棕榈酰化是指以可逆方式将一个16碳的棕榈酰基团结合到靶蛋白的半胱氨酸残基上。本文中，我们描述了一种生物化学方法——酰基-聚乙二醇交换凝胶迁移（APEGS）检测法，用于研究小鼠脑组织裂解液中任何目的蛋白的棕榈酰化状态。
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摘要
摘要
突触后密度区（PSD）内AMPA受体（AMPARs）水平的活动依赖性改变被认为是学习与记忆的细胞机制之一。棕榈酰化以活动依赖的方式调控多种突触蛋白的定位与功能，包括AMPA受体、辅助因子及突触支架蛋白。我们鉴定了突触分化诱导基因（SynDIG）家族的四个基因（SynDIG1-4），它们编码在脑中特异性表达的跨膜蛋白，能够与AMPARs结合并调控突触强度。SynDIG1在跨膜区附近第191和192位的两个半胱氨酸残基上发生棕榈酰化修饰，该区域对活动依赖性兴奋性突触的发育具有重要作用。本文介绍了一种创新的生化方法——酰基-聚乙二醇交换凝胶迁移（APEGS）检测法，用于研究任意目标蛋白的棕榈酰化状态，并展示了该方法在小鼠脑裂解液中SynDIG蛋白家族的应用价值。
引言
S-棕榈酰化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰，能够调节靶蛋白与细胞膜的稳定结合、蛋白质的转运以及蛋白质-蛋白质相互作用1。该过程由棕榈酰酰基转移酶（PAT）催化，通过硫酯键将一个16碳的棕榈酰基团添加到半胱氨酸残基上。大脑中许多突触蛋白会发生棕榈酰化修饰，包括AMPA受体（AMPA-Rs）和PSD-95，这种修饰具有活动依赖性，可调控这些蛋白的稳定性、定位和功能2,3,4。突触后密度区（PSD）中AMPA受体水平的变化依赖于辅助因子与PSD-95等突触支架蛋白的相互作用，这是突触可塑性的基础；因此，检测突触蛋白棕榈酰化状态的方法为研究突触可塑性机制提供了重要线索。
此前，我们鉴定了包含四个基因（SynDIG1-4）的 SynDIG 基因家族，这些基因编码在脑组织中特异性表达的跨膜蛋白，并可与 AMPARs5 相互作用。在分离的大鼠海马神经元中，过表达或敲低 SynDIG1 分别会使 AMPA 受体突触的大小和数量增加或减少约 50%，该结果通过免疫细胞化学和电生理学方法检测得到5。我们曾利用酰基-生物素交换（ABE）实验表明，SynDIG1 在两个保守的跨膜邻近半胱氨酸残基（在所有 SynDIG 蛋白中均存在）上以依赖于神经元活动的方式发生棕榈酰化修饰，从而调控其稳定性、定位及功能6。ABE 实验依赖于对经修饰保护的半胱氨酸位点进行生物素交换，随后通过亲和纯化进行检测7。本文中，我们描述了一种创新的生化方法——酰基-聚乙二醇交换凝胶迁移（APEGS）实验8,9,10,11,12，该方法无需亲和纯化步骤，而是利用蛋白在凝胶电泳中迁移率的变化来确定目标蛋白的修饰数量。本方案以小鼠脑组织中内源性膜蛋白为研究对象，适用于已有合适抗体的蛋白检测。
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方案
所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）制定的指南，并已获得加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 小鼠脑膜的制备
- 使用断头器装置处死小鼠，并迅速解剖取出脑组织（尽可能在<1 分钟内完成，以尽量减少解剖过程中可能发生的棕榈酰化修饰变化）。立即在冰上用玻璃匀浆器（约 12 次 strokes）将组织在 10 mL 匀浆缓冲液（表 1）中匀浆。
- 在 4 °C 条件下，以 1,400 × g 离心裂解物 15 分钟。将上清液转移至冰上新的离心管中。用等体积的匀浆缓冲液重悬沉淀（约 6 次 strokes），并在 4 °C 条件下以 710 × g 离心 10 分钟。
- 合并第 1.2 步的上清液，并在 4 °C 条件下以 40,000 × g 离心 20 分钟。
- 弃去上清液（胞质组分），用匀浆缓冲液重悬沉淀的膜组分（P2 组分）。
注意：样品可进行速冻，并在 -80 °C 保存以备后续使用。 - 采用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。进行 APEGS 检测时，取约 100−200 mg 蛋白（最多不超过 250 mg），溶于 470 µL 缓冲液 A（表 1）中，置于 1.5 mL 离心管内。超声处理后，在 25 °C 条件下以 >13,000 × g 离心 10 分钟，去除不溶性蛋白。将可溶性蛋白转移至新的 1.5 mL 离心管中。
2. 酰基-PEG交换凝胶迁移（APEGS）实验
- 破坏二硫键并封闭游离半胱氨酸。
- 在 25 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP；25 µL，由储备液加入；表 1）中于 55 °C 孵育 60 分钟，以破坏二硫键。
- 在室温下用 50 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM；12.5 µL，由储备液加入；表 1）封闭游离半胱氨酸，孵育 3 小时。
注：反应时间可延长至过夜。
- 进行氯仿-甲醇（CM）沉淀。
- 将蛋白溶液从 1.5 mL 离心管转移至可于摆动桶转子中以中等速度离心的聚丙烯或玻璃管中。5 mL 管为理想选择。加入四倍体积（2 mL）甲醇（MeOH），短暂涡旋混匀。
- 加入两倍体积（1 mL）氯仿，短暂涡旋混匀。
- 加入三倍体积（1.5 mL）dH2O，短暂涡旋混匀。
- 在摆动桶转子中，于 25 °C 以 3,000 x g 离心 30 分钟。
- 小心移除并弃去上层液相。
- 加入三倍体积（1.5 mL）MeOH，轻柔但彻底混匀，注意避免破坏不透明的蛋白饼状沉淀。
- 在摆动桶转子中，于 25 °C 以 3,000 x g 离心 10 分钟。
- 使用玻璃刻度移液管，尽可能移除上层液相，避免扰动蛋白饼状沉淀。
- 用 1 mL MeOH 小心冲洗沉淀。
- 将沉淀在空气中干燥至少 10 分钟。
注：干燥后的沉淀可在 -20 °C 保存。
- 使用羟胺（NH2OH，HAM）裂解棕榈酰-硫酯键。
- 将蛋白沉淀重悬于 125 µL 缓冲液 A 中，并短暂超声处理。于 25 °C 以 >13,000 x g 离心 10 分钟，去除不溶性物质。将溶解的蛋白转移至新的 1.5 mL 管中。
- 加入 375 µL 缓冲液 H（HAM+；表 1）或缓冲液 T（HAM-；表 1），于 25 °C 孵育 60 分钟。
- 重复步骤 2.2 中所述的 CM 沉淀。
注：干燥后的沉淀可在 -20 °C 保存。 - 向未保护的半胱氨酸残基添加 mPEG。
- 将沉淀重悬于含 10 mM TCEP 的 100 µL 缓冲液 A 中。转移至 1.5 mL 管中。
注：在 CM 沉淀步骤中发生显著蛋白损失是正常现象。后续所有步骤均在 1.5 mL 管中进行，蛋白体积限制在约 120−130 µL 以内。这将减少最终 CM 沉淀过程中的蛋白损失。 - 向蛋白样品中加入 20 mM mPEG-5k（25 µL，由储备液加入；表 1），通过移液混匀。于 25 °C 在翻转混合仪上孵育 60 分钟。
- 为去除未结合的 mPEG-5k，按步骤 2.2 所述进行 CM 沉淀，使用以下调整后的体积：4 倍体积 MeOH（500 µL）、2 倍体积氯仿（250 µL）和 3 倍体积 dH2O（375 µL）。于 25 °C 以 >13,000 x g 离心 10 分钟。
- 如前所述小心移除上层液相，避免扰动厚实的絮状沉淀。加入 1 mL MeOH，轻柔但彻底混匀。于 25 °C 以 >13,000 x g 离心 10 分钟。
- 小心移除上清液，并用 1 mL MeOH 冲洗沉淀。于 25 °C 以 >13,000 x g 离心 10 分钟。将沉淀空气干燥。
注：干燥后的沉淀可在 -20 °C 保存。 - 将干燥的沉淀重悬于 50 µL 缓冲液 A（不含 TCEP 或任何还原剂）中。保留 5 µL 用于 BCA 蛋白定量。定量后，加入适量 4x Laemmli 上样缓冲液，并根据目标蛋白情况，可能需将样品在 70−100 °C 加热 10 分钟。
注：煮沸可能导致某些膜蛋白发生聚集。
- 将沉淀重悬于含 10 mM TCEP 的 100 µL 缓冲液 A 中。转移至 1.5 mL 管中。
3. 聚乙二醇化蛋白的蛋白质印迹分析
- 将样品上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶13。
注意：本实验方案中使用了10%的聚丙烯酰胺凝胶。 - 采用标准的分离、转膜和检测步骤进行蛋白质印迹（Western blotting）14。
- 使用密度测定法14确定聚乙二醇化蛋白与非聚乙二醇化蛋白的相对含量。
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结果
使用针对目标蛋白的抗体进行免疫印迹，通过与未加入HAM的样品进行迁移率比较，可揭示小鼠脑组织裂解液中蛋白的棕榈酰化状态（非棕榈酰化、单棕榈酰化、双棕榈酰化等）。此前，我们已通过ABE实验表明SynDIG1在两个位点发生棕榈酰化修饰6；然而，尚无法确定这两个位点在脑组织中是否均被修饰。本文结果显示，SynDIG1、SynDIG4/Prrt1和Prrt2在小鼠脑组织中均存在棕榈酰化修饰，且各自具有两个潜在的棕榈酰化位点（图1）。有趣的是，根据非棕榈酰化、单棕榈酰化和双棕榈酰化蛋白信号的差异，每种蛋白在小鼠脑组织中呈现出不同的棕榈酰化状态。通过蛋白印迹条带的密度分析，可获得棕榈酰化状态的定量信息。
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讨论
在我们之前的研究中，我们利用ABE检测法证明，SynDIG1在两个保守的跨膜邻近半胱氨酸残基（在所有SynDIG蛋白中均存在）上以依赖于活性的方式发生棕榈酰化，从而调控其稳定性、定位和功能6。该方法的一个局限性在于，ABE检测法在操作的最后一步需要使用与亲和素分子偶联的琼脂糖树脂进行亲和纯化，导致信号显著丢失，使定量分析变得复杂。此外，ABE检测法无法区分蛋白质是仅在一个位点还是在多个位点发生棕榈酰化。
本文采用 APEGS 检测法8,9,10,11,12，以确定从小鼠脑组织提取物中获得的 AMPA 受体辅助跨膜蛋白 SynDIG1 及其相关蛋白 SynDIG4（亦称为 Prrt1）和 Prrt2 的棕榈酰化状态...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 K. Woolfrey 对 APEGS 检测实验提供的建议和意见。本研究由 Whitehall 基金会和美国国立卫生研究院神经科学与心理健康研究所（NIH-NIMH，项目编号：1R01MH119347）向 E.D. 提供的研究基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 羟胺（HAM） | ThermoFisher | 26103 | |
| 甲氧基-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL（mPEG） | NOF | ME-050MA | 分子量 ~5000 kDa |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5415R | 或性能相当的设备 |
| N-乙基马来酰亚胺（NEM） | Calbiochem | 34115 | 剧毒。 |
| 用于密度测定的光学成像仪 | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | 或性能相当的设备 |
| 带盖聚丙烯管 | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| 血清移液管（玻璃） | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| 台式离心机 | Beckman | Allegra X-15R | 或性能相当的设备 |
| 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP） | EMD Millipore | 580560 |
参考文献
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重印与许可
