利用基于细胞的雌激素受体β报告基因检测法筛选植物雌激素

摘要

我们优化了一种市售的雌激素受体β报告基因检测方法，用于筛查人类和非人灵长类动物食物中的雌激素活性。通过验证已知具有雌激素活性的人类食品大豆呈强阳性反应，而其他食物无活性，证实了该检测方法的有效性。

摘要

植物是许多动物的食物来源， 并且能够产生数千种化学物质。其中一些化合物会影响摄食这些植物的脊椎动物的生理过程，例如内分泌功能。植物雌激素是最为深入研究的一类具有内分泌活性的植物化学物质，可直接与脊椎动物内分泌系统中的下丘脑-垂体-性腺轴相互作用。本文介绍一种基于细胞的检测方法的创新应用，用于筛选植物提取物中是否存在具有雌激素生物活性的化合物。该检测方法采用经基因工程改造、高表达雌激素受体β（ERβ）的哺乳动物细胞，并转染了荧光素酶基因。当暴露于具有雌激素活性的化合物时，细胞会产生发光信号。该检测方法可靠且操作简便，可用于检测生物体内的雌激素活性。与瞬时转染检测方法相比，本方法具有多项改进，尤其体现在操作简便性、细胞稳定性以及检测灵敏度方面。

引言

植物是许多动物必需的食物来源，为动物的生存、繁殖、生长、发育和行为提供关键的热量和营养素¹。植物能够合成数千种化学物质，其中许多是植物自身生长、气孔维持和繁殖的适应性产物。另一些化合物被称为植物次生代谢物（PSMs），其功能尚不明确，但其中一些具有毒性，可能用于防御植食性动物和寄生生物（例如生物碱、单宁）^2,3。这些化学物质中的一部分能够影响动物的长期生理过程，例如内分泌功能，但目前尚不清楚为何这些具有内分泌活性的植物化学物质会与脊椎动物的内分泌系统发生相互作用^2,4。

植物雌激素是研究最为广泛的具有内分泌活性的植物化学物质，属于多酚类植物次生代谢物（PSMs），其结构和功能均能模拟雌激素，可直接与脊椎动物内分泌系统中的下丘脑-垂体-性腺轴相互作用⁵。人类饮食中摄入植物雌激素被认为有助于预防某些癌症、心脏病以及缓解更年期症状，但其他影响则可能包括生育能力障碍。事实上，这类化合物的生理效应最早于20世纪40年代被发现，当时绵羊因采食富含植物雌激素的三叶草（Trifolium subterraneum）而导致不孕⁶。摄入后，植物雌激素可进入细胞并模拟雌激素的作用。尽管植物雌激素对绵羊的生育能力产生了负面影响，但其与生理功能之间的关系并非简单。与绵羊类似，南方白犀牛也对饲料中来源于大量大豆和苜蓿的雌激素样化合物表现出敏感性；妊娠期间摄入此类饲料的雌性个体，其后代的繁殖能力较低⁷。然而，其他研究也表明，植物雌激素可能具有积极作用，包括促进老年小鼠卵巢卵泡的成熟⁸、预防某些癌症、抗氧化活性以及抗增殖效应⁹。

植物雌激素的作用范围之广并不令人意外，因为雌激素会影响多种生物学功能，包括生长 、发育以及生殖系统和中枢神经系统的调节¹⁰。尽管其作用机制多样，植物雌激素通常能够通过作为细胞核内雌激素受体α和β（ERα和ERβ）的配体，从而改变、增强或干扰雌激素信号传导。许多植物雌激素具有与雌激素相似的酚环结构，使其能够与雌激素受体结合。具有雌激素激动活性的植物雌激素可发挥类似雌激素的作用，形成活化的ER-配体复合物，该复合物可二聚化并结合至雌激素反应元件（ERE），进而启动基因转录¹¹。因此，雌激素和植物雌激素通过作为转录因子发挥作用，调控细胞活性和系统功能。

本文介绍了一种基于细胞的检测方法的创新应用，用于筛选植物提取物中具有雌激素生物活性的化合物。该检测方法采用经过基因工程改造的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，这些细胞高表达ERβ，并转染了与ERE启动子相连的萤火虫（Photinus pyralis）荧光素酶基因¹²。当存在雌激素类化合物时，它们会与雌激素受体（ER）结合，形成二聚体并结合到ERE序列上，从而启动荧光素酶基因的转录。加入底物溶液后，荧光素酶催化反应产生光子发射。因此，阳性样本发光，而阴性样本不发光。

这种市售的检测试剂盒消除了实验室需将报告基因和雌激素受体转染至哺乳动物细胞的步骤^13,14，而该步骤曾存在效率不稳定且变异较大的问题。本检测提供了一个稳定的转染平台，可快速、简便地通过受体结合确定某种植物是否具有雌激素活性。

我们利用当地杂货店的人类食用食物，检验大豆因其已知的雌激素样异黄酮浓度而具有高于其他所有食物的雌激素活性这一假设¹⁵。

方案

1. 植物材料的准备

1. 使用冷冻干燥机对新鲜采集的植物样品进行冷冻干燥。
   1. 为防止样品受光照影响，干燥过程中用铝箔覆盖干燥室。
   2. 为确保样品完全干燥，持续冷冻干燥直至干燥室触摸不再感觉冰冷，且植物材料在称重时不再出现质量损失。
   3. 将干燥后的植物样品存放在无菌低残留袋中，避光保存，直至研磨。
2. 使用配备0.85 mm筛网的研磨机将样品充分研磨。
   1. 将研磨后的样品保存在袋中，避光存放，直至提取。

2. 植物次生代谢产物的提取

1. 为了提取植物次生代谢物，使用1 g干燥样品与10 mL HPLC级甲醇的比例。
   1. 使用分析天平称量样品，并将其加入适当大小的锥形瓶（125 – 250 mL）中，然后加入相应体积的甲醇。记录所提取样品的质量。
   2. 用铝箔覆盖植物-甲醇溶液，然后在轨道摇床上以100 rpm的转速于室温（RT）下旋转3天，使潜在的雌激素类化合物溶解于甲醇中。
   3. 将上清液倾析至使用滤纸（125 mm）的滴滤系统中。
   4. 使用旋转蒸发仪，在300 mL圆底烧瓶中将植物提取物干燥至浓稠但仍可倾倒的状态。将样品转移至50 mL圆底烧瓶中，并用少量甲醇冲洗大烧瓶。继续在小烧瓶中干燥样品，直至甲醇完全蒸发。
   5. 使用分析天平称量样品残渣。记录残渣质量。
   6. 将植物提取物溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，浓度为每2 mL DMSO溶解0.1 g提取物。涡旋振荡至均匀。
   7. 将植物提取物-DMSO溶液储存于4 °C的棕色玻璃小瓶中，直至进行检测。

警告：植物可能产生未知的生物活性化学物质，而DMSO是一种可将这些物质转运通过细胞膜的溶剂。处理这些样品时，应使用适当的个人防护装备并小心操作。

3. 人雌激素受体β转染实验¹²

注意：检测方案第1天需使用无菌技术并在层流罩中进行。

1. 为标准曲线配制17β-雌二醇的稀释液。
   1. 将细胞复苏培养基和化合物筛选培养基（CSM）从冷冻保存状态取出，并在37 °C水浴中解冻。
   2. 标记微量离心管为中间液1和2（INT1、INT2）以及1-8号管。
   3. 向INT1中加入995 μL CSM，向INT2中加入615 μL CSM，向1号管中加入900 μL CSM，向2-8号管中各加入600 μL CSM。将8号管留置一旁备用。
   4. 向INT1中加入5 μL 100 μM 17β-雌二醇储备液。弃去枪头。涡旋混匀。
   5. 每次转移前，用移液器冲洗3次，然后从INT1中转移10 μL至INT2。弃去枪头。
   6. 再次冲洗移液器3次，然后从INT2中转移100 μL至1号管。弃去枪头。从1号管中转移300 μL至2号管，依次类推至7号管。从7号管中弃去300 μL至废液容器中。8号管为空白对照（Zero），不添加雌二醇。最终板上标准品浓度分别为：400、133.3、44.44、14.815、4.938、1.646、0.5487 和 0 pM 雌二醇。
2. 准备样品化合物。
   1. 涡旋混匀样品。
   2. 取每种DMSO中的植物样品4 μL，加入496 μL CSM中，得到含0.8% DMSO的溶液。
3. 快速解冻报告细胞。
   1. 从37 °C水浴中取出细胞复苏培养基管，用70%乙醇对外表面进行消毒。
   2. 从-80 °C保存条件下取出报告细胞，通过将10 mL预热的CRM加入冻存细胞管中进行解冻。
   3. 盖紧报告细胞管，放入37 °C水浴中5-10分钟。
   4. 从水浴中取出报告细胞悬液管，轻轻反复倒置数次以打散细胞团块，形成均匀悬液。用70%乙醇清洁管外表面。
4. 加样至检测板
   1. 使用多通道移液器向每孔中加入100 μL报告细胞悬液。
   2. 将样品以每样三复孔的方式，每孔加入100 μL至相应的检测孔中。
   3. 将板放入37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育22-24小时。
5. 在暗处冰箱中过夜解冻检测底物和检测缓冲液，以准备第二天使用。
6. 在板孵育即将结束前，将检测底物和检测缓冲液从冰箱中取出，置于弱光区域直至恢复至室温。达到室温后，轻轻倒置各管数次，充分混匀溶液。
   1. 在孵育即将完成时，将全部检测缓冲液倒入检测底物管中，配制成荧光素酶检测试剂。轻轻混匀，避免产生气泡。
   2. 孵育结束后，将板倒置，将内容物倒入适当的废液容器中。将板轻轻拍打在干净的吸水纸上，去除孔中残留的液滴。
   3. 向每孔中加入100 μL荧光素酶检测试剂。让检测板在室温下静置15分钟。切勿震荡或摇动板。
7. 使用96孔板读数型发光仪定量检测发光信号。

结果

对人类饮食中常见的22种水果和蔬菜提取物进行了检测，以筛查其中是否存在雌激素类化合物。检测的食品种类多样，包括豆科植物，如大豆、荷兰豆和甜豆，因为豌豆家族是已知的植物雌激素来源¹⁶，此外还包括无花果、枣、玉米、胡萝卜、苹果、香蕉、草莓、番茄、羽衣甘蓝和卷心菜。内分泌干扰物存在于一些常见物质中（例如塑料和农药），其中部分物质可通过雌激素受体（ERs）发挥生物学活性¹⁷。在条件允许的情况下，对有机种植和非有机种植的样品均进行了检测，以排除具有雌激素活性的农药可能对实验结果造成影响。

每种植物性食物样品均设置三个重复孔， luminometer 以相对光单位（RLUs）报告每个孔的活性。背景 RLUs 水平通过标准曲线中的标准品 8（即零浓度）确定，并作为参考值。相对于标准曲线零点 RLU 的倍数激活值（fold activation value）通过以下公式计算：

　　折叠激活率 = 未知样品（RLU）÷ 标准品8（RLU）

...

讨论

为单独筛选药物制剂而开发的ERβ报告基因检测法同样适用于筛选通过ERβ发挥生物学活性的植物性食物中的植物雌激素。本实验方案中的重要注意事项包括谨慎处理植物样品：新鲜植物材料需迅速干燥，以防止霉变或其他生物降解，并应避光保存，以防化合物发生光解¹⁸。制造商提供的检测方案¹²清晰明确，用于筛选时几乎无需修改。本方案对制造商建议的标准曲线进行了调整，以增加落在曲线指数增长区间的数据点数量（图1），同时保留曲线的顶部和底部平台期。该检测法可用于定量分析，但我们的目的是将具有高活性的植物与摄食这些植物的动物所产生的生物学效应、食物选择及其他行为关联起来。

为了进一步说明提取和检测方法的有效性，我们加入了大豆提取物的剂量反应曲线（图2），并确定在常规提取方案所获得的提取物活性下，大豆样品必须经过大幅稀释后，信号才会降至最大值的50%。这表明，在高浓度植物雌激素条件下，信号会达到一个...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1000 µL 移液器
20 µL 移液器
200 µL 移液器
37 ° 水浴箱
37 °、加湿的 5% CO2 培养箱
70% 乙醇
分析天平
细胞培养级层流罩
二甲基亚砜
一次性无菌培养基容器
滴滤系统
锥形瓶			125 mL 和 250 mL
高效液相色谱级甲醇
人 ERβ 报告基因检测系统，96 孔板格式，1 次检测	Indigo Biosciences	IB00411	检测试剂盒 — 可分析 24 个样品及标准曲线
冷冻干燥机
多通道移液器
旋转摇床
酶标仪（发光检测功能）			例如 Bioteck Synergy HTX
旋转蒸发仪
圆底烧瓶			50 mL 和 300 mL
无菌微量离心管或无菌多通道培养基容器
无菌吸头			200 µL 和 1000 µL
Whatman 1 号滤纸
Whirl-Pak 袋			无菌聚乙烯袋