癌症因其能够转移至不同器官而成为一种致命疾病。确定癌细胞在各种治疗条件下的迁移和侵袭能力，对于评估治疗策略至关重要。本方案介绍了一种用于评估胶质母细胞瘤细胞系实时转移能力的方法。
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本文内容
摘要
摘要
癌症源于遗传不稳定性、基因突变以及环境和其他应激因素引发的细胞不受控增殖。这些在复杂多层次分子信号网络中获得的异常，导致细胞异常增殖与存活、细胞外基质降解以及向远端器官转移。据估计，约90%的癌症相关死亡由转移性播散的直接或间接效应所致。因此，建立一个高度可靠且全面的系统，以表征在遗传和环境干预下癌细胞的行为至关重要。此类系统有助于深入理解癌症转移的分子调控机制，并为开发分层化、精准化的治疗策略提供可能。因此，通过基因功能的获得或缺失，准确测定癌细胞迁移和侵袭等行为，可评估癌细胞的侵袭性特征。基于细胞阻抗的实时检测系统使研究人员能够在整个实验过程中持续获取数据，并即时比较和量化不同实验条件下的结果。与传统方法不同，该方法无需对迁移或侵袭的细胞进行固定、染色和样本处理。本文重点阐述了胶质母细胞瘤细胞迁移与侵袭实时测定的详细操作步骤。
引言
癌症因其能够向不同器官转移而成为一种致命性疾病。确定癌症的基因型和表型对于理解并设计有效的治疗策略至关重要。数十年的癌症研究推动了多种用于确定癌症基因型和表型的方法的发展与应用。其中最新的技术进展之一是基于细胞阻抗的细胞迁移和侵袭的实时测量。细胞对基质的黏附以及细胞间的相互接触在细胞间通讯与调控、组织发育和维持中发挥着重要作用。细胞黏附异常会导致细胞间接触丧失、细胞外基质（ECM）降解，并使细胞获得迁移和侵袭能力，这些因素共同促进了癌细胞向不同器官的转移1,2。目前已有多种方法可用于检测细胞迁移（如划痕愈合实验和Boyden小室实验）和侵袭（如Matrigel包被的Boyden小室实验）3,4,5。这些传统方法为半定量性质，因为需要在实验前或实验后使用荧光染料或其他染料对细胞进行标记以测定细胞表型。此外，在某些情况下，需要通过机械方式制造伤口，以检测细胞向伤口区域的迁移。而且，这些现有方法耗时较长、劳动强度大，且仅能在单一时间点获取结果。此外，由于实验操作过程中操作不一致，这些方法容易导致测量结果不准确6。
与传统方法不同，实时....
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方案
注意： 所有细胞培养材料均需无菌，整个实验必须在生物安全柜中的无菌条件下进行。
1. U-118MG 胶质母细胞瘤细胞系的培养与电穿孔
- 在含有 5% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（培养基）中培养 U-118MG 细胞系，并于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中维持培养（培养条件）。
- 使用 70–80% 汇合度的健康细胞进行电穿孔。
- 收集细胞时，用 1× PBS 洗涤培养皿中的细胞，加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，放入培养箱中孵育 30 秒后去除胰蛋白酶-EDTA，将细胞收集至培养基中，转移至 15 mL 离心管。
- 使用手持式自动细胞计数仪计数细胞，以 100 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于培养基中，每种实验条件取 600,000 个细胞至微量离心管中。根据实验设计和细胞生长速率调整细胞数量。
- 将细胞悬液转移至微量离心管，加入 800 µL 磷酸盐缓冲液（DPBS），使用小型离心机离心 30 秒，弃去上清液。
- 向细胞沉淀中加入 60 µL 重悬缓冲液 R，并向各微量离心管中分别加入 siRNA（如非靶向 siRNA、Crk siRNA、CrkL siRNA，或同时加入 Crk 与....
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结果
已有研究表明，Crk 和 CrkL 在多种癌细胞系的细胞迁移和侵袭过程中发挥重要作用13,17。尽管 Crk 和 CrkL 蛋白在结构和功能上彼此相似，并具有重要的功能重叠16,19,20,21，但许多针对 Crk 和 CrkL 的基因敲低研究并未明确说明其敲低效应是特异性针对 Crk、CrkL，还是同时影响两者。因此，目前尚不清楚这两种蛋白中哪一种对细胞迁移和侵袭起主要作用。作为一项原理验证性研究，我们使用了特异性靶向 Crk 或 CrkL 的 siRNA，研究其对 U-118MG GBM 细胞系迁移和侵袭能力的影响。Crk 的敲低使 CrkII 和 CrkI 蛋白水平分别降低了 85% 和 86%，而 CrkL 蛋白水平未受影响。CrkL 的敲低使 CrkL 蛋白.......
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讨论
利用实时细胞分析系统对细胞迁移和侵袭进行实时检测，是一种简便、快速且可连续监测的方法，相较于仅提供单时间点数据的传统方法具有多项显著优势。与传统方法一样，使用实时细胞分析系统时，必须针对每种细胞系优化实验条件，因为不同细胞系在底物黏附性、生长特性、细胞间接触以及迁移和侵袭能力方面可能存在差异。由于这些差异，不同细胞系可能表现出不同的细胞动力学特征和细胞阻抗。阻抗值受到每孔接种细胞数量、细胞黏附时间、细胞开始迁移或侵袭前的滞后期，以及CIM板上ECM凝胶浓度的显著影响。首先，实时细胞分析使优化过程更加便捷，因其可在特定时间段内实时提供结果，使研究人员能够确定对照细胞何时表现出活跃的细胞迁移和侵袭，以及何时达到迁移和侵袭的最大水平。其次，外源基因过表达或基因敲低研究可能需要额外的优化步骤，因为细胞需要表现出由基因型改变所诱导的表型变化。此外，结合正常或经修饰的遗传条件，利用实时细胞分析系统还可确定药物的有效浓度及其作用效果。
传统方法（如伤口愈合、软琼脂、Boyden小室迁移或侵袭实验）已被用于证实，在不同癌细胞系中敲低Crk或CrkL均会导致细胞迁移和侵袭能力下降
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Olivia Funk在实时细胞分析系统数据方面的技术支持。同时感谢堪萨斯城儿童仁慈医院医学写作中心对本文稿的编辑。本研究由Tom Keaveny儿科癌症研究捐赠基金（资助编号：TP）以及儿童仁慈医院中西部癌症联盟合作伙伴咨询委员会基金（资助编号：TP）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物安全柜 | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM 培养板 | Agilent Technologies, Inc 细胞分析部门 | 5665825001 | 细胞侵袭与迁移培养板 |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 和 ID: 3524 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM) | ATCC | 302002 | 用于细胞培养的培养基 |
| Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | 用于洗涤细胞的 DPBS |
| 胎牛血清 (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 培养箱 | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 培养箱 |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | 细胞外基质凝胶 |
| Neon 电穿孔系统 | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | 电穿孔系统 |
| Neon 转染系统 10 µL 试剂盒 | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | 电穿孔试剂盒 |
| 非靶向 siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | 非靶向对照用 siRNA |
| Odyssey CLx（成像系统） | LI-COR Biosciences | Western 印迹成像系统 | |
| RTCA 软件 | Agilent Technologies, Inc 细胞分析部门 | 实验所用仪器 | |
| Scepter | Millipore | C85360 | 手持式自动细胞计数仪 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | 实验所用细胞系 |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc 细胞分析部门 | 380601050 | 实验所用仪器 |
参考文献
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144
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