方法文章

测量在C.elegan的RAN肽毒性

DOI：

10.3791/61024

⸱

2020年4月30日

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

本文内容

摘要

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重复相关非ATG相关转化产品是几种重复扩张性疾病的病原特征。所述协议的目的是使用模型系统C.elegans的行为和细胞测定来评估这些肽引起的毒性。

摘要

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C. elegans通常用于模拟由重复扩张突变引起的与年龄相关的神经退行性疾病，如肌萎缩性侧索硬化症 （ALS） 和亨廷顿舞蹈症。最近，含有重复膨胀的RNA被证明是一种新型蛋白质翻译的基质，称为重复相关非AUG依赖性（RAN）翻译。与规范翻译不同，RAN 翻译不需要启动协和，并且仅在重复超过阈值长度时发生。由于没有开始协理来确定读取帧，RAN 翻译出现在包含重复扩展序列的感知和反感觉 RNA 模板的所有读取帧中。因此，RAN 翻译将可能的疾病相关有毒肽的数量从 1 扩展到 6。到目前为止，RAN翻译已经记录在八种不同的重复扩张为基础的神经退行性疾病和神经肌肉疾病。在每种情况下，破译哪些RAN产品是有毒的，以及它们的毒性机制，是了解这些肽如何促进疾病病理生理学的关键步骤。本文提出了在模型系统C.elegans中测量RAN肽毒性的策略。首先，我们描述了测量RAN肽毒性的程序，对发育的C.elegans的生长和活力。其次，我们详细介绍了一种用于测量RAN肽在运动性上发育后、年龄依赖作用的测定方法。最后，我们描述了一种神经毒性测定，用于评估RAN肽对神经元形态的影响。这些测定提供了RAN肽毒性的广泛评估，可用于执行大规模遗传或小分子屏幕，以确定疾病机制或疗法。

引言

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DNA重复序列的不当扩展是几种神经退行性疾病的遗传基础，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、前额痴呆症（FTD）和亨廷顿舞蹈症（HD）1。虽然这些疾病已建立细胞和动物模型，但这些条件背后的机制没有明确界定。例如，HD 是由亨廷顿蛋白 Htt2的编码序列中 CAG 重复序列的扩展引起的。由于CAG编码氨基酸谷氨酰胺，CAG重复膨胀导致在Htt内插入多谷氨酰胺或聚Q序列。 膨胀的聚Q蛋白形成长度和年龄相关蛋白聚合体，与毒性33，44相关。令人惊讶的是，最近的两项研究表明，聚Q序列的长度不是导致HD疾病发病的主要原因，这表明与多Q无关的因素也可能导致这种疾病55，6。6

一种可能的聚Q无关机制涉及一种新发现的蛋白质翻译类型，称为Repeat A分离N对AUG依赖（RAN）翻译7。顾名思义，RAN 翻译仅在存在扩展重复序列且不需要规范启动子序时发生。因此，RAN转换发生在重复的所有三个读取帧中，以产生三个不同的多肽。此外，由于许多基因还产生一个反感觉转录，其中包含扩展重复序....

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方案

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1. 生成共性多变的 RAN 肽表达构造

  1. 利用同义词子共体设计单个 RAN 肽编码序列，以消除基本的重复 DNA/RNA 结构，但保留覆盖氨基酸序列。
  2. 按研究所需的重复长度（通常为 5-100 个重复）以商业方式订购自定义协当序列。在 5' 末端包括 HindIII 限制站点和 3' 末端的 BamHI 限制站点，以方便克隆到C. elegans表达式载体，如 pPD95.79。
    注:如果大型构造的合成证明困难，则可以合成较小的构建基块序列，然后使用方向连接策略17构建成较大的重复。
  3. 使用标准 T4 连接方法将肽序列子克隆到C. elegans表达式向量中。
  4. 子克隆由PCR在RAN肽序列前生成的细胞类型特异性促进子体序列，以驱动组织特异性RAN肽-GFP表达。
  5. 将RAN肽构造微注入野生C型elegans的果子，使用标准方法18生成含有染色体外阵列的转基因菌株。对于共注射标记，使用了肌肉特异性RFP报告器（myo-3p:RFP （pCFJ104），尽管其他标记也可以使用。
  6. 使用标准的C.elegans集成筛选方法将稳定的转基因集成到基因组中19。
    7. <....

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结果

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我们使用此处描述的测定来评估不同基因抑制对在具有 G4C2重复扩张的 ALS 患者中发现的 RAN 二肽毒性的影响。利用生长测定测量发育毒性，我们分析了在全基因组RNAi屏幕抑制器中识别的几种基因敲除突变体对肌肉表达PR50-GFP毒性的影响。虽然仅表达PR50-GFP就导致完全渗透性生长抑制，但几个基因的功能突变的丧失抑制了PR发育毒性的12-94%（图1A）。

我们还利用视频速度分析方法测量了特定基因敲除对PR50表达动物发育活力的影响。不出所料，gfp（RNAi）由于PR50-GFP表达的抑制，与空矢量（RNAi）相比，其活力大大增加。我们还发现，RNAi对蛋白酶体子单元rpn-7导致PR50运动性显著增加（图1B）。

ALS，像许多神经退行性疾病一样，发生在成人身上。因此，我们使用年龄依赖性麻痹测定分析成.......

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讨论

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在这里，我们报告的方法，可用于测定RAN肽毒性建模在肌肉或神经元的C.elegans。虽然神经退行性蛋白质在人类患者中具有年龄发病表型，但在模型系统中过度表达时，它们也会表现出发育毒性。过度表达有显著的解释性限制，但它也为基因或药理学屏幕提供了一个强有力的起点，旨在识别能够逆转有毒表型的基因或药物。这一点尤其重要，因为大多数精确的动物疾病模型要么没有表型，要么没有弱表型，不适合无偏见筛选方法24、25、26。24,25,26我们的C.elegans RAN肽模型和测定代表了一种强大的，互补的方法，其他RAN肽模型系统，如酵母和果蝇，了解细胞通路是重要的这些新描述的蛋白质的毒性。

肌肉表达的RAN肽的条件毒性
测量RAN肽毒性需要一个追逐期来消除gfp（RNAi）的影响。然而，如果不注意精.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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NIH R21NS107797

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35mm x 10mm 培养皿，无菌CELLTREAT Scientific Products50-202-036线虫生长板和 RNAi
AGAR 颗粒化 2 千克BD 诊断系统线虫生长板和 RNAi
琼脂糖 ULTRAPURELIFE 技术显微注射生成 RAN 肽转基因菌株
CARBENICILLIN 5GTHERMO SCIFAIRLAWN CHEMICALSBP26485线虫生长板和 RNAi
盖板 玻璃 NO 1 22MM 1OZ/PKTHERMO SCI ERIE12542B用于连合测定的成像
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CSEPPENDORF 北美生物工具显微注射生成 RAN 肽转基因菌株
FF COV 玻璃 NO1 40X22MM 1OZPKTHERMO SCI ERIE125485C显微注射生成 RAN 肽转基因菌株
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片THERMO SCI ERIE12-550-15用于连合测定的成像
Gibco Bacto 蛋白胨 Gibco 公司 DF0118-17-0线虫生长板和 RNAi
卤烃油 700SIGMA-ALDRICH INCH8898-50ML显微注射生成 RAN 肽转基因菌株
IPTG BIOTECH 10GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS线虫生长板和 RNAi
徕卡高级荧光成像软件徕卡显微系统LAS-AF用于视频速度分析和连合分析的图像采集软件
Leica Immersion type N （Oil）W NUHSBAUM INC用于连合分析的成像
盐酸左旋咪唑 10GRTHERMO SCI ACROS ORGANICS连合分析的成像
MICROLOADER 吸头 2 X 96 PCSEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSE5242956003显微注射生成 RAN 肽转基因菌株

培养皿，60X15MM，500/CS		康宁生命科学塑料线虫生长板和 RNAi
组织培养板 24WEL 50/CS康宁生命科学 DL87721线虫生长板和 RNAi
DF0145070 16500500 E5242952008 BP162010 NC9547002 AC187870100 用于FB0875713A

参考文献

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  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group.

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RNAi RPN7 IGF DAF 2

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