我们介绍一种使用简单仪器在较短时间内检测罗非鱼中TiLV的RT-LAMP检测方法，相较于传统的RT-PCR技术更为快速。该方案可能有助于控制TiLVD的流行传播，特别是在发展中国家。
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摘要
摘要
罗非鱼湖病毒病（TiLVD）是由罗非鱼湖病毒（TiLV）引起的一种在罗非鱼中新兴的病毒性疾病，已成为全球水产养殖业中持续面临的挑战，已在世界多个地区导致罗非鱼大规模发病和死亡。因此，建立一种有效、快速且准确的TiLV感染诊断方法，对于早期发现感染并防止疾病在养殖环境中传播至关重要。本研究介绍了一种高灵敏度且实用的反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法，用于检测鱼类组织中的罗非鱼湖病毒。对感染样本进行RT-qPCR与RT-LAMP检测的比较结果显示，RT-qPCR在63份样本中均呈阳性（100%），而RT-LAMP检测出51份阳性（80.95%）。此外，对未感染样本的分析表明，63份未感染组织样本在RT-qPCR和RT-LAMP检测中均为阴性。通过RT-LAMP方法评估了与五种罗非鱼病原体的交叉反应性，所有测试结果均为阴性。来自感染鱼的肝脏和黏液样本在RT-LAMP检测中表现出相似的结果，表明黏液可作为非致死性样本用于RT-LAMP检测，从而避免杀死鱼类。综上所述，研究结果表明，本研究所建立的RT-LAMP检测方法可在1小时内有效检测罗非鱼组织中的TiLV，因此推荐作为养殖场快速诊断TiLV的筛查工具。
引言
罗非鱼湖病毒病（TiLVD）是一种影响罗非鱼（Oreochromis spp.）的病毒性疾病，据报道已在亚洲1,2、非洲和美洲等多个地区导致罗非鱼大量死亡。该病最初于2009年在以色列被发现，当时加利利湖（Lake Kinneret）野生罗非鱼的年捕捞量从257吨骤降至8吨2。该病由罗非鱼湖病毒（TiLV）引起，该病毒已被归入Amnoonviridae科，作为一个新属Tilapinevirus和一个新种Tilapia tilapinevirus3。TiLV的基因特征表明，它是一种新型有包膜、负链、单股RNA病毒，包含10个基因组节段，编码10种蛋白质1,2,4。研究表明，Sarotherodon、Oreochromis和Tilapine属的多种罗非鱼以及其他暖水鱼类（如巨丝足鲈（Osphronemus goramy））均对TiLV易感2,....
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方案
本实验涉及动物组织的使用，已获得泰国曼谷 Kasetsart 大学机构动物护理与使用委员会的批准（方案编号 ACKU61-VET-009）。
1. 组织采集
- 使用过量丁香油（即超过 3 mL/L）对罗非鱼实施安乐死。三卡因甲磺酸盐可作为丁香油的替代品。
- 使用无菌的梅氏剪刀和镊子切开死亡后的罗非鱼腹部，切除约 30–50 mg 的肝组织；或使用显微镜盖玻片，通过纵向刮取鱼体表皮层（从头部至尾部方向），收集 100 µL 黏液至 1.5 mL 微量离心管中。
- 立即进行 RNA 提取步骤，或将采集的样品保存在 −80 °C 环境中直至实验开始。由于完整的 RNA 比 DNA 更易降解，RNA 提取过程中应使用无 RNase 的耗材和试剂。
2. RNA 提取
- 为从肝组织中提取 RNA，将 30–50 mg 的罗非鱼组织加入含有 600–1,000 µL 胍盐-酸-酚提取试剂（材料表）的 1.5 mL 微离心管中，使用手持式组织匀浆器将样品研磨至均匀。组织样品所需胍盐-酸-酚提取试剂的体积约为组织体积的 10%。对于黏液样品，仅使用 300 µL 胍盐-酸-酚提取试剂（3:1）。
注意：胍盐-酸-酚提取试剂具有毒性，操作时必须小心。必须佩戴防护设备，如护目镜、实验服和防护手套。
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结果
本研究建立了一种RT-LAMP检测方法，用于检测罗非鱼中的TiLV感染。所检测的样本采集自2015年至2016年间泰国各地的14个养殖场。感染鱼与未感染鱼主要根据临床诊断及TiLVD症状表现进行初步分组。在样本采集后，采用RT-PCR进一步确认TiLV感染情况。琼脂糖凝胶电泳及荧光绿色的观察被选为LAMP扩增产物的评估方法（图2）。感染与未感染罗非鱼的肝脏和黏液样本均表现出TiLV疾病的临床症状，包括皮肤糜烂、皮肤发红、眼球突出和腹部肿胀。既往研究已证实肝脏样本可用于分子诊断检测以确定TiLV的存在35。此外，使用黏液样本可能具有优势，因其有助于避免处死动物。结果显示，在感染鱼的肝脏和黏液样本中可观察到梯状DNA条带及荧光绿色（图2），而在未感染动物组织的RT-LAMP反应体系中则未见DNA条带，仅呈现钙黄绿素的黄色（图2）。有趣的是，来自马来西亚某养殖场的一份TiLV感染罗非鱼样本也通过该RT-LAMP检测被诊.......
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讨论
水产养殖业持续受到病毒性感染的威胁，导致巨大的经济损失9,23,28。例如，新出现的泰拉诺鱼病毒（TiLV）对全球许多地区的罗非鱼生产国构成了重大威胁1,6,9。迄今为止，尚无特异性的治疗方法可用于预防TiLV病（TiLVD）。尽管疫苗的研发正在进行中，但一种高效的疫苗在投入商业应用之前仍需耗费大量时间。鉴于上述情况，在养鱼场实施严格的生物安全措施（如使用消毒剂）对于防止TiLVD传播十分必要29,30。目前，减少TiLV传播最有效的控制措施之一是对幼鱼和成鱼进行TiLV存在与否的筛查31。为实现筛查目的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由泰国研究基金会（TRF）资助，资助编号为RDG6050078，以及泰国高等教育委员会办公室在泰国高等教育研究促进与国家研究型大学项目支持下的泰国曼谷 Kasetsart 大学高级研究所农业与食品先进研究中心资助。本研究部分得到了 Kasetsart 大学研究生院研究生奖学金项目的支持。作者谨此感谢 Kwanrawee Sirikanchana 博士为视频提供的旁白解说，以及 Piyawatchara Sikarin 对视频的剪辑工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 组织采集： | |||
| 丁香油 | Better Pharma | N/A | |
| 三卡因甲磺酸盐（Tricaine methanesulfonate） | Sigma-Aldrich | E10521 | 丁香油的替代选择 |
| RNA提取： | |||
| 基于酸性胍-苯酚的试剂（TRIzol试剂） | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| 基于酸性胍-苯酚的试剂（GENEzol试剂） | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA试剂盒： | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA预洗液 | |||
| - RNA洗涤缓冲液 | |||
| - 无DNase/RNase水 | |||
| - Zymo-spin IIICG离心柱 | |||
| - 收集管 | |||
| RT-LAMP： | |||
| 1× SD II反应缓冲液 | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| 硫酸镁（MgSO4） | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP混合物 | Bioline | BIO-39053 | |
| 甜菜碱 | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| 钙黄绿素混合物 | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA聚合酶 | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV逆转录酶 | Promega | M510A | |
| 无核酸酶水 | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite干浴恒温器，单体 | Major Science | EL-01-220 | |
| 凝胶电泳： | |||
| 琼脂糖 | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液 | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液： | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - 冰乙酸（EMSURE级） | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - 乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA，Vetec级） | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA凝胶上样染料（6×） | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA分子量标准及标记物 | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT（水平电泳系统） | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC电源 | Bio-Rad | 1645052 | |
| 凝胶成像系统（Gel Doc EZ System） | Bio-Rad | 1708270 | |
| 紫外样品托盘 | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI成像仪 | Neogene Science | ||
| cDNA合成： | |||
| ReverTra Ace qPCR RT试剂盒 | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA合成试剂盒 | Vivantis Technologies | cDSK01 | cDNA合成的替代选择 |
| NanoDrop2000（微量分光光度计） | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100梯度PCR仪 | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR： | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| 无核酸酶水，无菌水 | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8联管PCR管条（白色） | Bio-Rad | TLS0851 | |
| 平盖光学PCR八联管盖条 | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch梯度PCR仪 | Bio-Rad | 1855196 | |
| 通用设备与材料： | |||
| 梅奥剪刀 | N/A | ||
| 镊子 | N/A | ||
| Vortex Genie 2（涡旋混合器） | Scientific Industries | ||
| LM-60微型离心机 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE迷你微型离心机 | Corning | 6765 | |
| 移液器 | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP滤芯移液器吸头 | Quality Scientific Plastics | TF系列 | |
| Corning Isotip滤芯吸头 | Merck | CLS系列 | |
| 无核酸酶1.5 mL微量离心管（NEST） | 无锡耐思生命科技 | 615601 |
参考文献
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinic....
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