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方法文章

一种用于胶质母细胞瘤的三维球状模型

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DOI：

10.3791/60998

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2020年4月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

本文内容

摘要

本文介绍了一种易于使用的胶质母细胞瘤侵袭实验方法。该实验适用于胶质母细胞瘤干细胞样细胞。同时介绍了一种用于便捷定量分析侵袭、迁移和增殖的Fiji宏工具。

摘要

二维（2D）细胞培养无法充分模拟体内肿瘤的生长情况。因此，人们开发了三维（3D）类球体培养模型。这些模型在神经肿瘤学领域可能尤为重要。事实上，脑肿瘤具有侵袭健康脑组织环境的倾向。本文介绍了一种我们开发的理想的基于3D胶质母细胞瘤类球体的实验方法，用于研究肿瘤侵袭。我们提供了成功实施该实验所需的全部技术细节和分析工具。

引言

在大多数使用原代细胞或商业化细胞系的研究中，实验通常在塑料表面培养的单层细胞上进行。二维细胞培养存在局限性，因为它无法模拟体内真实的三维细胞环境。在二维培养中，细胞的整个表面直接与培养基接触，从而改变细胞生长特性并影响药物的可及性。此外，这种非生理性的塑料表面会诱导细胞分化1。为克服这些局限，已开发出三维细胞培养模型。该模型能够模拟肿瘤的多细胞结构和异质性2，因此可被视为更适用于实体瘤研究的模型3。类球体（spheroid）的复杂形态有助于更准确地评估药物的渗透性和耐药性4。类球体内的肿瘤异质性会影响氧气和营养物质的扩散，以及细胞对药理学试剂的反应（图1A）。当类球体直径达到300 µm时，氧气扩散受限，导致类球体中心形成缺氧环境（图1A,C）。代谢产物也难以穿透多层细胞，从而引发代偿性代谢反应5。随着类球体直径的增大，可观察到坏死核心的形成，进一步模拟了多种实体瘤（包括侵袭性脑癌胶质母细胞瘤（GBM））所具有的特征6。

文献中已报道了多种用于胶质母细胞瘤的二维或三维侵袭实验方法7,8。二维实验主要用于在薄基质层上或Boyden小室实验中研究细胞在水平平面上的侵袭行为9。已有研究采用经典胶质母细胞瘤细胞系进行三维类球体培养，建立三维侵袭实验模型10。更为复杂的模型包括肿瘤类球体与脑类器官在对置共培养体系中发生的侵袭现象11。然而，开发一种操作简便且可重复、适用于任何实验室的实验方法仍然具有重要意义。我们已建立了一种从患者样本中获取胶质母细胞瘤干细胞样细胞的实验方案。该实验的定量分析易于操作，仅需使用开放获取的在线软件即可完成。简言之，将肿瘤组织切成小块后进行酶消化处理，所得单细胞在神经基础培养基中进行培养。培养4–7天后，细胞可自发形成类球体结构。将此类球体植入小鼠颅内后，可形成具有坏死核心并被假栅栏状排列细胞包围的肿瘤，12，这与胶质母细胞瘤（GBM）患者肿瘤的病理特征高度相似。

本文中，我们描述了一种通过确定数量的细胞生成球状体的实验方案，以确保实验的可重复性。该过程可使用两种互补的基质：Matrigel 和 I 型胶原蛋白。Matrigel 富含生长因子，可模拟哺乳动物基底膜，促进细胞的黏附与迁移；而 I 型胶原蛋白是间质中的一种结构成分，也是最常见的纤维状细胞外基质，常用于细胞侵袭实验。本文通过迁移和增殖实验，展示了我们的胶质母细胞瘤（GBM）球状体模型。分析不仅在固定时间点进行，还通过活细胞成像技术对球状体的扩展及细胞运动进行实时监测。此外，还采用电子显微镜观察其形态学细节。

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方案

所有患者均签署了知情同意书（根据挪威卑尔根哈肯兰医院当地伦理委员会的规定）。我们的研究方案遵循本机构人体研究伦理委员会的指导方针。 

1. 生成大小均一的肿瘤球

注意：类干细胞的培养采用神经基础培养基，添加B27补充剂、肝素、FGF-2、青霉素和链霉素，具体方法如先前文献所述12。这些细胞在培养过程中可自发形成球状体。

  1. 用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤肿瘤细胞，并在 37 °C 下用 0.5–1 mL 解离酶（见材料表）孵育 5 分钟。
  2. 用 4–4.5 mL PBS 洗涤，然后加入 10 mL 完全培养基（完全神经基础培养基，cNBM）。
  3. 使用台盼蓝和细胞计数板，通过自动计数技术进行细胞计数。
  4. 为生成 100 个每球含 104 个细胞的类球体（根据所需大小），将 106 个细胞与 8 mL NBM 和 2 mL 2% 甲基纤维素混合。
  5. 将悬液转移至无菌系统容器中，使用多通道移液器将 100 µL/孔加入 96 孔圆底板中。
  6. 将培养板置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下孵育。3–4 天后可形成大小均一的类球体，可用于后续实验。

2. 三维实验

  1. 增殖
    1. 准备
      1. 将抑制剂（例如图 4A 中的鱼藤酮）和化学物质溶解于 100 µL 培养基中，并加入到每孔已含 100 µL 培养基的孔中（即每孔一个类球体）。
      2. 将培养板置于 37 °C、5% CO2、95% 湿度条件下孵育。
    2. 图像采集与分析
      1. 使用视频显微镜在明场模式下拍照，以建立 T0 及后续预期时间点的一系列条件图像。
      2. 使用 Fiji 软件手动或半自动分析图像。若手动分析，使用自由选择工具在类球体核心周围绘制圆形，并测量每个类球体的面积。若进行半自动分析，使用 补充文件 1 中所示的宏，并选择“仅核心面积”（//Core Area only）。
  2. 侵袭
    1. 准备
      1. 在冰上于离心管中配制胶原基质：终浓度为 1 mg/mL 的 I 型胶原、1× PBS、0.023×Vcollagen、1 M 氢氧化钠和无菌 H2O。将溶液在冰上孵育 30 分钟。
      2. 从圆底培养板中收集类球体至 500 µL 离心管中，用 200 µL 1× PBS 洗涤两次。
      3. 小心地将类球体用移液器转移至 100 µL 胶原基质中，并将其置于普通 96 孔板各孔中央。
      4. 将胶原凝胶在 37 °C 孵育 30 分钟，然后在凝胶上方加入 cNBM。此时可在培养基中加入抑制剂或激活剂（例如图 4B, 4C 中所示的盐酸）。
    2. 图像采集与分析
      1. 在胶原包埋后 24 小时，使用视频显微镜在明场模式下连续拍摄图像。
      2. 使用 Fiji 软件手动或半自动分析图像。若手动分析，使用自由选择工具分别勾勒类球体核心及总体区域，并通过总区域减去核心区域计算每个类球体的侵袭面积。若进行半自动分析，使用 补充文件 1 中所述的宏来确定侵袭面积。
  3. 迁移
    1. 准备
      1. 在 37 °C 条件下，用 Matrigel（0.2 mg/mL）溶于 NBM 中对 6 孔板进行 30 分钟包被，随后去除 Matrigel 并加入 2 mL cNBM。
      2. 将类球体从圆底培养板转移至 50 µL cNBM 中，再接种至 6 孔板。
      3. 将培养板置于 37 °C 孵育，等待 30 分钟使类球体贴附。
      4. 孵育 24 小时后，加入 10 ng/mL Hoechst 染色，并在 37 °C 继续孵育 30 分钟。
    2. 图像采集与分析
      1. 使用视频显微镜在明场下获取图像，使用 405 nm 激光观察 Hoechst 染色情况。
      2. 使用 Fiji 软件分析图像，并运行 补充文件 1 中所述的宏。
        注意：接触孔底或完全移除上清液会损伤类球体。处理 I 型胶原凝胶时，应保持凝胶处于冰上以防止胶原聚合；避免添加酸性成分，因为 pH 变化会影响凝胶的致密性；应迅速将细胞移入胶原中，以防止细胞死亡和凝胶降解。

3. Fiji 宏

注意：Fiji 是一款在公共领域开发的图像分析程序，允许开发宏以加快图像分析速度。虽然也可进行手动分析，但该过程较为缓慢且可能引入偏差。图像可通过拖放方式导入软件，并使用 ROI Manager Tools 插件进行定量分析。本研究中采用的步骤如下：

  1. 打开宏窗口：插件 | 宏 | 交互式解释器。
  2. 复制并粘贴以下修改后的紫色循环代码。保留紫色句子，并添加感兴趣的绿色句子（补充文档1）。
  3. 如需分析整个序列，请调整红色部分的参数以进行特定量化，并通过选择 宏 | 运行宏 或按下 Ctrl+R 来运行宏。
  4. 检查并根据需要手动调整感兴趣区域（ROI）。

4. 类球体的电子显微镜观察

注意：以下大部分步骤必须在化学通风橱中进行。

  1. 固定步骤
    1. 用剪去尖端的移液器吸头收集球状体，放入1.5 mL离心管中，并用0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）洗涤1次。
    2. 在4 °C条件下，用含2%戊二醛和2%多聚甲醛（PFA）的0.1 M PB溶液对球状体进行过夜固定。
    3. 将固定液更换为含1% PFA的0.1 M PB溶液，随后进行样品制备。
  2. 样品制备
    1. 将球状体转移至滤网中，并置于玻璃烧杯内，以避免球状体受损。
    2. 用0.1 M PB小心洗涤3次。
    3. 在避光条件下用锇酸孵育2小时。将锇酸用0.1 M PB缓冲液（含1%）稀释至4%。
    4. 用0.1 M PB小心洗涤3次。
      1. 按以下步骤进行脱水：50%乙醇中浸泡10分钟，70%乙醇中浸泡10分钟，90%乙醇中浸泡两次（每次15分钟），100%乙醇中浸泡两次（每次20分钟），丙酮中浸泡两次（每次30分钟）。
    5. 将样品在丙酮/树脂（50/50）混合液中孵育2小时。在此步骤期间，配制EPON树脂（Embed-812：11.25 g；DDSA：9 g；NMA：4.5 g）。
    6. 弃去丙酮/树脂混合液，更换为新配制的树脂，并过夜孵育。
    7. 更换为新树脂，孵育2–6小时。
    8. 将含球状体的树脂加入模具中，在60 °C下孵育48–72小时。

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结果

类球体的制备方法如方案部分所述，并对迁移、侵袭、增殖及显微成像进行了观察。为测量球形结构不同区域的缺氧情况，采用碳酸酐酶IX染色来确定缺氧活性（图1A-C）。在类球体中心观察到更多的CAIX阳性细胞（图1A-C）。位于类球体核心的缺氧细胞相较于周围细胞表现出更强的糖酵解活性。线粒体可进一步通过透射电子显微镜成像进行分析（图1Ba-1Bb）。由2.5 × 103、5 × 103、104或2 × 104个细胞组成的类球体，其直径分别约为350、400、500或650 µm（图2A）。实验开始后4天内可使用类球体进行实验（...

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讨论

肿瘤球体实验非常适合研究肿瘤的多种特性，包括增殖、侵袭和迁移，以及细胞死亡和药物反应。癌细胞会侵入三维基质，形成具有侵袭性的微肿瘤，如图4B,C所示。在侵袭过程中，基质金属蛋白酶（MMP）会降解肿瘤细胞周围的基质13，而MMP抑制剂（例如GM6001或Rebimastat）可能抑制细胞侵袭，但不影响迁移14。迁移与侵袭涉及部分重叠但不同的分子事件15，这些事件可在我们的球体实验中进行研究。为此，可从基因水平或通过药理学抑制手段靶向特定的信号通路。

胶质母细胞瘤已知可通过多种过程广泛侵袭周围组织（例如，共选择、白质束侵袭、间质性侵袭）16。我们近期描述了胶质母细胞瘤侵袭的两种新机制9,12

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到 Transcan 2017、ARC 2017 以及法国抗癌联盟（吉伦特省和滨海夏朗德省委员会）的资助。Joris Guyon 获图卢兹大学医院（CHU Toulouse）奖学金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔圆底板Falcon08-772-212
AccutaseGibcoA11105-014 °C保存，用于类球体解离的酶
B27Gibco12587-20 °C保存，使用前解冻
碱性成纤维细胞生长因子Peprotech100-18B-20 °C保存，使用前解冻
Countess细胞计数板InvitrogenC10283
DPBS 10XPan BiotechP04-53-5004 °C保存
Fiji软件ImageJ用于图像分析
75 cm2培养瓶Falcon10497302
MatrigelCorning354230-20 °C保存，用冷NBM稀释至终浓度0.2 mg/mL
甲基纤维素SigmaM0512用NBM稀释至终浓度2%
NBMGibco21103-0494 °C保存
Neurobasal培养基Gibco211030494 °C保存
青霉素-链霉素Gibco15140-1224 °C保存
0.4%台盼蓝ThermoFisherT10282用于细胞计数
I型胶原蛋白Corning3542364 °C保存

参考文献

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