在小鼠B-1a细胞中通过逆转录病毒过表达CXCR4并进行过继转移，以实现B-1a细胞向骨髓的靶向迁移及IgM的产生

摘要

本文介绍了一种用于逆转录病毒过表达及小鼠B-1a细胞过继转移的方法，以研究B-1a细胞在体内的迁移与定位。该方案可进一步扩展用于多种下游功能检测，包括定量分析供体B-1a细胞的定位，或在过继转移后检测供体细胞衍生的分泌因子。

摘要

由于细胞功能受到细胞微环境中特定生态位因素的影响，研究细胞定位和迁移的方法可为进一步理解细胞功能提供重要信息。B-1a细胞是小鼠中一类独特的B细胞亚群，能够产生针对健康和疾病状态下出现的氧化特异性表位的保护性天然IgM抗体。B-1a细胞的IgM产生能力因其所在位置不同而存在差异，因此从治疗角度而言，将B-1a细胞靶向定位于支持高水平抗体产生的生态位具有重要意义。本文介绍了一种通过逆转录病毒介导的C-X-C基序趋化因子受体4（CXCR4）过表达，将B-1a细胞迁移靶向骨髓的方法。在原代小鼠B细胞中进行基因诱导具有挑战性，通常转染效率较低，约为10–20%，具体取决于所用技术。本文证明，通过逆转录病毒感染原代小鼠B-1a细胞，可实现30–40%的转导效率。该方法利用过继性细胞转移，将转导后的B-1a细胞移植到B细胞缺陷型受体小鼠体内，从而可视化供体B-1a细胞的迁移与定位。本方案可针对其他逆转录病毒载体进行调整，并可用于过继转移后的多种功能检测，包括供体细胞或宿主细胞表型与功能分析，或B-1a细胞转移后分泌的可溶性因子分析。利用CD45.1和CD45.2同种异型区分供体与受体小鼠，并结合逆转录病毒质粒中携带的GFP报告基因，还可使供体细胞在其他具有内源性B细胞群体的免疫健全小鼠模型中被检测到。

引言

近期研究表明，免疫细胞（尤其是B细胞）的表型和功能具有显著异质性，这种异质性取决于细胞的定位^1,2,3,4,5。B-1a细胞就是一类具有异质性功能的细胞群体，其产生保护性IgM抗体的能力各不相同：骨髓中的B-1a细胞能够组成性地分泌IgM，对血浆IgM滴度有重要贡献⁶，而腹膜腔中的B-1a细胞在稳态条件下IgM分泌水平较低，但可通过天然免疫Toll样受体（TLR）或细胞因子介导的信号通路被激活，从而迅速增殖、迁移并分泌IgM^7,8,9,10。B-1a细胞产生的IgM抗体可识别存在于病原体、凋亡细胞和氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）上的氧化特异性表位（OSE），IgM与OSE结合可抑制动脉粥样硬化等疾病中的炎症下游信号传导¹¹。因此，通过促进腹膜腔B-1a细胞向骨....

方案

所有动物实验方案均经弗吉尼亚大学动物护理与使用委员会批准。

1. 腹膜B-1细胞的磁分离与富集

1. 使用 CO₂ 处死一只 12−14 周龄的雄性 CD45.1⁺ApoE^-/- 小鼠。
2. 使用直手术剪在腹部做一浅表切口，用弯剪剥离皮肤以暴露腹膜壁。使用 10 mL 注射器和 25 G 针头，以 10 mL 37 °C 的 RPMI-1640 培养基冲洗腹腔。抓住小鼠尾巴，充分左右摇晃 15−20 秒，以使细胞脱离。
   注意：按摩灌洗后的腹膜也可最大程度提高细胞回收率。
3. 使用 10 mL 注射器和 25 G 针头，从腹腔右下侧靠近肠道、髋部水平稍上方的位置吸取腹腔液体。避免破坏附睾脂肪库和深层器官。避免从小鼠左侧抽取液体，因为网膜脂肪容易被吸入注射器中。
4. 当收集到约 6−7 mL 液体后，将其转移至置于冰上的 50 mL 锥形管中。接着，用镊子夹住横膈膜上方的腹膜壁，将小鼠垂直提起，使任何残留液体停留在腹腔底部。使用手术剪在肝脏上方的腹膜壁上做一个小切口（注意不要剪到肝脏），并用玻璃移液管和吸球收集剩余的腹腔液体。
5. 将所有 CD45.1⁺ApoE^-/- 小鼠（n = 15−20）的腹腔冲洗细胞合并至 50 mL 锥形管中，并置于冰上保存。
   注意：计....

结果

方案概述如下所示 图1. 图2 在磁珠耗竭其他腹腔细胞类型后，腹腔B-1a细胞富集。耗竭后组分中的活单细胞中，CD19+ B细胞的比例高于F4/80⁺ 巨噬细胞缺乏 CD5^你好 CD19^- T细胞，并含有更高频率的CD19⁺ CD5^中 B-1a 细胞与耗竭前组分相比。 图3 展示了B细胞活化对于逆转录病毒介导的B细胞转导成功所必需，并显示使用Ctl-GFP逆转录病毒时，随着病毒MOI的增加，成功转导的GFP+ B细胞亚群频率呈剂量依赖性升高。 表 2 与24孔或6孔板相比，使用96孔圆底板可提高转导效率。 图4 显示成功的CXCR4过表达（>40%）的B-1细胞，并在体外增强B-1细胞向CXCL12的迁移能力，而对B细胞活力无显著影响。

讨论

本文提供的方法实现了体内原代B-1a细胞的稳定且相对高效的基因递送、过继性转移以及注射细胞的鉴定与定位。在细胞转移后17周仍可检测到细胞，并且这些细胞维持了CXCR4表达的上调。在本研究中，逆转录病毒介导的递送方法对原代小鼠B-1a细胞实现了30–40%的转导效率，且对细胞活力影响极小（图4e）。该结果与Moghimi及其同事先前的一项研究结果一致，该研究比较了包括逆转录病毒感染、腺病毒感染、核转染和脂质体转染在内的多种原代小鼠B细胞基因转移技术¹⁵。然而，我们发现接受CXCR4-GFP转导B-1a细胞的受体个体之间，CXCR4过表达的程度存在较大差异（图6c,d）。因此，我们采用关联性分析表明，CXCR4表达水平的升高与B-1a细胞向骨髓迁移和定位能力的增强相关，并且该现象与血浆IgM水平升高相关联（表3 和 表4）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70 微米滤膜帽	Falcon	352235
抗生物素微珠	Miltenyi Biotec	130-090-485
抗 CD16/CD32（Fc 封闭剂）	Life Technologies	MFCR00
B220 APC	eBioscience	17-0452-83	克隆：RA3-6B2
β-巯基乙醇	Gibco	21985-023
CD19 APCef780	eBioscience	47-0193-82	克隆：eBio1D3
CD23 生物素标记	eBioscience	13-0232-81	克隆：B3B4
CD23 PECy7	eBioscience	25-0232-82	克隆：B3B4
CD3e 生物素标记	eBioscience	13-0033-85	克隆：eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- 小鼠	N/A	N/A	本实验室繁育
CD45.1 PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	560580	克隆：A20
CD45.2 BV421	BD Biosciences	562895	克隆：104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- 小鼠	N/A	N/A	本实验室繁育
CD5 PE	eBioscience	12-0051-83	克隆：53-7.3
对照-GFP 逆转录病毒	N/A	N/A	本实验室使用 Dr. T.P. Bender 提供的表达 GFP 的逆转录病毒质粒 MigR1 构建
CXCR4 APC	eBioscience	17-9991-82	克隆：2B11
CXCR4-GFP 逆转录病毒	N/A	N/A	本实验室通过将小鼠 CXCR4 克隆至 MigR1 逆转录病毒质粒中构建
F4/80 生物素标记	Life Technologies	MF48015	克隆：BM8
FlowJo 软件 v. 9.9.6	Treestar Inc.	需许可证
庆大霉素	Gibco	15710-064
Gr-1 生物素标记	eBioscience	13-5931-82	克隆：RB6-8C5
热灭活胎牛血清	Gibco	16000-044
HEPES	Gibco	15630-080
IgM PECF594	BD Biosciences	562565	克隆：R6-60.2
胰岛素注射器	BD Biosciences	329461
异氟烷	Henry Schein Animal Health	029405
活/死细胞染料 Yellow	Life Technologies	L34968
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
NK1.1 生物素标记	BD Biosciences	553163	克隆：PK136
非必需氨基酸	Gibco	11140-050
ODN 1668	InvivoGen	tlrl-1668
PBS	Gibco	14190-144
RPMI-1640	Gibco	11875-093
丙酮酸钠	Gibco	11360-070
Ter119 生物素标记	eBioscience	13-5921-82	克隆：Ter119