斑马鱼中源自患者的原代肿瘤异种移植药物筛选

摘要

斑马鱼异种移植模型可用于在体内微环境中对人源癌细胞进行高通量药物筛选和荧光成像。我们建立了一种工作流程，利用配备自动化荧光显微镜的成像系统，在斑马鱼中对患者来源的白血病样本进行大规模自动化药物筛选。

摘要

患者来源的异种移植模型对于确定不同癌症在活体系统中对药物治疗的反应至关重要。小鼠模型是该领域的标准，但斑马鱼作为一种具有多种优势的替代模型已逐渐兴起，包括能够进行高通量、低成本的药物筛选。斑马鱼还支持在活体内进行大规模重复实验的药物筛选，而此前这种规模仅能在体外系统中实现。快速开展大规模药物筛选的能力，可能为个性化医疗开辟新途径，并实现研究结果向临床应用的快速转化。斑马鱼异种移植模型还可用于根据肿瘤对靶向治疗的反应快速筛选可干预的突变，或从大型化合物库中鉴定新的抗癌化合物。目前该领域的主要局限在于如何对筛选过程进行量化和自动化，以实现更大规模的药物筛选并降低劳动强度。我们已建立了一套工作流程，可将患者的原代样本移植到斑马鱼幼鱼中，并利用配备荧光显微镜成像单元和自动取样单元的设备进行大规模药物筛选。该方法可对大量斑马鱼幼鱼中移植肿瘤区域及其对药物治疗的反应进行标准化和定量分析。总体而言，该方法相较于传统的细胞培养药物筛选具有优势，因其可在药物处理期间使肿瘤细胞在活体环境中生长，同时在进行大规模活体药物筛选时比小鼠更实用且成本更低。

引言

将原发性患者肿瘤或人类癌细胞系移植到模式生物中，是一种广泛使用的技术，用于研究肿瘤在体内的进展和行为、肿瘤对药物治疗的反应以及癌细胞与微环境的相互作用等。传统上，细胞被移植到免疫缺陷小鼠体内，这至今仍是该领域的标准方法。然而，这一模型系统存在多个局限性，例如成本高、重复数量少、难以准确量化体内肿瘤负荷，以及肿瘤移植和药物测试所需时间较长。近年来，斑马鱼作为一种替代的异种移植模型逐渐兴起，首次报道是在2005年，将表达绿色荧光蛋白（GFP）的人黑色素瘤细胞系移植到囊胚期胚胎中^1,2。最近，受精后2天（dpf）的斑马鱼幼鱼被用作异种移植受体，以实现对注射解剖位置的控制，并可用于高分辨率的活体成像，以观察肿瘤与周围微环境的相互作用^3,4。

斑马鱼作为异种移植模型具有诸多优势。首先，成年斑马鱼可在相对较低的成本下大规模饲养并快速繁殖。每对成年斑马鱼每周可产生数百尾幼鱼。由于体型较小，这些斑马鱼幼体可在96孔板中进行培养，适用于高通量药物筛选。在典型的异种移植实验过程中，幼鱼无需额外喂食，因其卵黄囊可为其出生后的第一周提供维持生命所需的营养。此外，斑马鱼在7天龄前尚未形成完全功能的免疫系统，这意味着在进行异种移植注射前，无需对其进行辐照或施用免疫抑制处理....

方案

本方案中描述的所有操作均已获得肯塔基大学机构动物照护与使用委员会（协议编号 2015-2225）的批准。患者样本的采集已获得肯塔基大学机构审查委员会（协议编号 44672）的批准。所有依据本方案开展的动物实验必须事先获得使用者所在机构的动物照护与使用委员会的批准。

1. 解冻原代患者急性淋巴细胞白血病细胞

1. 将患者外周血单个核细胞（PBMCs）的冷冻储备样本在37 °C水浴中解冻。细胞一旦完全解冻，立即用移液器缓慢地将含冻存液（90% FBS + 10% 二甲基亚砜 [DMSO]）的细胞转移至15 mL锥形管中，避免产生气泡。向15 mL锥形管中的细胞逐滴加入10 mL预热至37 °C的解冻培养基（Iscove改良的Dulbecco培养基 [IMDM] 中含25%胎牛血清 [FBS]），滴加速度约为每毫升2−3秒。
   注：PBMCs是在患者确诊时采集的血液样本中分离获得的。通过密度梯度离心法分离获得白膜层，并用RPMI 1640 + 10% FBS洗涤两次。细胞计数后，每支冻存管中加入1 mL冻存液，冻存10⁷个细胞，随后于-80 °C保存。
2. 以100 × g 离心10分钟，吸除上清液。再重复一次解冻培养基的添加、离心和上清液吸除操作，以彻底去除残留的DMSO。
3. 将细胞重悬于5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，取出10 μL用于自动细胞计数仪或血细胞计数板计数。取用....

结果

按照上述方案，将初诊时来自T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者的外周血单个核细胞（PBMCs）以活性冷冻样本形式保存后复苏，移植至斑马鱼卵黄囊和心包腔内进行异种移植。在移植后48小时（hpi），筛选携带荧光标记肿瘤细胞的异种移植鱼（图2C,D），并分别给予化疗药物（地塞米松或长春新碱）或DMSO处理。在药物处理3天后，即移植后7天（dpi），使用配备荧光显微成像单元和自动取样单元的荧光显微镜对鱼类进行成像分析（图3A）。

使用 ImageJ 测量每条成像鱼的荧光面积/肿瘤负荷，并在不同药物处理组与 DMSO 组之间进行比较图3B总体而言，与DMSO处理的斑马鱼相比，接受长春新碱处理的异种移植斑马鱼显示出最大且最一致的移植细胞团块减少。地塞米松处理的斑马鱼肿瘤区域的减少程度约为长春新碱处理组的一半，但仍较DMSO处理组有所减小。

讨论

本研究中，我们展示了一种标准化的方法，用于解冻原代患者白血病细胞并将其注射到斑马鱼体内，建立异种移植模型。同时，我们还建立了一套利用配备成像单元和自动取样单元的荧光显微镜对异种移植斑马鱼进行高通量药物筛选的实验方案。此前已有使用人源细胞系进行异种移植的报道，但在该领域中，对异种移植肿瘤进行高通量定量仍是一项挑战。本方法为相关研究奠定了基础，可利用配备成像单元和自动取样单元的荧光显微镜实现异种移植斑马鱼成像的自动化，最终目标是开展高通量药物筛选，以预测特定患者的癌症可能对哪些药物产生响应，从而为实现更精准的个体化医疗提供可能。

尽管该实验方案的大部分步骤可以实现自动化，但仍存在许多不应忽视的技术挑战。首先，细胞染色后必须尽快注射到斑马鱼体内，以防止细胞聚集和细胞死亡。在进行细胞染色实验前，需要先去除胚胎的绒毛膜。玻璃微针在装载细胞前应保持低温，以减少针头堵塞。此外，使用健康成年斑马鱼（6个月至1岁）所产的胚胎对于确保异种移植幼鱼的最佳存活率至关重要。最后，应对异种移植的斑马鱼仔细筛选肿瘤植入情况，仅选择肿瘤体积相近的个体用于药物筛选，以降低最终结果的变异性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x TBE 液体浓缩液	VWR	0658-5L
96 孔板，平底	CELLTREAT	229195	VAST 可兼容多种标准或深孔 24、48 或 96 孔板
琼脂糖	赛默飞世尔科技	BP160-500
无细丝硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument Company	B100-50-10
地塞米松	Enzo Life Sciences	BML-EI126-0001
DMSO	西格玛奥德里奇	D2438-5X10ML
E3 培养基		N/A	5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂、0.33 mM MgSO₄
Femtotips 微量加样尖端	艾本德	930001007
胎牛血清（优质，热灭活）	Atlanta Biologicals	S11150H
ImageJ	FIJI	N/A	https://imagej.net/Fiji
伊氏改良杜尔贝科培养基（IMDM）	STEMCELL Technologies	36150
大颗粒（LP）采样器	Union Biometrica	N/A	自动化采样装置 http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8
甲氨蝶呤	西格玛奥德里奇	A6770-10MG
矿物油	赛默飞世尔科技	BP26291
磷酸盐缓冲液（1x）	Caisson Labs	PBL06-6X500ML
显微镜测微尺（400-Stage）	Hausser Scientific	400-S
三卡因-S	Pentair Aquatic	TRS1
台盼蓝	赛默飞世尔科技	T10282
VAST 生物成像仪	Union Biometrica	N/A	配备荧光功能的显微成像装置 https://www.unionbio.com/vast/
硫酸长春新碱	Enzo Life Sciences	BML-T117-0005
Vybrant DiI 染色剂	赛默飞世尔科技	V22885