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基于液滴的高通量酵母菌株表型分析与RNA测序

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DOI：

10.3791/61014

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2020年5月21日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California San Francisco, 2University of California Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco, 3Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, 4California Institute for Quantitative Biosciences, University of California San Francisco, 5Chan Zuckerberg Biohub

本文内容

摘要

微生物工程“设计-构建-测试”循环中的一个瓶颈在于对菌株进行功能筛选的速度。本文介绍了一种高通量菌株筛选方法，每次实验可应用于数百至数千个酵母细胞，该方法采用基于液滴的RNA测序技术。

摘要

用于编辑酵母基因组的强大工具使这种微生物成为工程化研究的宝贵平台。尽管如今已能够构建包含数百万种遗传差异菌株的文库，但针对目标表型的筛选仍然是一个重大障碍。现有的筛选技术在信息输出与通量之间存在权衡，高通量筛选通常仅针对一种目标产物进行。因此，我们提出一种方法，通过将单细胞RNA测序技术应用于基因工程酵母菌株的同基因型皮升级微小菌落，以加速菌株筛选。为应对在酵母细胞上开展RNA测序所面临的独特挑战，我们在进行RNA测序前，将同基因型酵母菌落在水凝胶中培养并转化为原生质球。所获得的RNA测序数据可用于推断酵母表型，并解析经过工程改造的代谢通路。本方法具备良好的可扩展性，解决了微生物工程领域的一个关键瓶颈问题。

引言

微生物工程的一个主要目标是改造微生物，使其能够生产有价值的化合物1,2。S. cerevisiae 由于易于培养且拥有丰富的基因组工程工具，已成为微生物工程的主要研究对象3,4,5。然而，在改造酵母的功能筛选方面仍存在一个障碍：筛选通量比基因组工程低几个数量级。筛选通常涉及在微孔板中分离菌株，并通过测定特定化合物的产量来进行表型分析6,7。该过程的通量受限于在百微升级反应中检测单个菌株所需的大量试剂。微滴微流控技术通过将通常在微孔板中进行的反应缩小规模，为显著提高酵母筛选通量提供了有吸引力的解决方案8。然而，与微孔板筛选类似，微滴筛选通常仅能检测单一产物化合物，因此对工程化通路的整体功能提供的信息有限9,10,11。

RNA测序（RNA-seq）可通过同时评估所有相关基因的表达水平，实现对通路运行更为全面的表征12,13。此外，微滴技术使得每次实验可对数千个细胞进行分析，提供了筛选工程化变异体文库所需的通量14,15。然而，现有的RNA-seq方法主要针对哺乳动物细胞优化；相比之下，酵母细胞每细胞的mRNA含量较低，且具有难以去除的细胞壁16，导致其无法适用于现有测序方法。如果能够开发一种高通量的微滴技术以实现酵母RNA-seq，则将为酵母工程提供一个可扩展、成本效益高且信息丰富的表型分析平台。

我们介绍了一种近期开发的利用高通量液滴微流控技术对酵母细胞进行测序的详细方案17。为克服RNA量有限的难题，我们将单个酵母细胞包裹在皮升级水凝胶微球中并进行培养。培养使细胞扩增，产生数百个具有相同工程化通路的拷贝，从而降低单细胞基因表达带来的变异，同时显著增加可用于测序的RNA量。在基于培养的扩增完成后，我们对细胞进行原生质体化处理，通过批量酶解去除细胞壁。细胞膜保持完整，使得每个同基因型菌落及其相关的mRNA仍被包裹在各自的水凝胶微球中。这使我们能够将单个菌落与mRNA捕获试剂及裂解缓冲液配对，并按照Drop-Seq工作流程对mRNA进行捕获、加条形码和测序14。该方法可实现每个实验对数千个同基因型酵母菌落进行全转录组水平的筛选。

方案

1. 微流控器件的制备

  1. SU-8 母版制备
    1. 使用计算机辅助设计软件设计装置 A 和 B 的微流控通道负片掩模（补充文件 1 和 2），并将其以至少 10 µm 的分辨率打印在电路板薄膜上。
    2. 将一块洁净的 75 mm 硅片放置在匀胶机上，并在其中心倒入约 1 mL 的 SU-8 胶。开启真空以固定硅片至卡盘上。
    3. 对于装置 A，以 500 rpm 旋涂 SU-8 2150 持续 30 秒，随后以 2,750 rpm 继续旋涂 30 秒；对于装置 B，以 500 rpm 旋涂 SU-8 2100 持续 30 秒，随后以 2,500 rpm 继续旋涂 30 秒。这将分别形成厚度为 200 µm 和 120 µm 的 SU-8 层。
    4. 将硅片从匀胶机上取下，并置于 95 °C 的热板上进行 60 分钟的前烘（软烘）。
    5. 将硅片从热板上取下，冷却至室温。将掩模置于硅片上方，并在准直器下用 190 mW、365 nm 的紫外 LED 光源曝光 2 分钟。
    6. 将硅片置于设定为 95 °C 的热板上，进行 5 分钟的曝光后烘烤。
    7. 取下硅片并冷却至室温。将硅片浸入丙二醇单甲醚乙酸酯（PGMEA）溶液中浸泡 20 分钟。
    8. 用 PGMEA 冲洗硅片，随后用异丙醇冲洗。若在此过程中可见任何不透明残留物，则重复使用 PGMEA 和异丙醇进行冲洗。用空气干燥硅片。
    9. 将硅片置于 95 °C 的热板上加热 3 分钟。
    10. 取下硅片并放入直径为 90 mm 的培养皿中。
  2. 在 SU-8 母版上浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）
    1. 按 10:1 的质量比混合硅胶基体与固化剂。混合后对 PDMS 进行约 30 分钟的脱气处理。
    2. 将脱气后的 PDMS 倒在 SU-8 母版上，直至在硅片表面形成至少 5 mm 厚的 PDMS 层。
    3. 将带有 PDMS 的硅片再进行约 30 分钟的脱气处理。
    4. 将硅片放入 65 °C 的烘箱中至少 80 分钟，以固化 PDMS。
    5. 从硅片上切割下固化的 PDMS 块。
    6. 将带有微流控结构的 PDMS 块正面朝上放置，使用 0.75 mm 的活检打孔器打出进样口和出样口孔。
    7. 用异丙醇清洗一块 50 mm × 75 mm 的玻璃载片，并用胶带清除 PDMS 块微流控结构侧的所有灰尘。
    8. 将清洗后的玻璃载片和 PDMS 块（微流控结构面朝上）置于 100 Pa（1 mbar O2）的等离子体中处理 1 分钟。
    9. 将 PDMS 块结构面朝下贴合到玻璃载片上以实现键合。将载片放入 65 °C 的烘箱中至少 30 分钟，以完成键合过程。
    10. 通过冲洗氟化表面处理液对所有微流控通道进行表面处理。将装置置于 65 °C 烘箱中至少烘烤 10 分钟，以蒸发残留液体。

2. 使用装置A将酵母包封于水凝胶中

  1. 取处于悬浮培养中生长的酵母，在血细胞计数板上进行计数。
  2. 将细胞重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度约为 750 k/mL。此浓度可确保约 30% 的水凝胶中包含一个酵母细胞。由于仅有约一半的酵母细胞能够形成菌落，最终约有 15% 的水凝胶含有酵母菌落。
  3. 将超低熔点琼脂糖以 2% w/v 的比例溶于 PBS 中，并在 90 °C 加热至完全融化，约需 10 分钟。
  4. 将融化的琼脂糖混合液装入带有 0.22 µm 滤器的注射器中，并将注射器安装至注射泵，置于设定为 80 °C 的加热器前方。
  5. 将装有酵母悬液的注射器和装有含 2% w/v 离子型氟化表面活性剂18的氟化油的注射器分别装入注射泵中。
  6. 取第 1 节中制备的共流液滴分裂装置，将各注射器的管路连接至装置上，并将出口端的管路引导至冰桶中的 15 mL 锥形管，用于收集液滴。
  7. 以以下流速将三种溶液注入装置：
    1. 酵母悬液流速为 3 mL/h。
    2. 琼脂糖混合液流速为 3 mL/h。
    3. 氟化油流速为 15 mL/h。
  8. 收集约 1 mL 乳液。额外静置 5 分钟，以确保琼脂糖完全凝固。

3. 培养用凝胶的破碎与洗涤

  1. 向乳液中加入等体积的含20%全氟辛醇（PFO）的氟化油。轻轻倒置锥形管数次以充分混合。
  2. 在2,000 × g 离心2分钟，使乳液破裂。凝胶将沉淀在油相和PFO相之上。
  3. 移除油相，加入2 mL TE-TW缓冲液（10 mM Tris，pH = 8.0，1 mM EDTA，0.01% Tween-20）重悬凝胶。将悬液转移至新的15 mL锥形管中。
  4. 按照步骤3.2的方法沉淀凝胶，并用TE-TW缓冲液再洗涤一次，共洗涤两次。
  5. 移除上清液，将凝胶重悬于2 mL培养基中，转移至5 mL培养管中。
  6. 在30 °C条件下振荡过夜培养。
    注意：过夜培养后，酵母水凝胶可在4 °C保存数天。

4. 酵母菌落裂解

  1. 将凝胶转移至15 mL锥形管中，在2,000 × g 条件下离心2分钟，使水凝胶沉淀。
  2. 用PBS洗涤水凝胶2次。
  3. 用1×原生质球消化缓冲液洗涤1次。
  4. 将原生质球消化酶在原生质球消化缓冲液中稀释2–50倍，取1 mL加入水凝胶中。
  5. 在37 °C孵育1小时。处理后的酵母将变得更为透明（图3A）。
  6. 取底部0.8 mL水凝胶悬液，转移至1 mL无帽注射器中。
  7. 将注射器放入3D打印的注射器支架（补充文件3）中，在2,000 × g 条件下离心2分钟，使水凝胶在注射器头部紧密堆积。

5. 使用设备B从裂解的酵母菌落中捕获mRNA

  1. 取 240,000 个 Drop-Seq 磁珠，转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
  2. 以 1,000 × g 离心 1 分钟，使 Drop-Seq 磁珠沉淀。
  3. 弃去上清液，将磁珠重悬于 2 mL 含 500 mM 氯化钠的 0.9x 酵母裂解缓冲液中，得到浓度为 120,000 个磁珠/mL 的磁珠悬液。
  4. 将磁珠悬液转移至插入搅拌子的 3 mL 注射器中。
  5. 准备一个含有数毫升 2% w/v 全氟聚醚-聚乙二醇（PFPE-PEG）表面活性剂的氟化油注射器。
  6. 抽空含有紧密排列水凝胶的注射器中的所有水相头部空间，并盖紧注射器。
  7. 将水凝胶、磁珠悬液和油相注射器插入注射泵中，并通过管路连接至第 1 节制备的封装装置。
  8. 将出口管路连接至置于冰上的 50 mL 圆锥形离心管。
  9. 以以下流速将三种溶液泵入装置：
    1. 水凝胶流速为 0.4 mL/h。
    2. 磁珠悬液流速为 0.4 mL/h。
    3. 氟化油流速为 1.6 mL/h。
  10. 收集约 1 mL 乳液，或持续运行装置直至水凝胶用尽。

6. cDNA 合成、测序文库制备及测序

  1. 按照 Drop-Seq 方案14所述，向收集的乳液中加入 30 mL 6x SSC 缓冲液和 1 mL PFO。
  2. 继续按照 Drop-Seq 方案进行操作，从磁珠捕获的 mRNA 生成 cDNA、测序文库制备以及测序数据分析。

结果

我们改进了先前发表的Drop-Seq工作流程14，用于同源克隆测序（ICO-seq），以对同源酵母克隆进行基因表达谱分析。我们分离单个酵母细胞，并将其包裹在琼脂糖微凝胶中（图1A）。微凝胶经一夜培养后，包裹的酵母细胞生长为同源克隆。在将凝胶加载到第二个微流控装置以捕获mRNA之前，我们消化了酵母细胞壁，以提高mRNA的可及性（图1B，左）。我们将这些微凝胶紧密排列，并与mRNA捕获微珠及裂解缓冲液合并。部分液滴中恰好包含一个微珠与一个裂解的酵母克隆配对。收集乳化液中的所有微珠，并按照Drop-Seq方案合成cDNA并进行测序。

我们利用带有八通分液器的共包封微流控装置，通过将单个酵母细胞包封在琼脂糖微凝胶中，生成了同基因型酵母菌落（图2A）。我们将初始酵母悬浮液稀释至浓度约为750,000/mL，以确保约30%的微凝胶中恰好含有一个酵母细胞。在将超低熔点琼脂糖注入装置前，先将其在较高温度下溶解，并使注射器保持该温度，以防止过早凝胶化。在液滴生成节点处（图2B），酵母细胞最初被包封进160 µm的液滴中。在液滴生成节点之后，八通分液器将这些液滴分成八个80 µm的子液滴（图2C）。我们在熔融琼脂糖溶液前端连接了一个注射器滤器，以防止通道内发生堵塞，因为在液滴分裂过程中通道最窄处可小至37 µm。我们将乳液收集到冰上，以立即启动琼脂糖的凝胶过程。我们计算出典型乳液的多分散系数约为6%（补充图1），尽管多分散系数高达10%仍可接受。一旦琼脂糖凝胶固化，我们即破乳并去除油相。凝胶经水相缓冲液洗涤后，浸入培养基中。微凝胶过夜培养后，部分微凝胶内部形成了同基因型菌落（图2D）。含有至少20个细胞的水凝胶比例取决于培养条件，包括培养时间和培养基组成。在我们以C. albicans进行的实验中，经20小时悬浮培养后，约有15%的水凝胶中形成了菌落。

第二种共包封装置从同基因型菌落中提取mRNA（图3A）。在将酵母微凝胶加载到微流控装置之前，我们用溶液洗涤并浸泡凝胶，以消化酵母细胞壁。通过显微镜观察验证酵母细胞是否消化完全，经处理的酵母细胞呈现更明显的反光形态（图3B）。我们将微凝胶紧密排列装入注射器，并调节凝胶输入流速，使每个液滴中包含一个凝胶。在液滴生成 junction 之前，裂解缓冲液中的mRNA捕获微珠流与紧密排列的凝胶流混合（图3C）。我们收集到直径为160 µm的乳浊液，菌落开始裂解并释放其细胞内容物。我们以有限稀释的方式加载微珠，以尽量减少含有多个微珠的液滴数量；但在液滴生成过程中凝胶的紧密排列导致约10%的收集液滴中含有一个微珠及一个裂解的菌落（图3D）。

我们利用ICO-seq工作流程分析了存在于人类肠道微生物组中的一种酵母菌C. albicans的基因表达。C. albicans以其能够在两种不同的细胞状态（称为白色和不透明态）之间转换而著称19。我们使用了一种经过基因工程改造的C. albicans菌株RZY122，该菌株将仅在白色细胞中活跃的WH11基因的一个拷贝替换为YFP20。我们通过该工作流程获得了一组基因表达谱，并用于分析表达至少300个独特基因的菌落。作为参考数据集，我们采用了先前已发表研究中获得的C. albicans表达数据17，并过滤掉表达独特基因少于600个的菌落。在进行主成分（PC）分析和t-随机邻域嵌入（tSNE）降维处理后21，我们发现我们的样本数据集与参考数据集之间具有总体一致性（图4A）。主成分分析显示，YFP和WH11对前两个主成分的贡献显著。此外，tSNE分析揭示了三个聚类（图4B）。虽然聚类2主要由样本数据集中的细胞组成，但聚类0和1则包含来自两个数据集的细胞。通过将WH11表达叠加到tSNE图上（图4C，上图），我们确定聚类1可能包含白色菌落。我们还发现STF2在聚类1中的表达增加（图4C，下图），这与先前获得的数据一致17。在聚类0和2中，WH11和STF2的表达相较于聚类1显著下调（图4D）。参与发酵的基因（如ADH1）在聚类0中上调，这与先前对不透明态细胞的研究结果一致22。我们发现聚类2中的菌落相较于聚类0和1中的菌落核糖体RNA水平降低。尽管样本数据集和参考数据集使用的是同一批细胞，但该结果表明，即使实验操作中存在细微差异，也可能影响基因表达。

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图1：ICO-seq实验流程概览。 (A) 在悬浮培养中生长的酵母被稀释于缓冲液中，并与熔化的琼脂糖一起注入流动聚焦式液滴生成装置，以实现单个酵母细胞按泊松分布被包埋于琼脂糖微凝胶中。当琼脂糖冷却固化后，油/水乳液被破坏并去除油相，从而获得悬浮于水中的凝胶微珠。经过过夜培养，酵母细胞在微凝胶内生长形成同基因型菌落。(B) 随后将菌落置于细胞壁降解缓冲液中处理，再与mRNA捕获微珠紧密排列后共同注入第二个微流控装置中进行包埋。微凝胶的紧密排列确保每个液滴中仅含一个凝胶，而捕获微珠的泊松分布则降低了单个液滴内包含多个微珠的概率。收集所得液滴后，进行cDNA合成及测序文库构建。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：使用装置A在琼脂糖微凝胶中生成同基因型酵母菌落。 (A) 微流控装置示意图，显示三个输入口和输出口的位置。液滴生成 junction 以红色标出。(B) 装置正常运行期间液滴生成 junction 的局部放大图。(C) 收集到的液滴显微图像，插图为含有包封细胞的单个液滴。(D) 经24小时培养后琼脂糖微凝胶中形成的同基因型酵母菌落显微图像，插图为两个菌落的局部放大图。所有比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：使用设备B从同基因型菌落中进行裂解和mRNA捕获。 (A) 微流控装置示意图，显示三个输入口和输出口的位置。液滴生成 junction 以红色标出。(B) 酵母菌落在细胞壁消化后的显微图像，插图为其中一个菌落的放大图。(C) 装置正常运行期间液滴生成 junction 的放大图。(D) 微凝胶与微珠配对后收集的乳液显微图像，插图显示含有微珠和已裂解菌落的液滴。所有比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：白色-不透明型转换反应的分析 C. albicans. (A) 结合Liu提供的参考数据集的样本数据集tSNE图17. (B转录组聚类揭示了三个 在tSNE图上可视化的聚类。C通过主成分分析确定，参与白色-不透明型转换反应的关键基因导致了变异。D) 基于tSNE图中标记的簇群绘制的YFP和WH11归一化表达水平的小提琴图。**表示p <<< 0.05，* 表示 p << 0.05. 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图1和图2。请点击此处下载这些图表。

补充文件 1-3。 请点击此处下载这些文件。

讨论

我们的同基因酵母菌落RNA测序方法（ICO-seq）改进了一种已发表的单细胞RNA测序平台Drop-Seq，用于对工程化酵母菌株进行高通量筛选。酵母细胞所含mRNA拷贝数不足典型哺乳动物细胞的10%，且具有细胞壁，需在mRNA捕获前将其降解16。这两个因素使得酵母无法直接应用于Drop-Seq或其他基于液滴的单细胞RNA测序（scRNA-seq）平台。为解决这些问题，我们将单个细胞包裹在水凝胶中并使其生长为菌落，以提供足够的RNA测序起始材料；同时在细胞裂解和mRNA捕获前，消化酵母细胞壁以生成原生质球。与原始Drop-Seq流程相比，这些改进使ICO-seq流程增加了额外的复杂性，是用户必须确保顺利进行的关键步骤。

正确操作设备A对于在琼脂糖水凝胶中包封单个酵母细胞至关重要。必须准确计数输入的酵母悬浮液，以尽量减少含有多个酵母细胞的水凝胶数量，同时确保有足够数量的水凝胶包含单个细胞，从而在mRNA捕获过程中实现合理的细胞捕获效率。在微流控设备运行过程中，琼脂糖凝胶混合物必须充分溶解，并通过注射器滤器过滤，以最大限度降低设备堵塞的风险。琼脂糖凝胶混合物具有较高黏度，其中单通道分叉为八个通道的区域尤其容易发生堵塞。通过将高速相机对准该区域以观察设备运行情况，用户可监测从八个通道产生的液滴是否均匀，并在任一通道因堵塞导致液滴不均时迅速作出响应。在显微镜下检查少量收集的乳液可作为确认高质量乳液的第二种方法。

在水凝胶中酵母菌落生长后，为确保在单菌落水平上获得高质量的mRNA提取，需采取若干预防措施。优化酵母在水凝胶培养中的时间至关重要，因为若培养时间过长，大量酵母会逸出水凝胶的限制范围，导致RNA测序时背景信号升高，并降低细胞类型间区分的灵敏度。使用Zymolyase正确生成原生质球，可确保酵母细胞在接触裂解缓冲液后释放mRNA。经Zymolyase处理后，通过显微观察应可见酵母细胞表面更加光亮。细胞壁消化不充分将导致RNA捕获效率降低。最后，将水凝胶注入装置B时，应保持其紧密排列。通过高速相机监测水凝胶的输入情况，可在水凝胶进入装置后不再紧密排列时及时终止乳液收集，否则将影响捕获效率。

本方法可能存在一个潜在问题，即酵母的微凝胶培养可能会显著改变基因表达。先前研究比较了酵母在微凝胶中与在琼脂上的基因表达，发现两者在基因表达平均值上存在差异，但总体呈正相关17；尽管如此，仍有必要在多种酵母菌株中进一步验证这一结论。该方法的另一个局限是细胞捕获效率较低，这是由于mRNA捕获微珠的加载遵循泊松分布的随机过程所致14。目前约有10%的液滴同时包含一个微珠和一个菌落，而双重包封率预计低于1%。双重包封会在RNA-seq数据分析中引入混杂因素，且其过滤仍具挑战性23；若捕获率提升至25%，则相应的双重包封率将上升至5%（补充图2）。尽管我们使用Drop-Seq平台展示了ICO-seq的应用，但还存在其他液滴RNA-seq平台可采用确定性方式而非统计学方式引入mRNA捕获微珠，例如商业化的10x Genomics Chromium平台15,24。将这些平台与ICO-seq整合，有望突破泊松统计所限制的捕获效率。最后，液滴RNA-seq的一个根本性局限在于测序后无法回收感兴趣的细胞。在选择适用于该方法分析的酵母文库类型时，应充分考虑这一限制。

在克隆水平上，已发现诸如E. coli25和S. cerevisiae26等微生物存在细胞间的异质性，揭示了群体水平分析所无法检测到的新细胞状态。C. albicans的群体RNA测序（bulk RNA-seq）分析通常仅关注全群体范围的转录组变化，或将白细胞与不透明细胞视为两个独立的群体27,28。ICO-seq技术的应用有望发现更多亚状态，并为在其他酵母物种中鉴定新细胞状态提供分析框架。然而，细胞在水凝胶中的生长不仅限于酵母：其他类型的细胞，如哺乳动物细胞、细菌以及其他真菌细胞，也可在水凝胶中培养29,30。对同基因型克隆进行测序而非单细胞测序，可平均化因细胞间变异引起的生物学噪声，从而提高细胞类型间的分辨能力。这在分析遗传多样性集中于特定合成通路的细胞时可能尤为有益。ICO-seq在细胞类型输入方面的扩展潜力，及其与商业化液滴RNA-seq平台整合的可能性，使其成为在遗传水平上解析细胞异质性的有前景的技术平台。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本项目得到了美国国家科学基金会职业奖 DBI-1253293、美国国立卫生研究院新创新者奖 DP2AR068129 和 R01HG008978 拨款、美国国家科学基金会技术中心拨款 DBI-1548297 以及加州大学旧金山分校细胞构建中心的支持。ARA 和 ZJG 是陈-扎克伯格生物中心研究员。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 注射器滤器Milipore SigmaSLGP033RS
0.5 M EDTA，pH 8.0Thermo-Fisher15575020用于配制 TE-TW 缓冲液
0.75 mm 活检打孔器World Precision Instruments504529
1 mL 注射器BD309628
1H,1H,2H-全氟-1-辛醇（PFO）Sigma-Aldrich370533
1 M Tris-HCl，pH 8.0Thermo-Fisher15568025用于配制 TE-TW 缓冲液
27 号针头BD305109
3 mL 注射器BD309657
3" 硅片，P 型，未使用测试级University Wafers447
3D 打印离心机注射器支架（定制）（定制）参见补充文件中的 3D 打印文件
低凝胶温度琼脂糖Sigma-Aldricha9414
Aquapel（疏水性玻璃处理剂）Pittsburgh Glass Works47100
Drop-Seq 微珠ChemGenesMACOSKO-2011-10
玻璃显微镜载玻片（75 mm × 50 mm）Corning294775X50
离子型 Krytox 表面活性剂合成方法见参考文献14。可用 PEG-PFPE 表面活性剂替代。
异丙醇Sigma-Aldrich109827
NaClSigma-AldrichS9888
Novec 75003M98-0212-2928-5通常称为 HFE 7500
PBSFisher ScientificBP243820
PE-2 聚乙烯管Scientific CommoditiesB31695-PE/2
PEG-PFPE 表面活性剂Ran Biotechnologies008-FluoroSurfactant
PGMEA 显影液Sigma-Aldrich484431
光刻掩模CadArt Services（定制）参见补充文件中的掩模设计
旋涂仪Specialty Coating SystemsG3P-8
SSC 缓冲液Sigma-AldrichS6639
SU-8 2100MicroChemY111075
SU-8 2150MicroChemY111077
Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒Krayden4019862
Tween-20Sigma-AldrichP1379用于配制 TE-TW 缓冲液
YR 消化缓冲液Zymo ResearchR1001-1原生质体消化缓冲液
YR 裂解缓冲液Zymo ResearchR1001-2
ZymolyaseZymo ResearchE1005原生质体消化酶混合物

参考文献

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