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光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

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DOI：

10.3791/61023

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2020年10月27日

 ,  , 
1Biology and Chemistry, Synthetic Biology, University of Bremen, 2Advanced Fluorescence Microscopy, Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr-Universität Bochum

本文内容

摘要

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可在自由活动的动物中以高时空分辨率调控其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控及行为学检测。

摘要

在自由活动的小鼠中，光遗传学调控神经环路可影响其急性和长期行为。该方法能够对单个神经元和特定脑区的神经递质释放进行操控，直至调控中枢神经系统中的完整神经环路，并允许直接测量行为学结果。通过注射携带特定DNA（如通道视紫红质2（ChR2））的病毒载体，使神经元表达光遗传学工具。通过慢性植入的光学器件将光导入特定脑区，其末端直接位于目标区域上方。经过两周的恢复期并确保光遗传学工具充分表达后，可对小鼠重复进行行为学测试，并在测试中对目标神经元实施光遗传学刺激。

与常用的化学或电刺激方法相比，光遗传学调控具有高时空分辨率，并可实现高度的细胞特异性。光刺激不会损伤神经组织，因此既可用于长期实验，也可用于同一只小鼠的多次行为学实验。光遗传学工具的应用潜力几乎无限，能够实现通过光来激活或沉默整个神经元，甚至操控特定类型的受体。

通过整合光遗传学刺激的行为学实验结果，可直接可视化由干预引起的行为变化。以同一动物在无光照刺激条件下的行为作为基线，是检测诱导性变化的良好对照。这有助于详细解析参与特定行为（如焦虑）的神经元类型或神经递质系统。通过对神经网络进行长期刺激或在光刺激后开展行为观察，还可深入研究神经网络的可塑性。光遗传学技术将有助于阐明多种神经系统疾病中的神经信号机制。

引言

中枢神经系统中神经元环路的调控及其行为学结果对于理解大脑功能至关重要，尤其是在精神类疾病以及学习和记忆等认知任务中。利用光遗传学技术，可以通过光来调控单个细胞或细胞群体，直至整个神经环路。常用的光遗传学工具如通道视紫红质2（ChR2）或古紫红质（Arch），能够激活或抑制神经元，或在投射到特定脑区的轴突末梢处增加或抑制神经递质的释放1,2,3,4。然而，使用Arch时需格外谨慎，因其在突触前末梢激活时可增加自发性神经递质释放5。Arch是一种外向整流质子泵，可改变细胞内的pH值。这种碱性环境会诱导钙离子内流，从而增强神经递质的释放5。为了特异性地调控细胞内信号通路，可构建受体嵌合体，该嵌合体由光可激活的光遗传学工具（如视紫红质或视锥蛋白）与适当的G蛋白偶联受体组合而成6,7,8。在过去十年中，可用的光遗传学工具在数量和种类上均显著增加9。

光遗传学的目的是在动物行为过程中调控神经环路。光遗传学技术能够实现对急性行为变化的测量，例如焦虑相关行为的改变。光遗传学工具通过病毒载体递送至大脑的特定靶区。借助特殊的启动子和增强子，或Cre-loxP系统，可确保光遗传学工具在特定细胞类型中表达（图1A）。目前已开发出多种基因修饰小鼠品系，仅在特定细胞类型中表达Cre重组酶。例如，Nex-Cre小鼠在Nex启动子的调控下，仅在大脑皮层和海马的锥体神经元中表达Cre-Recombinase10。该酶能够识别并翻转两侧带有loxP位点的DNA序列11。因此，只有表达Cre-Recombinase的神经元才能转录位于两个loxP位点之间且已被翻转的双floxed光遗传学工具，而其他类型的神经元则不能12,13。在Nex-Cre小鼠中，光遗传学工具仅在锥体神经元中表达。随后通过在目标脑区上方长期植入光纤，实现对特定脑区的光刺激。动物可连接至合适的光源，在几乎各类行为学实验中自由活动。

通过病毒注射、光纤装置和脑区示意图实现神经元激活的光遗传学方法。
图 1：注射与植入。 A) ChR2-YFP 的 Cre-loxP 系统。双 floxed 光遗传学工具被包装在腺相关病毒（AAV）中，用于注射至脑组织。 B) 病毒注射及光学神经接口植入小鼠前额叶皮层（mPFC）IL 区域上方/内部的矢状面示意图。注射与植入均从上方进行。所有目标区域，包括 IL、BLA 和 DRN，均已标出。 C) 植入式光纤、套管及光源的详细结构示意图。 D) 从一根 200 µm 光纤发出的蓝光和红光在灰质脑组织中的扩散范围（Yizhar 等，2011）。蓝光在组织中的最大扩散距离为 0.5 mm，红光约为 1 mm。颜色编码：红色表示光强达到该区域最大值的 50%，黄色为 10%，绿色为 5%，蓝色为 1%。 E) 在左侧 IL 区域正上方单侧植入 200 µm 光纤的冠状面示意图。每个半球的 IL 区域宽度为 0.25 mm，深度为 0.2 mm。蓝光和红光灯泡图标表示光强扩散至 5% 的边界范围，该数据根据 Yizhar 等人的研究换算至实际尺寸。LoxP：P1 交叉位点；ChR2：通道视紫红质；YFP：黄色荧光蛋白；dflox：双 floxed；IL：下边缘皮层；BLA：基底外侧杏仁核；DRN：背缝核；PrL：前边缘区域。本图改编自 Berg 201948。 请点击此处查看该图的放大版本。

光遗传学方法被广泛应用，因其兼具高时间分辨率和高空间分辨率14，并可实现特定细胞类型的调控。此外，植入装置可重复使用，无需额外处理。在立体定位手术中完成携带光遗传工具的腺相关病毒注射以及光纤植入后，小鼠需恢复两周。我们选择仅两周的恢复时间，因为该时长已足以使小鼠从手术中恢复，并确保病毒充分表达。由于行为学实验之后需进行免疫组织化学分析，我们必须确保小鼠在实验过程中不会年龄过大，否则组织质量将下降。小鼠在植入后未表现出明显的行为障碍，并能进行典型的笼内活动。当然，植入手术伴随显著的外科损伤，因此需对小鼠进行密切监测。术后小鼠需单笼饲养，因为群养小鼠倾向于相互损伤新鲜伤口和植入物。然而，饲养条件对雄性小鼠的焦虑水平具有显著影响，单笼饲养的小鼠表现出较低的焦虑水平15，且总体上更少出现类似抑郁的症状16。

化学或电学手段对脑环路的操控缺乏光遗传学所具有的高细胞类型特异性，且在时间和空间分辨率上也较低14,17,18。根据具体的研究问题，电刺激或化学刺激可能具有不同的优势。当需要同时刺激某一特定脑区内的纤维终末时，电刺激是最适宜的方法；而当需要通过激动剂激活某一完整脑区内特定的递质受体时，化学刺激则是较好的选择。相较于化学或电刺激，光遗传学的另一显著优势在于，神经元在体内天然情况下对光不敏感，从而避免了副作用的发生19。尽管如此，高强度的光照可能引起热效应8,20，但通过设置适当的对照组，可排除由光遗传操控引起的非特异性行为学效应。

利用光遗传学技术研究啮齿类动物行为，尤其是在精神疾病相关领域，已取得显著进展，该技术能够在自由活动的动物体内直接调控单个受体乃至特定的细胞群体21和神经环路22。能够测量此类调控的急性效应，以及在特定时间点23或慢性刺激后24的长期行为效应，使实验设计具有高度灵活性，并为脑环路提供极为细致的洞察。光刺激可用于调控光遗传工具注射部位的神经元。当注射与植入靶向同一脑区时，可作用于该区域内主神经元和中间神经元的胞体及其反向投射的轴突3,6,8。然而，光导纤维也可植入与注射部位不同的脑区。在此情况下，光刺激可调控注射区域投射靶区中轴突末梢的神经递质释放25,26,27。

本研究中，采用光遗传学技术结合行为实验来分析与焦虑相关的行为。与焦虑相关的精神性疾病影响了全球超过三分之一的人口28,29,30，并造成巨大的经济负担31。患者常表现出觉醒感、紧张和担忧，并继而出现回避行为32,33。这些持续出现的负面情绪主要针对未来事件34，严重干扰患者的日常生活。常用的治疗方法，如苯二氮䓬类药物或选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs），仅对部分患者有效。大量患者对治疗完全无反应35，表明此类疾病的潜在机制尚未被充分阐明。内侧前额叶皮层（mPFC）已被证实对焦虑的发生和发展具有重要作用21,25,27,36,37,38。特别是，mPFC中的下边缘皮层（IL）区域的过度激活可能与焦虑相关障碍有关39,40。本文所描述的示例实验有助于理解mPFC的IL区域的调控如何影响焦虑行为。此外，该研究还可能为开发焦虑相关精神疾病的新治疗策略提供支持。

使用2-6个月大的雄性Nex-Cre小鼠，在mPFC的IL脑区内的锥体神经元中特异性表达ChR241。Nex-Cre小鼠品系背景为C57Bl/6，可在锥体神经元中特异性表达Cre重组酶。在立体定位手术过程中，通过腺相关病毒载体将双floxed的ChR2-DNA注射至IL区域。光遗传学植入物置于目标区域正上方（图1B），并用牙科水泥固定。对照动物在同一区域注射双floxed的tdTomato-DNA，以模拟细胞特异性表达。

动物在手术前群养，手术后单笼饲养，以避免其他小鼠造成伤害。单笼饲养的小鼠置于独立通气笼（IVC）架中的TypI-L笼具中。光照-黑暗循环采用12:12 h节律，光照期从上午10点开始。所有行为学实验均在黑暗期进行，此阶段相当于啮齿类动物的活跃期。水和标准饲料颗粒均自由供应。经过两周恢复期后，以确保锥体神经元中ChR2的充分表达，小鼠即可用于行为学实验。

开放旷场（Open Field, OF）是一个50 cm × 50 cm的方形迷宫，四周为40 cm高的喷砂墙壁。地面被划分为16个方格，其中内部的4个方格代表中心区域。测定的行为指标包括：1）在中心区域停留的时间，2）进入中心区域的次数，以及3）总移动距离。本实验共包含4个试验阶段，总计20分钟。在第1和第3个试验阶段不进行光刺激，而在第2和第4个试验阶段施加20 Hz的刺激，光脉冲持续时间为5 ms，光强度为1 mW，波长为473 nm（图2A）。在后续的试验阶段中考虑了动物对测试环境的适应性，而使用假注射对照组动物可揭示这种适应性的具体表现。

Barnes迷宫是一种用于研究学习与记忆的实验。该装置是一个直径为92 cm的圆形平台，周边均匀分布着20个等距的孔洞，其中19个孔洞封闭，另一个孔洞下方放置一个逃逸箱。连续4天，小鼠每天进行4次训练试验，以学习逃逸箱的位置。第5天进行一次记忆测试。th 第1天，移除逃生箱，测试小鼠找到正确孔洞所需的时间。测量的行为指标包括：1）找到逃生箱/正确孔洞所需时间；2）目标孔洞访问次数及错误次数；3）进入逃生箱前所移动的距离。不同组别的光刺激分别在训练第1-4天的获取（acquisition）或巩固（consolidation）阶段进行，或在第5天测试日的记忆提取（retrieval）阶段进行。图 2D).

旷场实验、高架十字迷宫、巴恩斯迷宫示意图，详细说明实验时间序列。
图 2：结合光遗传学方案的行为学实验。A) 旷场实验的示意图及其对应的光刺激方案。C) 高架十字迷宫实验的示意图及其对应的光刺激方案。D) 巴恩斯迷宫实验的示意图及其对应的光刺激方案。EPM：高架十字迷宫；OF：旷场实验；BM：巴恩斯迷宫测试。本图经修改自 Berg 201948。请点击此处查看此图的放大版本。

进行光遗传学刺激时，需根据所使用的光遗传学工具及目标神经元类型，调整光照强度和频率。应使用尽可能低的光照强度，以避免对组织造成损伤，已有研究表明高强度光照可能引起组织发热效应8,20。对于ChR2，通常采用20 Hz频率、每次5 ms光脉冲的刺激方案2。由于ChR2对光敏感度较高，1 mW的光照强度已足够。光刺激方案应交替设置“光照关闭”与“光照开启”试验，以直接测量行为变化。行为学实验期间，整个实验动物群体所处的外部环境条件应保持稳定。需关注的关键条件包括噪音（注意实验设备本身可能产生噪音）、气味（始终使用乙醇清洁行为学装置）、光照强度以及实验操作者。实验操作者应始终保持为同一人。此外，同一组动物的所有实验应在每天相同的时间段进行，建议选择在动物设施黑暗期开始后数小时进行。

本实验的目标是通过强烈激活兴奋性锥体神经元，提高内侧前额叶皮层（IL）区域的兴奋/抑制（E/I）比率。已知该特定皮层区域的E/I比率升高会增加小鼠的焦虑水平40,42,43,44。

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得不来梅大学机构动物研究设施以及“不来梅科学、卫生和消费者保护参议院”（#146）的批准

1. 光学植入物的制备9（图1C）

  1. 将陶瓷套管的平面朝上放置于台钳中。
  2. 使用光纤剥线工具剥离直径为 200 µm 的玻璃光纤的涂覆层，并用陶瓷光纤刻划笔切割成 2-3 cm 长的小段。
  3. 将一段玻璃光纤放入陶瓷套管中，确保两端均匀伸出。
  4. 用注射针头在陶瓷套管的平面端滴加一滴瞬干胶。
    注意：此处可暂停实验流程。
  5. 将预植入件从台钳中取出，在陶瓷套管的圆弧面端，用陶瓷光纤刻划笔将玻璃光纤尽可能剪短。
  6. 将预植入件固定于套管抛光托盘上，在四种不同粒径的抛光纸上各抛光 20 次（呈“8”字形运动），依次为 30 µm、6 µm、1 µm 和最后的 0.02 µm 抛光纸。
  7. 将预植入件从抛光托盘上取下，根据植入所需长度，在陶瓷套管的平面端将玻璃光纤切割至合适长度。测量时应从突出的瞬干胶末端开始计算。
    1. 为获得平整的切割面，可先在玻璃光纤上划痕 2-3 次，然后将其折断。
      注意：可参考 Paxinos 和 Franklin45 的小鼠脑图谱计算植入长度。植入物末端应正对目标区域上方，且计算长度时应包含颅骨厚度。若需刺激 IL 区域，则玻璃光纤长度应为 1.8 mm（图 3）。

脑切片示意图，电极放置位置，颅内研究装置，解剖结构标注。
图3：小鼠脑图谱（Paxinos 和 Franklin），显示植入电极到达 IL 区域的代表性长度。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将制备好的植入物在乙醇中消毒 10 分钟，植入前使其自然晾干。

2. 注射与植入

  1. 将一只小鼠转运至手术室并称重。通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮 0.12 mg/g，赛拉嗪 0.01 mg/g）实施麻醉。
    1. 用左手固定小鼠，使其仰卧，头部略低于身体。
    2. 将注射针头对准腹部左下象限，将针管插入皮下约 1 cm。
    3. 缓慢且持续地将麻醉剂注入腹腔。
    4. 将小鼠放回笼中，等待其进入深度麻醉状态。
      注意：麻醉深度可通过眨眼反射和足趾间反射消失来判断。
  2. 将小鼠置于加热板上，并将其头部固定于立体定位仪中。前方固定鼻部和牙齿，两侧固定耳杆。
    注意：头部必须在左右轴和前后轴上保持平直，以确保立体定位坐标准确。
  3. 皮下注射卡洛芬（Carprofen）2 mg/kg 以提供镇痛，并在双眼涂抹不透明眼膏，防止角膜干燥。
  4. 用湿润的纸巾润湿头皮毛发，然后用剪刀剪除。确保使用湿纸巾清除所有松散毛发。使用棉签蘸取 0.5 mL 含碘酊剂（贝塔碘 100 mg/mL 聚维酮碘和 11 mg/mL 碘）对头皮进行消毒，并自然风干。
    注意：除剪刀外，也可使用电动剃毛器进行有效去毛。
  5. 用镊子提起目标区域上方的头皮，沿中线剪开约 1 cm。使用两把镊子将皮肤向两侧推开，暴露颅骨。确保同时去除颅骨上方的薄层皮肤，并让暴露的颅骨干燥。
  6. 为后续植入操作对颅骨进行粗糙化处理。
    1. 从粘接剂套装（如 Optibond）中取 2 mm × 2 mm 的 37% 磷酸滴于颅骨表面，用注射器尖端均匀涂抹，作用 15 秒。
    2. 用棉签彻底清除所有磷酸，并用 1 mL 0.9% NaCl 冲洗颅骨两次。
    3. 用棉签和压缩空气将颅骨干燥。
      警告：磷酸具有危险性，必须完全清除，以避免组织损伤。
  7. 计算个体化坐标的 F 因子。
    1. 将玻璃插管置于立体定位仪中，并精确定位于前囟（bregma）正上方。
    2. 将坐标系统归零，然后将玻璃插管移至后囟（lambda）位置。
    3. 使用以下公式计算 F 因子46：
      用于F因子分析的前囟-后囟方程；科学研究中的教学公式。
    4. 将 F 因子乘以小鼠脑图谱中的坐标值，以调整为该个体小鼠的对应坐标。
  8. 在颅骨上钻孔以便注射。
    1. 使用调整后的坐标确定目标脑区正上方的颅骨位置，并用注射插管尖端在骨面轻划标记。
    2. 将注射插管置于标记处，原位旋转插管在颅骨上钻孔。若钻孔处有血液渗出，用 1 mL 0.9% NaCl 冲洗并随后干燥颅骨。
  9. 将病毒溶液吸入玻璃插管中。
    1. 在颅骨上滴加 100 µL 0.9% NaCl，并在其上放置一片 1 cm × 1 cm 的 Parafilm 膜，确保无菌面朝上。
    2. 将 1–2 µL 病毒溶液滴于 Parafilm 膜上，将玻璃插管尖端浸入其中。
    3. 将玻璃插管连接至注射器，施加轻微负压，等待数秒内病毒溶液被吸入插管。
      注意：必须在空气进入插管前停止负压操作，因此总会残留少量病毒溶液。
  10. 将病毒溶液注入目标区域。
    1. 将装有病毒的玻璃插管置于钻孔正上方。
    2. 缓慢将插管插入钻孔，当插管尖端与颅骨表面齐平时，将 z 坐标归零。
    3. 小心将插管降至注射位点的最深位置。
    4. 调节双目显微镜，聚焦于插管内病毒液面的弯月面。
    5. 用注射器施加轻微正压，使弯月面略微下降。
    6. 让病毒扩散 2–3 分钟后，再缓慢将玻璃插管向上移动至下一个位置。
    7. 在整个目标区域内，每隔 200–300 µm 注射一次病毒溶液。
    8. 最后一次注射后，极缓慢地拔出玻璃插管并丢弃。
  11. 使用粘接剂套装（如 OptibondTMFL）准备颅骨以进行植入。
    1. 用压缩空气将颅骨干燥。
    2. 使用配套棒状工具滴加 5 µL 引物（如 Optibond，含 1–30% 乙醇、硅酸、甘油磷酸二甲基丙烯酸酯、2-(2-(甲基丙烯酰氧基)乙氧基羰基)苯甲酸、2-羟乙基甲基丙烯酸酯），静置干燥 15 秒。
    3. 使用同一工具滴加 5 µL 粘接剂（如 Optibond，含 15–20% 2-羟乙基甲基丙烯酸酯 + 1–2% 碱性六氟硅酸盐(Na)），并在 420–480 nm 紫外光下照射 20 秒使其固化。
      注意：颅骨必须保持完全干燥，且引物和粘接剂应以极薄层涂抹。
      警告：切勿直视紫外光，以免损伤眼睛。
  12. 将植入物精确定位于目标区域正上方。
    1. 将植入物固定于相应夹持器中。
    2. 用压缩空气干燥颅骨。
    3. 将光纤尖端对准钻孔正上方，小心下放。
    4. 当植入物底部的少量超级胶水接触颅骨时即停止下放。切勿对颅骨施加压力！
      注意：若注射与植入操作在不同脑区进行（例如 背缝核和海马），则在磷酸处理后、双组分粘接前完成所有必要钻孔，随后按前述步骤（2.8–2.14）操作。
  13. 固定植入物。
    1. 检查颅骨是否仍完全干燥。
    2. 在植入物周围及邻近区域涂抹流动型牙科水泥（如 Gradia direct flo），并在 420–480 nm 紫外光下照射 20 秒使其固化。
      注意：牙科水泥用量取决于裸露颅骨面积，应完全覆盖整个颅骨表面。
    3. 再涂布两层水泥，彻底填满所有裸露且干燥的颅骨区域。每层均需用紫外光（420–480 nm）照射固化。
  14. 完成手术。
    1. 在整个伤口区域涂抹 0.5 g 碘膏（贝塔碘 100 mg/mL 聚维酮碘和 11 mg/mL 碘）。
    2. 皮下注射 0.1 mL 溶于 0.9% NaCl 的葡萄糖溶液至颈部，以促进快速恢复。
    3. 解除鼻部和耳部固定，将小鼠转移至清洁笼盒，并置于加热灯下以防止体温流失。
    4. 待小鼠苏醒后，将其送回饲养设施。
    5. 每日至少检查一次健康状况。若发现小鼠状态异常，应采取相应措施（例如，若出现疼痛迹象，应继续给予卡洛芬镇痛，最长可持续 3 天）。
      注意：术后恢复两周后，小鼠可用于行为学实验。

3. 建立新实验（示例：ChR2 刺激与旷场实验）

  1. 脉冲发生器
    1. 编程设置脉冲发生器（例如 Prizmatix）以进行光刺激。
    2. 打开软件，选择光源所连接的 USB COM 端口。
    3. 选择 选择操作模式 (3) | 触发信号为高电平时执行脉冲序列，信号为低电平时停止 以便外部软件控制光源。
    4. 设置光刺激程序。对于20 Hz刺激且光脉冲持续时间为5 ms的情况：选择TI = 23 ms，P1D = 5 ms，P1I = 22 ms，P2D = 0 ms。
    5. 按压 开始序列该状态将一直持续至实验结束。
      注意：必须先启动脉冲发生器软件（Prizmatix Pulser），再启动视频追踪软件；否则视频追踪软件将无法识别该设备。
  2. 视频追踪软件（例如，Ethovision XT）
    1. 从预定义的模板创建新实验。
      1. 打开软件，进入 文件，选择 新模板. 选择 应用预定义模板.
      2. 选择 活细胞示踪 并按下以选择相机 源 并确认已连接的 Basler GenICam。
        注意：摄像头的实时图像现在将显示在右上方窗口中。
      3. 按压 下一步 并选择应被记录的动物（啮齿类动物, 小鼠).
      4. 按压 下一步 并选择竞技场模板 开放旷场，方形. 选择区域模板 中心、边缘、角落 并确认 下一步.
      5. 确认 1 名受试者 应进行追踪的 下一步.
      6. 选择 中心点、鼻尖点和尾基点 并与背景相比确认动物颜色更深 下一步.
      7. 确认推荐的采样速率为 12.5 下一步 并完成该步骤。
      8. 为实验命名并选择保存位置。
    2. 定义实验条件。
      1. 前往 设置 和 实验设置. 选择 中心点、鼻尖点和尾基检测 作为追踪特征。
      2. 选择 使用试验控制硬件 并前往 设置.
      3. 选择 Noldus USB-IO box 并确认 好的.
      4. 选择 定制硬件 将TTL端口的设备类型设置为已连接至脉冲发生器设备的类型，并确认 好的.
    3. 定义实验区域设置。
      1. 前往 竞技场设置 并选择 Arena 设置 1.
        注意：相机现在将自动打开一张背景图像。
      2. 确认图像 抓取.
      3. 通过调整区域大小，将预定义区域适配到实际场地。使用箭头及其右侧的两个符号进行操作。如果某些区域不需要，可将其删除。
      4. 按压 1. 绘制标尺以校准 从迷宫的一个角落向另一个角落拉一条线，输入实际距离的长度（单位：cm）。
      5. 对另一轴重复上述操作。
    4. 测试光刺激是否正常工作。
      1. 前往 Arena - 硬件映射 并选择 测试 在灰色条上。
      2. 选择命令 输出1 高 并按压 测试.
        注意：光纤末端应有光发出。选择时 输出1 低 和 测试，刺激应停止。
    5. 设定试验控制参数，使实验持续20分钟。将试验阶段Off1、On1、Off2和On2各设置为5分钟。
      1. 前往 试验控制设置 并选择 持续时间 30 分钟.
      2. 通过调整主尺来准备主尺 条件：时间 20分钟，通过选择 设置 并将30改为20分钟。确认与 好的.
        注意：条件为 开始追踪 应为 当受试对象在实验区域中停留 2 秒时这样系统将在小鼠进入实验区域时自动开始追踪。
      3. 创建光刺激的子规则：前往 结构, 更多 并选择 子规则.
      4. 为其命名，例如 光刺激方案.
      5. 将其置于主规则下方，并用鼠标光标选中蓝色区域以展开两个方框。
      6. 前往 条件, 时间 并为其命名，例如 光照开启 1.
      7. 调节 条件满足 与 5 分钟后. 用……确认 好的.
      8. 将盒子直接放在后面 规则开始 通过将其拖动至黑线来框选子规则。
      9. 前往 动作 | 定制硬件 并将其命名为： 光开启 1.
      10. 选择 执行操作 作为 输出 1 高 并确认 好的.
      11. 将盒子直接放在后面 条件 盒子
        注意：实验开始5分钟后，应启动光刺激。
      12. 重复上述步骤以确定时间条件 5 分钟后 并在5分钟后输出1低电平以停止光刺激。
      13. 重复上述步骤，以设置另一次灯光关闭和灯光开启的试验。
      14. 前往 结构 | 子规则参考 并检查该参考文献是否属于正确的子规则。
      15. 选择 起始条件 作为 立即进行 和 终止条件 作为 每个起始条件执行一次. 使用 好的.
      16. 将参考框放置在主规则的作用框1与条件框2之间，并从其引出一条线 动作 - 开始追踪 到 参考文献.
        注意：现在主规则在启动轨道后直接开始子规则。
    6. 定义检测设置，以告知系统需要跟踪的内容。
      1. 前往 检测设置 并选择 检测设置 1.
      2. 将测试小鼠放入实验区域并选择 自动化设置.
      3. 选择 啮齿类动物 动物类型选择小鼠，并使用鼠标在实验区域内围绕小鼠绘制一个方框。确认 结果正常？ 问题与 是.
    7. 为所有需要监测的实验动物定义试验列表。
      1. 前往 试验列表 并计划今天记录所有动物：选择 添加试验 并选择一个数字。
      2. 选择之前为每只小鼠定义的所有条件。
      3. 命名 动物编号识别 以及 治疗 正确操作以便后续简化分析。
        注意：动物编号对系统本身无关紧要，仅对实验者后续的数据分析具有意义。处理组与对照组的分组信息对系统至关重要，以便在后续分析步骤中明确如何对轨迹进行分组和比较。
    8. 前往 采集 并开始实验。

4. 开放旷场实验（焦虑）

  1. 在实验开始前，将实验小鼠带入行为学实验房间，以确保其具有适当水平的焦虑状态。
    注意：行为学实验应在小鼠清醒的黑暗期进行，并且每次实验都应在相同的时间段内完成，以保证结果的可比性。
  2. 通过轻轻将小鼠连同套管一起按压在笼子的网格上，将其与光源连接。
  3. 将小鼠放入装有新鲜垫料的等待笼中，适应光照光纤10分钟。
  4. 在视频追踪软件（例如 Ethovision XT）中点击 开始 按钮，启动数据采集。
  5. 将小鼠从等待笼转移至旷场的左上角。在2秒内迅速撤回手臂，以避免软件追踪到手臂而非小鼠。
  6. 实验过程中离开小鼠的视野范围，并保持安静。
  7. 20分钟后实验结束，将小鼠从迷宫中取出，断开光照光纤连接，并将其放回饲养笼中。
  8. 将小鼠送回动物饲养设施。

5. 巴恩斯迷宫（学习）

  1. 在实验开始前约1小时，将所有实验小鼠带入行为学实验房间。
  2. 准备巴恩斯迷宫，除放置逃生箱的一个孔外，其余孔均关闭。在平台中央放置一个纸板墙，作为小鼠的起始区域。
  3. 将一只小鼠通过光缆套管连接至光源，两端分别连接两个植入物。
  4. 将小鼠直接放入巴恩斯迷宫中央的纸板墙内，该纸板墙可防止小鼠在实验开始前四处跑动。
  5. 在视频追踪软件（例如 Ethovision XT）中点击开始，然后移除纸板墙。
    注意：软件将持续追踪小鼠直至其到达正确孔洞，但需准备手动终止试验，以防软件未能识别小鼠进入孔洞的动作。
  6. 将小鼠从迷宫中取出，并断开其与光缆的连接。
    注意：若当天为训练日，每只小鼠需进行多次试验，则在下一次训练开始前将小鼠留在行为学房间旁的等候室中；若当天为测试日，每只小鼠仅进行一次测试试验，则将小鼠送回饲养设施。

6. 数据分析（以开放旷场实验中4个可区分的试验为例）

  1. 视频追踪软件（例如，Ethovision XT）
    1. 在数据配置文件中定义实验组和试验。
      1. 在左侧进入数据配置文件，选择处理组 vs. 对照组。
      2. 在新窗口的左中部进入嵌套，选择试验控制状态。
      3. 选择从元素操作：开始追踪到元素操作：灯亮1之间的状态区间。
      4. 将嵌套框放置在处理滤波框与相应结果框之间。
        注：此定义的区间为 Off1，表示实验前 2.5 分钟无光刺激的阶段。
      5. 对区间 On1（从元素操作：灯亮1到元素操作：灯灭1）、Off2（从元素操作：灯灭1到元素灯亮2）和 On2（从元素操作：灯亮2到元素操作：停止追踪）重复上述步骤。
      6. 对对照滤波组重复上述 4 个区间设置。
        注：每个嵌套框都需要一个独立的结果框，名称分别为 Off1、On1、Off2、On2。此时，处理组和对照组均被划分为 4 个不同的光刺激试验，并分别进行分析。
    2. 在分析配置文件中定义待分析的参数。
      1. 在左侧进入分析配置文件，选择区域内的行为。
      2. 选择因变量在区域内，并选择区域为中心区。
      3. 双击在中心区，选择任意选定的点，并仅保留在中心区选项。
      4. 在退出窗口前，进入试验统计，选择频率、累积持续时间和首次进入潜伏期。
      5. 添加因变量移动距离。
        注：在组统计中，选择使用标准误差或标准差作为误差表示。通过此配置文件，可获得在中心区停留时间、进入中心区次数和总移动距离的数据。
    3. 提取数据
      1. 进入结果，选择统计与图表。
      2. 点击计算以查看分析后的数据。
        注：试验统计提供每只小鼠的详细信息，组统计则分析两组的均值与误差，并按 4 个试验分别生成对应的柱状图。
      3. 点击导出数据，选择试验统计数据及保存位置。
        注：导出的数据以 Excel 文件格式保存，包含每只小鼠的个体数值。在该 Excel 文件中，动物编号（Animal-ID）可用于识别小鼠。
      4. 进入热图可视化，点击绘制热图。
      5. 在右侧选择试验，以查看每只小鼠和每个试验的独立热图。
      6. 右键单击小鼠图像，将热图导出为图片。
  2. 绘图
    1. 在计算机上打开电子表格文件，计算每种测量条件和每组在全部 4 个试验中的均值和标准误差（SEM）。
    2. 在统计软件中生成图表（例如，Sigma Plot）。
      1. 将电子表格文件中的均值和 SEM 按正确顺序复制到 Sigma Plot 中。行应包含 Off1、On1 等数据，列的标题应为试验、均值和 SEM。
      2. 选中全部三列，进入创建图表。
      3. 选择柱状图选项，选择带误差的未分组柱状图（上排第三格）。
      4. 点击完成以打开新的图表页面。
      5. 为整个图表添加标签，然后进入主页，在左侧选择图表框并点击导出。选择目标文件夹，并将格式设为MetaFile (*.wmf)。
        注：.wmf 格式可在 CorelDraw 等图形软件中进一步处理。
    3. 对获得的数据进行统计分析。
      1. 将电子表格中的原始数据（Off1、On1 等）复制到 Sigma Plot 的单独列中。
      2. 标记需要比较的列，进入分析，选择t 检验，然后点击运行。
      3. 确认数据格式为原始数据，点击下一步，然后点击完成以执行检验。

结果

本实验方案的目的是在光遗传学实验中测量基因改造小鼠行为的变化。通过注射腺相关病毒载体进行光遗传学操控。通过在目标脑区上方植入光纤，可在自由活动的小鼠中实现光刺激。

在图4中展示了光遗传学实验的结果。通过ChR2对mPFC的IL区域中兴奋性锥体神经元进行强烈激活，导致小鼠在敞箱实验中焦虑相关行为增加。在Nex-Cre小鼠的mPFC的IL区域注射ChR2，以实现其在锥体神经元中的表达（图4A）。在两项焦虑行为测试——敞箱实验（图4B,C）和新奇抑制摄食实验（图4F,G）中，使用蓝光刺激ChR2以激活锥体神经元。作为对照，另一组小鼠在相同脑区注射荧光蛋白tdTomato代替ChR2（图4D,G）。在此类实验中，焦虑行为定义为对较明亮中央区域的回避。小鼠天生会回避开阔区域，因其对捕食者存在焦虑。

在开放旷场实验中（如图4B所示），小鼠共进行了4次试验，每次持续5分钟。在第1次和第3次试验中未施加光刺激（Off1,2），而在第2次和第4次试验中施加了蓝光刺激，频率为20 Hz（光脉冲时长5 ms），光强为1 mW（On1,2）。热图显示，在实验组中，中心区域停留时间在关光和开光试验之间存在差异。在光刺激期间，小鼠更倾向于停留在边缘区域。对照组动物也偏好边缘区域，但在光刺激下其行为未发生改变。在图4C中展示了实验组在开放旷场实验期间的主要行为学指标。若数据通过Shapiro-Wilk正态性检验，则采用独立双尾t检验进行统计分析；若未通过正态性检验，则采用非参数的Mann-Whitney秩和检验作为替代方法。对于此类实验，采用组内比较策略，以探究光刺激是否能够直接随时间改变焦虑相关行为，而不受实验组与对照组基线焦虑水平差异的影响。结果显示，在两次光刺激试验中，中心区域停留时间均显著减少，表明焦虑水平升高；总移动距离未发生改变，说明运动行为未受影响；进入中心区域的次数有所增加，但未达到统计学显著性。在图4D中展示了对照组的数据。对照组动物在关光与开光试验之间各项分析参数均未表现出任何行为学变化，表明光刺激或植入操作本身并未引起所观察到的行为效应。综上所述，该实验表明通过ChR2激活内侧前额叶皮层（IL）锥体神经元时，光刺激可导致焦虑水平升高。

在图5中展示了在高架十字迷宫（Elevated-Plus Maze）中一次不成功的光遗传学实验数据。在高架十字迷宫实验中（见图5A），小鼠共完成了6次试验，每次持续3分钟。在第1、3和5次试验中未进行光刺激（Off1、Off2、Off3），而在第2、4和6次试验中进行了蓝光刺激，频率为20 Hz（光脉冲时长5 ms），强度为1 mW（On1、On2、On3）。在这些示例性结果中，光遗传学实验方案的持续时间以及迷宫本身的结构并不适用于该转基因小鼠品系。在图5B中可见，多只小鼠在实验过程中后肢滑出迷宫边缘，甚至跌落。一旦发生跌落，小鼠将在次日获得一次重新进行高架十字迷宫实验的机会；若再次跌落，则该小鼠将被排除在分析之外。若小鼠多次滑出但最终仍能留在迷宫上完成实验，则其数据将正常纳入分析。然而，此类数据必须谨慎解读，对照组动物的作用因此显得尤为重要。Nex-Cre小鼠在狭窄的开放臂上表现出运动困难，难以维持平衡。为避免此类情况，可在迷宫臂边缘设置高度为1 cm的小型侧壁，以帮助小鼠后肢在迷宫臂上获得更稳固的支撑。热图和图表均显示，实验组和对照组小鼠从第2次试验（On1）开始即表现出对开放臂的回避行为（图5C-E）。两组小鼠在开放臂上的停留时间均显著减少，进入开放臂的次数也显著下降。若仅分析实验组数据，结果将提示光刺激具有显著的促焦虑效应，因为在On1试验期间，小鼠在开放臂上的停留时间及进入次数均显著降低。然而，当与表现出相同行为模式的对照组进行比较时，可以明确观察到的行为并非由光遗传学刺激介导，而是由于小鼠对迷宫环境的习惯化，普遍回避开放臂所致。该结果强调了设置适当对照组的重要性，以区分由光遗传学刺激引起的行为效应与可能的行为适应。同时，该数据也突显了根据特定小鼠品系和具体科学问题，合理优化实验设计的必要性。

为验证并加强所收集的行为学数据，在最后一次实验后取出小鼠脑组织，以确认注射和植入位置的准确性图6）。脑组织用4%多聚甲醛固定后从颅骨中取出，置于30%蔗糖溶液中脱水1-2天，随后进行冷冻切片。 40 µm 厚的冠状脑切片经洗涤后，使用含DAPI的封片剂封固于SuperFrost载玻片上，DAPI可对细胞核进行染色，从而实现冠状切片中目标区域的识别。YFP标签或tdTomato自身的荧光信号可指示病毒注射部位的位置。在 图 6B 左侧为ChR2-YFP的示例注射位点（黄色），右侧为tdTomato的示例注射位点（红色）。借助源自Paxinos和Franklin的模板45 小鼠脑图谱中，可以识别出IL区域。在两张切片中，光遗传学工具均在IL区域表达，但在邻近的脑区也有表达。为准确解读结果，需参考蓝光在脑组织中的扩散情况8 (图1D，E）。可以看出，蓝光到达IL下方的DP区域时，其光强仅剩光纤尖端初始1 mW光强的不到5%（蓝线） 图1D)8此外，由于背向散射，少量光线可能向上进入PrL区域47因此可以说，IL 区域受到的光照最强，但邻近的 DP 和 PrL 区域也可能受到轻微刺激。因此，无法确保仅对 IL 细胞进行特异性刺激，应通过免疫组织化学分析检测邻近区域，以确定 PrL 和 DP 细胞的活动是否受到光照调节。在 图6C另一个重要的对照显示了Nex-Cre小鼠品系的特异性。通过对IL区域内的两种细胞类型——谷氨酸能主神经元和GABA能中间神经元——进行抗体染色，可以看出ChR2-YFP的表达仅出现在谷氨酸能神经元中，而不在GABA能神经元中。

总之，我们的实验表明，在行为测试期间通过光遗传学操控，可以观察到焦虑相关行为的变化。通过使用多种测试方法评估同一行为，能够得出可靠的结论。此外，免疫组织化学分析进一步证实了所获得的数据。我们的实验提示，在特定检测中，下边缘皮层锥体神经元的特异性激活会增加焦虑相关行为。

小鼠脑部注射、行为分析图和活动热图的光遗传学实验示意图。
图 4：IL 锥体神经元的光遗传学激活增加焦虑样行为。 实验中的光刺激参数：473 nm，1 mW，20 Hz 刺激。 A) 将 ChR2-YFP 或 tdTomato 注射并植入 IL 区域的示意图。在实验过程中，通过 ChR2 激活 mPFC 的 IL 区域中的锥体神经元。冠状脑切片图改编自 Paxinos 和 Franklin 小鼠脑图谱，冠状面：外侧 o,6。 B) 开放旷场迷宫实验中的光刺激方案（20 分钟，4 次 5 分钟交替的“关”和“开”试验；左侧），以及实验中代表性 ChR2 注射小鼠（EXP）和 tdTomato 注射小鼠（CT）的热图（右侧）。在蓝光激光刺激下，EXP 动物在开放旷场中心区域停留的时间更短。对于 CT 动物，中心区域停留时间在光“关”和“开”试验之间无差异。 C) EXP 动物在开放旷场中的群体数据，n=11。在蓝光刺激下，小鼠在开放旷场中心停留的时间显著减少（关1：39.49±6.9 秒，开1：19.87±4.47 秒，关2：28.13±8.55 秒，开2：23.42±9.32 秒；关1:开1，t 检验，p = 0.033，*；关1:开2，MWRS，p=0.049，*）。移动距离未受影响（关1：2703.09±292.65 cm，开1：3113.4±491.15 cm，关2：3331.86±482.62 cm，开2：3082.17±658.61 cm）。进入中心区域的次数随时间减少，但无显著差异（关1：22.36±3.78，开1：18.45±3.95，关2：17.36±1.99，开2：13.27±2.64）。 D) CT 动物在开放旷场中的群体数据，n=15。小鼠在开放旷场中心停留的时间、移动距离、进入中心区域的次数在光“开”和“关”试验之间均无变化（中心时间：关1：16.73±2.65 秒，开1：16.02±1.89 秒，关2：12.02±1.76 秒，开2：13.04±2.58 秒；移动距离：关1：3399.69±296.77 cm，开1：3210.6±446.9 cm，关2：3030.28±513.83 cm，开2：2955±617.7 cm；进入中心次数：关1：14.2±1.98，开1：13.6±2.02，关2：10.8±1.88，开2：11.67±2.5）。CT 小鼠表现出显著更高的基线焦虑水平（关1 EXP:CT，MWRS，p=0.005，**）。数据以均值±标准误表示。* 表示显著差异（p≤0.05），** 表示显著差异（p≤0.01）。t 检验均为双尾检验，MWRS：Mann-Whitney 秩和检验；IL：下边缘皮层；BLA：基底外侧杏仁核；DRN：背缝核；OF：开放旷场；CT：对照动物；EXP：实验动物；L：光。本图改编自 Berg 等 2019，PLoS One43 及 Berg 201948。 请点击此处查看本图的放大版本。

高架十字迷宫示意图及图表显示行为分析、滑落比例、动物运动轨迹。
图 5：EPM 实验未能显示 Nex-Cre 小鼠的行为效应。实验期间的光刺激参数：473 nm，1 mW，20 Hz 刺激。 A) 高架十字迷宫实验中的光刺激方案（18 分钟，6 次 3 分钟周期，交替进行“关闭”和“开启”试验）。 B) 包含“滑落”小鼠的群体数据，总计 n=23。Nex-Cre 小鼠倾向于在开放臂上用后肢滑落，且与实验分组无关（左图）。后续分析仅纳入在全部 6 次试验中均未从迷宫滑落的小鼠。在第一个“关闭”阶段（Off1）发生滑落的小鼠，后续更倾向于回避开放臂（Off1 实验组 1.63±0.6，对照组 2.2±0.79；Off2+3 实验组 0.125±0.125，对照组 0±0；On1+2+3 实验组 0.625±0.26，对照组 0.1±0.1）。右侧饼图显示，在 18 分钟实验期间有 42.42% 的小鼠从迷宫滑落，仅有 57.57% 完成了全部实验。 C) 实验组（EXP）和对照组（CT）代表性小鼠在全部 6 次试验中的热图。两组均在 Off1 试验后表现出开放臂停留时间减少。 D) EPM 实验中实验组（EXP）小鼠的群体数据，n=12。在开放臂停留的时间在前两次试验中显著下降，之后保持较低水平（Off1 73.91±12.22 s，On1 36.15±14.65 s，Off2 15.61±6.23 s，On2 19.49±7.51 s，Off3 9.36±4.44 s，On3 7.96±3.47 s。Off1 与 On1 比较，t 检验，p=0.041，*）。移动距离未受影响（Off1 679.96±71.63 cm，On1 712.24±112.82 cm，Off2 717.49±97.39 cm，On2 782.51±81.11 cm，Off3 722.11±68.60 cm，On3 663.90±106.57 cm）。进入开放臂的次数从 Off1 到 On1 显著减少，之后保持稳定（Off1 8.08±1.08，On1 3.33±0.76，Off2 2.16±0.69，On2 2.91±1.09，Off3 1.73±0.75，On3 1.73±0.66。Off1 与 On1 比较，t 检验，p=0.002，**）。在 EPM 中心区域停留的时间随试验进程逐渐减少，但在“关闭”与“开启”试验之间无显著差异（Off1 41.71±5.34 s，On1 31.2±4.59 s，Off2 19.8±3.44 s，On2 24.49±3.38 s，Off3 20.37±4.77 s，On3 18.85±4.07 s）。 E) EPM 实验中对照组（CT）小鼠的群体数据，n=11。对照组数据与实验组数据表现出相同的显著下降趋势，表明该实验未能成功实现预期效果（开放臂停留时间：Off1 86.92±12.74 s，On1 33.78±14.38 s，Off2 18.01±11.61 s，On2 16.41±9.61 s，Off3 11.36±4.01 s，On3 5.43±2.07 s。Off1 与 On1 比较，MWRS 检验，p=0.009，**；移动距离：Off1 705.11±88.36 cm，On1 789.45±77.53 cm，Off2 724.74±80.49 cm，On2 676.57±111.99 cm，Off3 716.99±132.47 cm，On3 663.03±132.46 cm；开放臂进入次数：Off1 7.09±1，On1 3.72±1.17，Off2 1.45±0.47，On2 1.36±0.58，Off3 0.91±0.43，On3 1.64±0.59。Off1 与 On1 比较，MWRS 检验，p=0.01，*；中心区域停留时间：Off1 35.89 s，On1 29.25±3.96 s，Off2 22.17±3.58 s，On2 15.9±2.57 s，Off3 13.86±4.2 s，On3 16.89±5.75 s）。数值以均值 ± 标准误（S.E.M.）表示。* 表示显著差异（p≤0.05），** 表示极显著差异（p≤0.01）。t 检验均为双尾检验，MWRS：Mann-Whitney 秩和检验；EPM：高架十字迷宫；CT：对照动物；EXP：实验动物；OA：开放臂。本图改编自 Berg 等 2019，PLoS One43 及 Berg 201948。 请点击此处查看本图的放大版本。

小鼠脑图谱与显微镜图像；DAPI染色；PrL、IL、DP区域；神经成像分析。
图6：IL区ChR2与tdTomato的注射侧及Nex-Cre小鼠的特异性。A） 在冠状脑切片上（前囟点AP +1.66 mm，内侧-外侧mL 0.3 mm，背侧-腹侧DV -1.8 mm）单侧注射与植入位点的示意图（改编自小鼠脑图谱Paxinos和Franklin，前囟点Bregma +1.54 mm）。B） Nex-Cre小鼠中ChR2-YFP（左侧，黄色）和tdTomato（右侧，红色）的典型注射位点，与DAPI染色的细胞核（蓝色）合并显示。比例尺：1 mm。插图为IL区域的高倍放大图像，比例尺：150 µm。白色方框指示插图位置。C） 上排：Nex-Cre小鼠左侧IL区域的共聚焦图像，使用CamKII作为谷氨酸能神经元标记物（蓝色），以及ChR2-YFP（黄色）或Gad67作为GABA能神经元标记物（绿色）。下排：ChR2-YFP（黄色）与CamKII（左侧，蓝色）共定位，但不与Gad67（右侧，绿色）共定位，表明Nex-Cre小鼠对谷氨酸能神经元具有特异性。比例尺：50 µm。PrL：前边缘皮层；IL：下边缘皮层；DP：背侧束旁皮层。本图改编自Berg等2019年发表于PLoS One43，以及Berg 201948。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

利用光来操控神经元信号传导近十年来一直是首选方法。自2005年以来，关于新型光遗传学工具开发4,6,8,14,49,50,51以及应用这些工具研究脑环路的研究论文数量显著增加21,23,40,43,52。一方面，由于可注射光遗传学工具、植入方式、转基因小鼠品系和行为学实验的种类极为丰富，实验的可能性多种多样且几乎不受限制；另一方面，选择实验条件时出错的可能性也很高，且实验具有高度特异性，往往难以与其他研究进行比较。

关键步骤
本方案中一个重要的关键步骤是充分的规划。光遗传学工具的选择应与科学问题相匹配。是否仅需操控神经元或突触的整体活性？在这种情况下，商业化的工具如 ChR221,25,27 和 Arch37 是较好的选择。然而，如果需要操控特定的神经递质系统，甚至单个受体，则通常构建个体化受体嵌合体是更优的选择3,6。目前已有一些基于 GPCR 的受体嵌合体，即所谓的 Opto-XRs，以及构建这些嵌合体的指导方案可供使用4,50。除了光遗传学工具的选择外，小鼠品系与行为学实验的组合也至关重要。不同的背景品系，例如 C57Bl/6 和 BALB/cByJ，在某些方面表现出不同的行为表型53,54。C57Bl/6 小鼠的基础焦虑水平较低，适用于进行促焦虑性操控；而 BALB/cByJ 小鼠则表现出较高的焦虑水平，因此对具有抗焦虑作用的药物更为敏感。此外，这些背景品系的转基因变体在表型上也可能存在差异48。通过将特异性启动子与光遗传学工具及转基因小鼠品系进行合理组合，几乎可以靶向任意期望的细胞群体。

手术过程中的一个关键步骤是准确定位目标区域。借助小鼠脑图谱，可以确定结构在前后轴、内外侧轴以及深度上的正确坐标45。实际上，每只小鼠的颅骨在形态和大小上都略有差异。因此，在立体定位手术中，调整立体定位坐标的F因子46至关重要，同时必须正确固定鼻部和耳部。如果小鼠头部发生倾斜，注射套管将无法准确到达目标区域。

此外，注射套管的直径也非常关键。如果直径过小，则病毒无法释放到组织中；如果直径过大，则套管在到达目标区域的过程中会泄漏病毒溶液。如果植入的光纤末端正好位于目标区域上方，则皮层上方区域的病毒表达无关紧要。但如果植入位置位于其他区域之上以刺激轴突末梢，则上层皮层区域的轴突也会被光激活，从而干扰实验数据的准确性。例如：内侧前额叶皮层的下边缘区（IL）和前边缘区（PrL）均投射至基底外侧杏仁核55,56，但在焦虑调节中具有完全不同的功能和作用26,57。如果将植入物置于杏仁核上方以激活来自IL区的轴突末梢，而在注射过程中由于使用了不合适的注射套管，导致病毒溶液也进入了PrL区，则极有可能同时激活来自PrL区的轴突末梢，造成实验结果的混淆。

在准备颅骨以固定植入物时，少量使用底漆和粘合剂对于实现可靠且持久的固定至关重要。如果双组分粘合系统未薄层涂抹，牙科水泥可能在数天或数周后从颅骨上脱落。此外，在固定植入物前，颅骨必须完全干燥，否则水泥将无法与颅骨牢固结合。

本实验方案的行为学部分也存在一些关键步骤。首先，迷宫的构建非常关键。在各种行为学实验设置中，关于迷宫的尺寸、形状以及具体操作流程，文献中均存在多种不同的方案58,59,60。选择一种能够确保数据具有可比性和可重复性的方案至关重要。此外，还需考虑所使用小鼠品系的特殊要求43,48。从高架十字迷宫（EPM）的代表性数据可以看出，若干Nex-Cre小鼠在实验过程中曾从迷宫上跌落或多次滑脱（图2b）。对于这类小鼠，采用在开放臂周围加设低矮侧壁的迷宫设计将是更合适的选择。

其次，必须保持所有外部环境条件恒定61，否则不同组的小鼠将完全无法进行比较。在这方面，应选择实验装置空闲且实验人员始终在场的时间段进行实验，这一点非常重要。此外，还需考虑建筑物内的各种事件，例如施工、任何系统测试（如火灾报警系统）或小鼠设施的清洁日，以避免对所获得的数据造成干扰。

最后，动物的处理和饲养条件对行为学实验至关重要。当进行植入手术后，小鼠需要单笼饲养，以避免其他小鼠造成伤害。为了确保组间良好的可比性以及组内较低的误差，每只小鼠都必须拥有相同大小的笼具和相同的环境丰富化设施。在与焦虑相关的行为实验中，单笼饲养具有一些优势，因为单笼饲养的雄性小鼠表现出更低的基础焦虑水平、更小的焦虑水平变异以及更少的类抑郁症状15,16。而群养的雄性小鼠由于个体间的等级关系，其焦虑水平可能存在显著差异。除了饲养方式外，对所有小鼠及各组进行恒定且一致的处理同样重要。抓取小鼠以连接植入物上的光纤过程具有高度应激性，因此该操作必须对每只小鼠保持一致，即采用相同的技术和由同一名实验人员完成。此外，用于缓解小鼠在连接操作后应激状态的等待笼中的适应时间，也必须在持续时间、垫料和相对于迷宫的位置等方面保持一致。在动物设施内的日常操作也对后续行为表现具有重要影响。实验组与对照组动物不应在不同日期或由不同人员进行清洁，因为这同样会对小鼠造成应激。此外，清洁日不应与实验日重合，以避免行为结果的差异。

故障排除
在实验过程中可能会出现若干问题。例如，在立体定位手术期间对颅骨钻孔可能会损伤血管。通常会出现明显出血，尤其是在前囟和后囟上方区域。如果发生这种情况，切勿使用棉签止血，因为棉签的吸水性可能导致血管出血进一步加剧；相反，应直接用氯化钠溶液冲洗。

也可能出现病毒溶液压力注射无法正常工作的情况。此时，可能是封口膜、颅骨钻孔处的结痂或脑组织堵塞了套管的尖端。在这种情况下，应缓慢将套管从脑组织中退出，且不改变X轴或Y轴位置，然后使用镊子去除套管尖端前端1-2 mm的部分。在重新插入套管之前，应通过施加少量压力测试其是否通畅，观察病毒溶液是否能从套管尖端流出。为避免堵塞，应以恒定速度下放套管，并在到达注射位点最深位置之前不要停止移动。如果去除的套管尖端过多导致直径过大，套管将损伤组织，并增加病毒一次性全部注入的风险。因此，务必仅小心去除被堵塞的部分尖端。

在行为学实验过程中，视频追踪软件（例如 Ethovision XT）中的实验设置可能会出现问题。例如，如果光输出无法正常工作，可能由多种原因导致。必须在打开 Ethovision XT 之前先启动 Pulser 程序，并对其进行编程和运行。在“实验设置”（步骤 3.2.2.4）中必须正确选择硬件。如果选择了错误的 IO-Box，或未选择“Custom Hardware”（自定义硬件），则 Ethovision 无法控制 Pulser 设备。如果光输出测试成功，但在数据采集过程中“试验控制设置”中编程的光刺激方案无法执行，则可能是子规则或子规则引用位置不正确，或条件与动作设置不明确。例如：该引用是否属于正确的子规则？引用是否正确编程（例如，子规则执行的次数是否设置正确）？

此外，可能会出现这种情况：在“检测设置”期间动物被正常追踪，但在数据采集期间却存在某些样本无法识别受试对象。此时，应检查实验室内照明是否发生变化，或是否有物体在迷宫内产生不必要的阴影。迷宫底部整体必须保持同一颜色，因为该设置仅适用于特定的单一组合。如果由于某些原因无法避免不同的底部颜色或阴影，则应在迷宫最暗的区域定义检测设置。

在首次获取动物数据后，若需更改任何设置，切勿在已使用的设置中直接应用这些更改，而应先复制设置后再进行调整。这意味着此前已记录的试验数据将不再适用于后续数据分析。在此情况下，应使用原始设置完成该实验组所有动物的记录，然后创建一个新的实验，用于分析已录制的视频，而非进行实时追踪。在这一“基于视频”的实验中，可使用多种设置进行分析，而不会影响动物之间甚至数据之间的可比性。

局限性与未来应用
这种在自由活动动物中利用光遗传学操控行为的方法也存在一定的局限性。在手术过程中，两个植入物之间的距离受到限制。对于双侧植入，两个植入物之间的最小距离必须不小于用于固定植入物的装置宽度。这是因为在第一个植入物已经固定的情况下，装置需要将第二个植入物置入颅骨钻孔中。一种可能的解决方案是采用斜向植入，使玻璃光纤的尖端非常接近，而颅骨上方的陶瓷套管则保持较大的间距23,55,56,57,62,63。然而，斜向植入的一个缺点是光的扩散。当光纤尖端倾斜而非垂直植入时，所刺激的脑区会发生改变。因此，在两个目标区域彼此靠近的情况下，必须考虑光刺激位置的变化。

在行为学实验过程中，迷宫的构建可能会干扰连接到动物身上的光纤电缆。一些行为学测试，例如明暗箱实验，包含一个室内区域64,65，而其他类型的迷宫则包含小鼠需要进入的隔间。这类实验无法使用本实验装置进行。替代方案可能是采用无线系统22,26,66。但幸运的是，某些迷宫（例如巴恩斯迷宫）可以进行适当布置，使小鼠能够进入相关隔间67。

除了具有封闭区域的迷宫外，过宽的迷宫也可能导致问题。迷宫面积越大，为使动物能够到达迷宫中每个位置所需的电缆就越长。必须注意防止动物踩踏电缆或抓住并啃咬电缆。一种可能的解决方案是设计一个可卷收多余电缆的装置。但其缺点是，电缆展开时的阻力对小鼠而言过大，因此该方案更适用于大鼠。另一种可能的选择是在实验前而非实验过程中进行光刺激，当然，这仅在光刺激可产生长期效应的情况下才可行23。

与现有/替代方法的比较
替代方法包括在行为过程中进行化学或电刺激8,18。化学激动剂或拮抗剂可通过特异性受体激活或抑制神经元，并且还可调控单一神经递质系统38,68。一方面，化学物质的受体特异性较高，因为特异性激动剂或拮抗剂仅激活特定受体39；另一方面，对于同一神经递质类别的受体亚型，其特异性往往不足。大多数化学物质会以不同概率结合至少两种受体亚型69。此外，只要神经元具有相同的受体类型，化学方法便无法区分不同的神经元细胞类型。除此之外，与光遗传学相比，化学操控在时间和空间分辨率上均较差。激动剂或拮抗剂通常通过口服35或全身注射57,70给药。如果将化学物质直接注入脑组织，其效应比口服给药更快，但仍比光刺激慢。由于所给予的化学物质会在脑内扩散，并且对神经元类型或脑区不具特异性，因此无法实现对特定脑环路的精确操控。

电刺激的时间分辨率高于化学刺激9,14。电刺激在神经组织中的扩散范围小于化学刺激，且空间分辨率优于化学刺激。然而，电刺激无法特异性地作用于不同类型的神经元或受体类型，因为电极附近的每一个神经元都会对电刺激产生反应。

研究自由活动小鼠行为的替代方法包括脑切片中的电生理记录，在该方法中可通过光遗传学调控单个神经元或轴突，并利用记录电极测量所引发的效应6,71。体外实验能够探究光遗传刺激的分子与细胞基础，但其局限性在于缺乏固有的神经连接以及其他脑区的输入。另一种选择是将光遗传学与多光子成像结合使用1,72。在此情况下，小鼠头部被固定，可处于麻醉状态或清醒状态下完成简单任务。

要成功开展光遗传学实验，目前可使用的工具和应用非常广泛。选择合适的光遗传学工具和行为学实验装置，对于回答特定的研究问题至关重要。若选择了正确的工具组合与实验方案，光遗传学能够以前所未有的时间与空间分辨率，深入探究神经环路，从而有助于理解精神类疾病和认知功能，并推动新型治疗策略的开发。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

衷心感谢德国哥廷根马克斯·普朗克实验医学研究所的Klaus-Armin Narve教授和Sandra Goebbels博士慷慨提供Nex-Cre小鼠。同时，我们感谢视频团队成员Yunus Dikici和Ruben Wiesner为本文的JoVE视频进行拍摄和后期处理。此外，衷心感谢Kristin Claussen为视频提供配音，以及Kimberly Anne Go对稿件的校对工作。

所展示的结果在波鸿鲁尔大学获得，视频在不来梅大学录制。

本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）资助——项目编号 122679504 — SFB 874 以及 DFG MA 4692/3-2。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯胺酮Sigma-AldrichK2753-64麻醉剂
20% 葡萄糖AlleMan Pharma皮下注射以快速恢复
行为迷宫定制测量焦虑行为
贝潘廷Bayer眼科软膏
贝塔碘伏Monodipharma含碘消毒剂
贝塔碘伏Monodipharma碘软膏
双目显微镜OlympusSZ52, 110AL0.62x WD160手术使用
陶瓷套管ThorlabsCFLC230-10植入物
陶瓷光纤刻划笔ThorlabsCSW12.5切割玻璃光纤
通道视紫红质2-YFP病毒Penn Vector CoreAddgene 20298光遗传学工具
压缩空气Kontakt ChemieDruckluft 67干燥颅骨
坐标系统Stoelting手术用立体定位坐标
Correl Draw图形软件版本13
冷冻切片机MICROMHM500OM制备用于染色的脑切片
Ethovision XT 14Noldus行为追踪软件
Excel统计软件
套管抛光夹具ThorlabsD50-F抛光植入物圆面
双头光纤跳线PrizmatixOptogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm用于连接双侧植入物的电缆
单头光纤跳线PrizmatixOptogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm通过套管连接植入物的电缆
光纤剥除工具ThorlabsT06S13剥离用于植入的玻璃光纤
滤纸VWR European516-0300裁剪成小片用于新奇抑制摄食实验
食物颗粒Mühle LeversHöveler Nagerfutter小鼠营养饲料
玻璃移液管Harvard ApparatusGC150-10注射移液管
Gradia direct-FloHenry Schein103322流动型牙科水泥
加热灯efbe-Schott/PhillipsR95E防止小鼠术后体温过低
加热板Stoelting集成于坐标系统中
注射套管Braun100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20用于所有注射及颅骨钻孔
垫料T 1350新奇抑制摄食实验中的接地材料
小鼠笼具Zoonlab405 cm^2实验用单只饲养
Optibond FLKerr26684E植入前颅骨处理
光学玻璃光纤ThorlabsFT200EMT用于植入的导光光纤
Optogenetics-LED.STSIPrizmatix行为实验中光刺激用光遗传学工具箱
多聚甲醛Sigma-Aldrich16005-1KG-R灌流小鼠以取出脑组织
粒径0.02 µm抛光片ThorlabsLFCF抛光植入物圆面
粒径1 µm抛光片ThorlabsLF1D抛光植入物圆面
粒径30 µm抛光片ThorlabsLF30D抛光植入物圆面
粒径6 µm抛光片ThorlabsLF6D抛光植入物圆面
脉冲控制软件Prizmatix光刺激设备控制软件
Rimadyl-卡洛芬Zoetis镇痛剂
Sigma Plot统计分析软件
套管ThorlabsFT200EMT连接植入物与光缆
氯化钠 (NaCl)Braun3570410冲洗颅骨
超级胶水Pattex Henkel将玻璃光纤固定于套管内
td-Tomato病毒Penn Vector CoreAddgene 51503光遗传学工具
紫外光KoQGHJ无线, 1200 mW/cm^2牙科水泥聚合用光源
Xylavet-赛拉嗪cp pharma麻醉剂

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