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方法文章

基于阻抗的癌细胞迁移与侵袭实时检测

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DOI：

10.3791/60997

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2020年4月2日

 ,  , 
1Children's Mercy Research Institute, Children's Mercy Kansas City, 2Department of Pediatrics, University of Missouri Kansas City School of Medicine

本文内容

摘要

癌症因其能够转移至不同器官而成为一种致命疾病。确定癌细胞在各种治疗条件下的迁移和侵袭能力，对于评估治疗策略至关重要。本方案介绍了一种用于评估胶质母细胞瘤细胞系实时转移能力的方法。 

摘要

癌症源于遗传不稳定性、基因突变以及环境和其他应激因素引发的细胞不受控增殖。这些在复杂多层次分子信号网络中获得的异常，导致细胞异常增殖与存活、细胞外基质降解以及向远端器官转移。据估计，约90%的癌症相关死亡由转移性播散的直接或间接效应所致。因此，建立一个高度可靠且全面的系统，以表征在遗传和环境干预下癌细胞的行为至关重要。此类系统有助于深入理解癌症转移的分子调控机制，并为开发分层化、精准化的治疗策略提供可能。因此，通过基因功能的获得或缺失，准确测定癌细胞迁移和侵袭等行为，可评估癌细胞的侵袭性特征。基于细胞阻抗的实时检测系统使研究人员能够在整个实验过程中持续获取数据，并即时比较和量化不同实验条件下的结果。与传统方法不同，该方法无需对迁移或侵袭的细胞进行固定、染色和样本处理。本文重点阐述了胶质母细胞瘤细胞迁移与侵袭实时测定的详细操作步骤。

引言

癌症因其能够向不同器官转移而成为一种致命性疾病。确定癌症的基因型和表型对于理解并设计有效的治疗策略至关重要。数十年的癌症研究推动了多种用于确定癌症基因型和表型的方法的发展与应用。其中最新的技术进展之一是基于细胞阻抗的细胞迁移和侵袭的实时测量。细胞对基质的黏附以及细胞间的相互接触在细胞间通讯与调控、组织发育和维持中发挥着重要作用。细胞黏附异常会导致细胞间接触丧失、细胞外基质（ECM）降解，并使细胞获得迁移和侵袭能力，这些因素共同促进了癌细胞向不同器官的转移1,2。目前已有多种方法可用于检测细胞迁移（如划痕愈合实验和Boyden小室实验）和侵袭（如Matrigel包被的Boyden小室实验）3,4,5。这些传统方法为半定量性质，因为需要在实验前或实验后使用荧光染料或其他染料对细胞进行标记以测定细胞表型。此外，在某些情况下，需要通过机械方式制造伤口，以检测细胞向伤口区域的迁移。而且，这些现有方法耗时较长、劳动强度大，且仅能在单一时间点获取结果。此外，由于实验操作过程中操作不一致，这些方法容易导致测量结果不准确6。

与传统方法不同，实时细胞分析系统可在无需对细胞进行染色或造成机械损伤的情况下，实时测量细胞阻抗。更重要的是，该实验可延长持续时间，从而以时间依赖的方式确定生物学效应。实验操作省时且劳动强度低。数据分析相对简单且准确。与其他方法相比，该方法是测量细胞迁移和侵袭的最佳实时检测方法之一6,7,8,9。

Giaever 和 Keese 首次描述了基于阻抗的方法来测量电极表面细胞群体的技术10。实时细胞分析系统正是基于相同的原理工作。每个微孔板孔的表面约有 80% 的区域被金微电极阵列覆盖。当细胞因贴附或铺展而占据电极表面时，电学阻抗会发生变化。该阻抗以细胞指数的形式显示，其数值与穿透微孔膜后覆盖电极表面的细胞数量成正比（该膜的平均孔径为 8 μm）11。

Crk 和 CrkL 是含有 SH2 和 SH3 结构域的接头蛋白，在多种细胞功能中发挥重要作用，例如通过介导多种信号通路中的蛋白质-蛋白质相互作用，调控细胞骨架、细胞转化、增殖、黏附、上皮-间质转化、迁移、侵袭和转移1,12,13,14,15,16,17,18。因此，确定癌细胞中依赖 Crk/CrkL 的迁移和侵袭能力具有重要意义。本研究通过实时细胞分析，检测了在 Crk 和 CrkL 基因敲低后胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭能力。

本文详细描述了Crk和CrkL介导的人脑胶质母细胞瘤细胞迁移与侵袭的测定方法。 

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方案

注意： 所有细胞培养材料均需无菌，整个实验必须在生物安全柜中的无菌条件下进行。

1. U-118MG 胶质母细胞瘤细胞系的培养与电穿孔

  1. 在含有 5% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（培养基）中培养 U-118MG 细胞系，并于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中维持培养（培养条件）。
  2. 使用 70–80% 汇合度的健康细胞进行电穿孔。
  3. 收集细胞时，用 1× PBS 洗涤培养皿中的细胞，加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，放入培养箱中孵育 30 秒后去除胰蛋白酶-EDTA，将细胞收集至培养基中，转移至 15 mL 离心管。
  4. 使用手持式自动细胞计数仪计数细胞，以 100 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  5. 将细胞沉淀重悬于培养基中，每种实验条件取 600,000 个细胞至微量离心管中。根据实验设计和细胞生长速率调整细胞数量。 
  6. 将细胞悬液转移至微量离心管，加入 800 µL 磷酸盐缓冲液（DPBS），使用小型离心机离心 30 秒，弃去上清液。
  7. 向细胞沉淀中加入 60 µL 重悬缓冲液 R，并向各微量离心管中分别加入 siRNA（如非靶向 siRNA、Crk siRNA、CrkL siRNA，或同时加入 Crk 与 CrkL siRNA），终浓度为 6 µM，轻轻敲击混匀。
  8. 取 10 µL 细胞悬液，使用电穿孔系统以 1,350 V、10 ms 脉冲时间、三次脉冲进行电穿孔，随后将电穿孔后的细胞转移至 5 mL 培养基中。对每种条件下剩余的细胞重复电穿孔操作。
  9. 完成所有相应的电穿孔操作，将电穿孔后的细胞每种条件分别接种至两个 35 mm 培养皿中，在培养条件下继续培养 3 天。
  10. 第三天，进行实际细胞阻抗测量前，用含 0.5% FBS 的 DMEM（低血清培养基）处理所有电穿孔后的细胞，孵育 6 小时。   

2. 实时细胞分析系统的准备、细胞侵袭与迁移（CIM）板的制备以及电穿孔U-118MG细胞的接种前处理

  1. 在实验开始前5–6小时，将实时细胞分析系统放入CO2培养箱中，在培养条件下预平衡，以使系统适应培养环境。
  2. 进行侵袭实验时，在CIM板上室的每个孔中加入50 µL含有细胞外基质（ECM）凝胶的DMEM（无血清培养基），ECM终浓度为0.1 µg/µL。为避免产生气泡，应使用反向移液法。立即吸出30 µL ECM凝胶，使每孔剩余20 µL。
  3. 完成ECM凝胶包被后，将板盖上盖子，在培养条件下放入培养箱中孵育4小时。在ECM凝胶包被和干燥过程中，需采取预防措施，避免手、生物安全柜表面或CO2培养箱直接接触板上室的电极。
  4. 设置阻抗测量程序时，双击相关软件图标（见材料表）以启动系统软件（控制单元）。每个支架均有独立窗口，包含不同选项卡，用于设定实验条件、阻抗测量的时间间隔与持续时间以及数据分析参数。
  5. 在布局选项卡下，为每种生物学条件设置四个重复孔；在时间表选项卡下设置两步细胞阻抗测量程序。第一步为一次性基线测量（一次扫描，间隔1分钟）；第二步用于在各个独立支架中进行实际实验的细胞阻抗测量。迁移实验设置为145次扫描，间隔10分钟；侵袭实验设置为577次扫描，间隔10分钟，分别在各自独立的支架中设定。
  6. 在开始细胞阻抗测量前1小时，于板的下室各孔中加入160 µL含10% FBS的DMEM作为趋化因子。将上室（含ECM凝胶包被孔或未包被孔）与下室组装，分别用于侵袭和迁移实验的检测。
  7. 在上室各孔中加入50 µL低血清培养基，并将其放入系统的支架中。通过点击消息选项卡，检查控制单元是否已识别所有孔。若显示OK，则表明支架中的板已准备就绪，可进行实验。 
  8. 在将完全组装好的板放入实时细胞分析系统支架进行测量前，需在培养条件下于培养箱中预孵育1小时，这对于使组装板适应细胞培养环境至关重要。
  9. 收集经低血清培养基处理的细胞时，按照步骤1.3进行胰酶消化，用低血清培养基重悬细胞，并按照步骤1.4进行细胞计数。
  10. 计数后，以100 ×g离心5分钟，弃去上清液。
  11. 将800,000个细胞重悬于800 µL低血清培养基中，用于迁移和侵袭实验。此外，将300,000个细胞重悬于2 mL培养基中，接种至35 mm培养皿，用于后续Western blot分析，以验证Crk和CrkL的敲低效果。

3. 基线读数、细胞接种以及细胞阻抗的测量与可视化

  1. 在CO2培养箱的培养条件下，将细胞板于实时细胞分析系统的孵育架中预孵育1小时后、向微孔板上室的相应孔中接种细胞前，点击孵育架上的开始按钮测量基线读数。
    注意： 一旦点击孵育架的开始按钮，控制单元将提示是否保存实验文件。文件保存后，孵育架分析仪将按照程序初始设定测量基线细胞阻抗，随后进入暂停模式，直至再次点击孵育架的开始按钮，以进行第二步的细胞阻抗测量。
  2. 基线测量完成后，从孵育架中取出用于迁移和侵袭实验的两块细胞板，并置于生物安全柜中。
  3. 根据孵育架控制单元的程序设定，使用反向移液法向CIM板上室的相应孔中接种100 µL细胞悬液（100,000个细胞），每个生物学条件设四个复孔，以避免产生气泡。
  4. 接种后，将细胞板置于生物安全柜中室温静置30分钟，使细胞均匀沉降至底部。随后将细胞板放回对应的孵育架中，点击孵育架的开始按钮，按照2.5步骤中的第二步程序开始测量细胞阻抗。
  5. 完成最后一次扫描后，实验结束，结果将自动保存。
  6. 在数据分析选项卡下，可随时间变化以细胞指数的形式可视化细胞阻抗的变化，该可视化可在实验过程中或完成后进行。通过勾选平均值和标准差的选项框，可将四个复孔的各相应条件单独显示，或以平均值和/或标准差的形式显示。
  7. 如需将细胞指数数据导出至电子表格文件，请打开一个空白电子表格文件，将光标置于数据分析窗口中央，单击鼠标右键。在弹出的对话框中选择复制数据为列表格式，然后将数据粘贴至打开的电子表格中。
  8. 调整原始数据中的时间，以反映细胞阻抗测量的实际起始时间。第二步的起始时间设为零。
    注意： 控制单元可选择是否对细胞指数进行归一化处理（即归一化细胞指数），并以随时间变化的图形形式展示结果。本示例中，细胞指数数据以未归一化形式导出，用于后续处理和图形展示。
  9. 通过点击每个孵育架上的释放按钮，解除实验锁定状态。

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结果

已有研究表明，Crk 和 CrkL 在多种癌细胞系的细胞迁移和侵袭过程中发挥重要作用13,17。尽管 Crk 和 CrkL 蛋白在结构和功能上彼此相似，并具有重要的功能重叠16,19,20,21，但许多针对 Crk 和 CrkL 的基因敲低研究并未明确说明其敲低效应是特异性针对 Crk、CrkL，还是同时影响两者。因此，目前尚不清楚这两种蛋白中哪一种对细胞迁移和侵袭起主要作用。作为一项原理验证性研究，我们使用了特异性靶向 Crk 或 CrkL 的 siRNA，研究其对 U-118MG GBM 细胞系迁移和侵袭能力的影响。Crk 的敲低使 CrkII 和 CrkI 蛋白水平分别降低了 85% 和 86%，而 CrkL 蛋白水平未受影响。CrkL 的敲低使 CrkL 蛋白...

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讨论

利用实时细胞分析系统对细胞迁移和侵袭进行实时检测，是一种简便、快速且可连续监测的方法，相较于仅提供单时间点数据的传统方法具有多项显著优势。与传统方法一样，使用实时细胞分析系统时，必须针对每种细胞系优化实验条件，因为不同细胞系在底物黏附性、生长特性、细胞间接触以及迁移和侵袭能力方面可能存在差异。由于这些差异，不同细胞系可能表现出不同的细胞动力学特征和细胞阻抗。阻抗值受到每孔接种细胞数量、细胞黏附时间、细胞开始迁移或侵袭前的滞后期，以及CIM板上ECM凝胶浓度的显著影响。首先，实时细胞分析使优化过程更加便捷，因其可在特定时间段内实时提供结果，使研究人员能够确定对照细胞何时表现出活跃的细胞迁移和侵袭，以及何时达到迁移和侵袭的最大水平。其次，外源基因过表达或基因敲低研究可能需要额外的优化步骤，因为细胞需要表现出由基因型改变所诱导的表型变化。此外，结合正常或经修饰的遗传条件，利用实时细胞分析系统还可确定药物的有效浓度及其作用效果。

传统方法（如伤口愈合、软琼脂、Boyden小室迁移或侵袭实验）已被用于证实，在不同癌细胞系中敲低Crk或CrkL均会导致细胞迁移和侵袭能力下降

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Olivia Funk在实时细胞分析系统数据方面的技术支持。同时感谢堪萨斯城儿童仁慈医院医学写作中心对本文稿的编辑。本研究由Tom Keaveny儿科癌症研究捐赠基金（资助编号：TP）以及儿童仁慈医院中西部癌症联盟合作伙伴咨询委员会基金（资助编号：TP）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物安全柜ThermoFisher Scientific1300 Series Class II, Type A2
CIM 培养板Agilent Technologies, Inc 细胞分析部门5665825001细胞侵袭与迁移培养板
Crk siRNADharmaconJ-010503-10
CrkL siRNAAmbionID: 3522 和 ID: 3524
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)ATCC302002用于细胞培养的培养基
Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS)Gibco21-031-CV用于洗涤细胞的 DPBS
胎牛血清 (FBS)HycloneSH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 培养箱ThermoFisher Scientific51030285CO2 培养箱
MatrigelBD Bioscience354234细胞外基质凝胶
Neon 电穿孔系统ThermoFisher ScientificMPK5000电穿孔系统
Neon 转染系统 10 µL 试剂盒ThermoFisher ScientificMPK1025电穿孔试剂盒
非靶向 siRNADharmaconD-001810-01非靶向对照用 siRNA
Odyssey CLx（成像系统）LI-COR BiosciencesWestern 印迹成像系统
RTCA 软件Agilent Technologies, Inc 细胞分析部门实验所用仪器
ScepterMilliporeC85360手持式自动细胞计数仪
胰蛋白酶-EDTAGibco25300-054
U-118MGATCCATCC HTB15实验所用细胞系
xCELLigence RTCA DPAgilent Technologies, Inc 细胞分析部门380601050实验所用仪器

参考文献

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