绿色染色部分用于形态学分析。

1. 软件设置和测量准备
   1. 打开显微镜、相机、计算机和触摸屏监视器。单击软件图标启动软件程序。将幻灯片放在显微镜舞台上观看。
   2. 将样品居中到测量窗口内。确保测量网格设置为适当的放大倍率，以匹配显微镜上使用的目标（补充图 3）。
   3. 转到屏幕顶部的"文件"选项卡，向下滚动到"读取设置"。打开"设置"窗口并选择要测量的参数的适当设置文件。
   4. 从屏幕右侧列表中选择要测量的参数（补充图 3）。使用手写笔或鼠标光标根据下面描述的步骤跟踪图像，以便测量特定的组织 ROI。完成每次测量后，右键单击以结束测量并继续下一个参数。
      注: 要测量的参数列表是通过与软件公司协商建立的用于测量所述 RO 的独特的首选项文件创建的。有关完整设置的详细信息，请参阅讨论。
   5. 完成所有测量，然后导航到软件屏幕底部的"摘要数据"选项卡（补充图 3）。单击屏幕窗口，点击键盘上的"插入"键或复制数据并将其粘贴到单独的电子表格中。
      注:以随机和盲目的方式执行态学分析。完成所有样品的所有参数测量后，组织数据，并对每个样本的三张幻灯片中的测量值进行平均。
2. 总、钙化和未钙化软骨区域的测量
   注: 使用市售软件（参见材料表）执行这些步骤。有关本节讨论的软骨区域、结点和下骨区域的澄清，请参阅补充图 1B、C。
   1. 在软骨与关节空间相交的骨质软骨表面的上边缘绘制一条线。在骨质软骨与下骨相交的软骨交汇处绘制第二条线（图1B）。使用软件区域功能自动获取软骨面积总测量。
   2. 沿着潮汐标记绘制一条线，这是一条自然发生的线，分离软骨的钙化和未钙化区域。在骨质软骨与下骨相交的软骨交汇处绘制第二条线（图1B）。使用软件区域功能自动获得钙化软骨面积测量。
   3. 通过从总软骨面积中减去钙化软骨面积来计算未加垢软骨面积（图1B）。
3. 确定软骨素数和表型
   1. 在组织学软件中的设置中创建单独的计数函数，以区分矩阵生成和矩阵非生成软骨（图 1B）。
   2. 通过使用手写笔在每个表达指定表型的软骨素上做一个小点，确定产生或不生产软糖的矩阵数量（图1B）。
      注:根据细胞表型将细胞计数为生成基质（即强 Safranin-O 染色）或基质不生成（即非常微弱或无 Safranin-O 染色）。
4. 头骨表面周长的测量
   1. 通过追踪横跨骨软骨表面的一条线，仔细定义单个颤动（图1C），测量绝对的骨骼表面周长。
   2. 沿潮汐标记绘制第二条线，作为每个部分平面的内部控制（图 1C）。
   3. 通过将头骨关节表面周长除以潮标周长来计算头骨表面颤动指数。
      注:在样本之间，潮标周长通常相等，因此无论使用绝对周长还是颤动指数，假和DMM之间的关节表面周周之间的差异通常很小。
5. 下骨和骨髓空间区域的测量
   1. 使用"区域"功能测量下丘拉底骨髓空间区域，仅勾勒出子骨素区域中沾有血氧素的区域（即快速绿色为负），以确定下丘德拉骨内的总骨髓空间区域。在这些区域的周长周围绘制线，以确定骨骼下所有骨髓空间的总面积（图2B）。
   2. 利用区域函数测量总子骨素区域，勾勒出骨质结与生长板的上边界之间的区域，横向延伸到前骨质和后骨质区域（图2B）。
   3. 通过从总子骨骼面积中减去下骨骼空间区域来计算下骨骼面积（图2B，C）。C
6. 前骨和后骨质区域的测量
   1. 要测量骨质区域，请使用"区域"函数（图 2B、EE、F）跟踪近端骨的骨质和后骨质。
      注:骨质是骨投影，形成在关节软骨和生长板之间，前或后到下骨节区域。头骨前侧和后侧的骨骼区域通过追踪前部或后部到下骨骼来确定。骨质骨骼和下骨骨的结点由从关节软骨延伸到生长板的细胞线清楚地划定。骨质和硅酸的结点由骨组织与纤维组织之间的过渡定义。
7. 分体厚度的测量
   1. 使用"区域"函数测量前股骨的系状厚度，从股骨上前侧联体插入点向月月板上的附件点绘制一条线（图 3B）。
   2. 从股骨上阴音的外插中绘制第二条线，使其附着在半月板上（图3B）。
   3. 通过将总音新星面积除以六诺夫体周长来计算 synovial 厚度。

8. 统计分析

1. 收集测量的参数，并为每个样本从三个代表性部分对结果进行平均。使用未配对的学生 t 检验分析数据，以比较两个组或单向 ANOVA 以比较三个或多个组。
2. 将数据显示为均值 = 均值的标准误差。
   注:统计显著性在 p = 0.05 处达到。

DMM诱导OA导致关节软骨退化和软骨损失
DMM引起的OA导致OARSI评分与假小鼠相比增加，其显著特征是表面侵蚀和软骨损失（图1A，D）。D这里详述的通体方案，发现多项OA相关变化，包括软骨总面积减少及未加垢软骨面积减少（图1A、B、E、G）;Figure 1ABEG减少总软骨素数;并且，重要的是，产生软骨细胞的矩阵损失（图1H，I）。I使用软骨颤动指数评估了关节表面的变化，指示侵蚀的严重程度。总体而言，DMM小鼠的颤动指数上升（图1C，K，L）。KL然而，还必须指出，如《议定书》所述，由于软骨表面完全侵蚀，终末期OA的颤动指数可能会下降。纤维化指数的增加表示在OA开发和进展期间关节软骨表面的退化。这些结果强调了组织形态分析程序检测和量化OA进展特征的病理软骨变化的能力。

DMM 诱导 OA 中其他关节变化的评估
OA 影响软骨以外的关节组织，这些组织的病理变化在疾病进展中起着至关重要的作用。在这里，所述的形态分析方法显示，下丘德拉骨面积增加，DMM小鼠骨髓空间面积减少（图2A+D），表明亚胆带骨硬化症29，30。,30前骨和后骨质区域也增加了DMM小鼠（图2E，F），建议正在进行的下骨重塑，作为F补偿机制，处理关节装载的变化在伤害点29，30。,30

对synovium的形态学分析表明，DMM小鼠的阴膜厚度增加（图3A+C），这是OA相关性神经炎和炎症细胞因子扩散到关节空间11、12、31、32、33、3411,12,31,32,33,34的典型结果。

OARSI评分与组织测量之间的用户间变异性分析
图4A显示未加钙软骨面积的形态学分析（图4A）和OARSI分数（图4B）均无显著的用户间变异性。然而，态学分析表明，在 -0.0001179-0.00120 之间，观察者之间的平均差极低，导致三个观察者获得的结果几乎完全重叠，而在 OARSI 分数中，观察者之间的平均差值更高，范围为 -0.3-0.3，O1 值与 O2 和 O3 值明显偏差。

图1:假手术和DMM小鼠的骨关节软骨和关节软骨表型的史托莫霍姆。（A） 带沙夫拉宁-O/快速绿色的头骨表面。（B） 组织学分析用于跟踪软骨总面积和钙化软骨面积（橙色）。比潮标区域优越的软骨被计算为未加垢软骨（绿色）。在未加垢软骨区域内计算出产生软骨（白色）和基质非生产的软骨（洋红色）的基质。（C） 通过追踪关节表面（蓝线）后跟潮汐标记（紫色线）来确定颤动指数来测量头骨表面周长。（D） OARSI 评分在 DMM 小鼠中增加。（E=L）量化软骨区域和软骨细胞计数的图形表示，来自假鼠和DMM小鼠。与假小鼠相比，DMM小鼠减少了总骨软骨面积（E）、双骨钙化软骨面积（F）、双壁非钙软骨（G）、双骨总软骨数（H）、产生软骨细胞的二叶骨基质（I）和双骨基质非生成软骨（J）。与假小鼠相比，DMM小鼠增加了骨关节表面周长（K），并增加了骨关节表面颤动指数（L）。图像拍摄使用 10 倍放大倍。*P < 0.05， *P < 0.01， *P < 0.001， 和 #P < 0.0001 使用未配对 t 检验与韦尔奇的修正， 值表示为均值 = SEM;n = 5/组。请点击此处查看此图形的较大版本。

图2:假手术和DMM小鼠下胆原骨髓区和下骨区史。（A） 带沙夫拉宁-O/快速绿色的骨骼和下骨。（B） 通过计算的骨质测量软件，追踪下骨骼区域（绿色）、下骨骼区域（洋红色）、前骨质区域（黄色）和后骨质区域（灰色）。（C=F）绘制了假鼠和 DMM 小鼠之间的形态学区域图。与假小鼠相比，DMM小鼠的骨下骨面积（C）和骨骼前和后骨质区域（E+F）增加，与假小鼠（D）相比，骨下亚胆原的骨髓面积减少。图像是使用 4 倍放大倍数拍摄的。*P < 0.05， *P < 0.01 使用未配对 t 测试与韦尔奇的修正.值表示为均值 = SEM;n = 5/组。请点击此处查看此图形的较大版本。

图3:假手术和DMM小鼠的synovium的史学。（A） 染色的 Synovium 与萨夫拉宁-O/快速绿色。（B） 通过追踪前双体骨膜（绿色）的前面来测量的六代厚度。（C） 使用计算的教条测量软件图形表示 synovial 厚度测量。与假老鼠相比，DMM小鼠的阴膜厚度增加了。图像以 20 倍的放大倍数拍摄。P < 0.001 使用未配对 t 检验与韦尔奇的修正，值表示为均值 = SEM;n = 5/组;S = synovium;F = 股骨;和M = 半月板。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 4:OARSI 评分与组织形态分析中的用户间变异性。（A） 使用三个盲视点（O1、O2、O3）使用组织造血仪进行的未加钙软骨面积测量。（B） OARSI得分的假和DMM小鼠从三个失明的观察者获得。虚线表示每个组的平均值。请点击此处查看此图形的较大版本。

补充图1:萨夫拉宁-O和快速绿色染色小鼠双叶木关节部分的组织学分析。（A） 双醇关节的 4 倍放大图像。标记焦点区域。（B） 双醇关节 ROI 的 10 倍放大图像。头骨和股骨表面以及前角和后月角被可视化。Menisci 的大小大致相同，成像 ROI 以关节隔间为中心。（C） 近端骨表面的 40 倍放大图像。潮标线标记为未加垢和钙化软骨区域之间的线。骨质结在钙化软骨末端和下骨骼开始之间标记。请点击此处下载此图。

补充图2:系统设置和摄像机白平衡校准。（A） 未设置白平衡的鼠标双体关节在软件窗口中以 4 倍的放大倍率可视化。请注意屏幕顶部的相机设置选项卡和下拉菜单中用于设置白平衡的选择。（B） 小鼠双壁莫乐关节在 4 倍放大与白平衡集。注意样品的着色和染色变化，提高用户在执行测量时区分头骨关节某些区域的能力。请点击此处下载此图。

补充图3:在组织形态分析测量之前设置组织形态学软件。形态学软件窗口的代表性屏幕截图。请注意，染色的鼠标膝部位于测量区域（黄色网格）的中心，并选择了该区域的正确放大比例，以匹配显微镜上使用的目标（在屏幕右上角以红色圆圈）。参数列表显示在成像和测量区域右侧的列中。选择参数将突出显示该参数，因此当前可以选择测量二边形颤动。窗口底部的"摘要数据"选项卡将组织并保存每个样本的每个参数的测量值，并在完成每个部分的每个参数测量后导出。请点击此处下载此图。

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