用于特异性快速检测罗非鱼湖病毒的反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法

摘要

我们介绍一种使用简单仪器在相对较短时间内检测罗非鱼中TiLV的RT-LAMP检测方法，与传统的RT-PCR技术相比更具时效性。该方案可能有助于控制TiLVD的流行传播，特别是在发展中国家。

摘要

罗非鱼湖病毒病（TiLVD）是由罗非鱼湖病毒（TiLV）引起的一种在罗非鱼中新发的病毒性疾病，已成为全球水产养殖业中持续面临的挑战，已在世界多个地区导致罗非鱼大规模发病和死亡。因此，建立一种有效、快速且准确的TiLV感染诊断方法，对于早期发现感染并防止疾病在养殖环境中传播至关重要。本研究建立了一种高灵敏度且实用的反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法，用于检测鱼类组织中的罗非鱼湖病毒。对感染样本的RT-qPCR与RT-LAMP检测结果进行比较，显示RT-qPCR在63份样本中均为阳性（100%），而RT-LAMP检出51份阳性（80.95%）。此外，对未感染样本的分析表明，63份未感染组织样本在RT-qPCR和RT-LAMP检测中均为阴性。采用RT-LAMP方法评估了与五种罗非鱼病原体的交叉反应性，所有测试结果均为阴性。来自感染鱼的肝脏和黏液样本在RT-LAMP检测中表现出相似的结果，表明黏液可作为非致死性样本用于RT-LAMP检测，从而避免杀死鱼类。综上所述，研究结果表明，本研究所建立的RT-LAMP方法可在1小时内有效检测罗非鱼组织中的TiLV，因此推荐作为养殖场快速诊断TiLV的筛查工具。

引言

罗非鱼湖病毒病（TiLVD）是一种影响罗非鱼（Oreochromis spp.）的病毒性疾病，据报道已在亚洲^1,2、非洲和美洲等多个地区导致罗非鱼大量死亡。该病最初于2009年在以色列被发现，当时加利利湖（Lake Kinneret）野生罗非鱼的年捕捞量从257吨骤降至8吨²。该病由罗非鱼湖病毒（TiLV）引起，该病毒已被归入Amnoonviridae科，作为一个新属Tilapinevirus和一个新种Tilapia tilapinevirus³。TiLV的基因特征表明，它是一种新型有包膜、负链、单股RNA病毒，包含10个基因组节段，编码10种蛋白质^1,2,4。研究表明，Sarotherodon、Oreochromis和Tilapine属的多种罗非鱼以及其他暖水鱼类（如巨丝足鲈（Osphronemus goramy））均对TiLV易感^2,5。目前，该病毒正通过感染活鱼的运输在全球范围内持续传播^6,7，而通过冷冻罗非鱼或其产品传播病毒的风险则较为有限⁸。TiLV感染引起的高死亡率可能对罗非鱼产业造成严重的经济损失。例如，埃及因TiLV感染导致的夏季死亡综合征所造成的经济损失估计达1亿美元⁹。因此，开发一种快速且准确的诊断方法，对于在养殖场中有效控制该病具有重要意义。

迄今为止，TiLVD 的诊断主要依赖于分子检测、病毒分离和组织病理学检查。目前已开发出多种用于 TiLV 诊断的 PCR 方案和引物^10,11。例如，已建立并验证了一种基于 SYBR Green 的反转录定量 PCR（RT-qPCR）方法，其灵敏度可检测低至 2 个拷贝/µL 的病毒¹⁰。其他用于 TiLV 检测的 PCR 方法包括 TaqMan 定量 PCR¹¹、RT-PCR²、巢式 RT-PCR¹² 和半巢式 RT-PCR¹³。然而，由于这些反应过程复杂，需要精密的实验设备，并且耗时较长，因此不适合在野外现场应用。

环介导等温扩增（LAMP）检测是一种快速、简便且适用于现场应用的方法^14,15。该技术基于链置换反应原理，扩增反应在等温条件下进行，无需使用复杂且昂贵的热循环仪^14,15。因此，可通过琼脂糖凝胶电泳结合荧光染料观察呈梯状条带的LAMP扩增产物或RT-LAMP产物，以安全地可视化DNA或RNA¹⁴，或通过肉眼观察反应体系是否出现浑浊或白色沉淀来判断结果^16,17,18。由于上述优点，该技术已被用于多种鱼类病原体的现场检测^{17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}。本研究旨在建立一种快速、灵敏且准确的RT-LAMP检测方法用于TiLV的检测。该RT-LAMP检测可在30分钟内完成对鱼类样本中TiLV的筛查，可用于TiLVD的诊断与监测。

方案

本实验涉及动物组织的使用，已获得泰国曼谷 Kasetsart 大学机构动物护理与使用委员会的批准（方案编号 ACKU61-VET-009）。

1. 组织采集

1. 使用过量丁香油（即超过 3 mL/L）对罗非鱼实施安乐死。三卡因甲磺酸盐可作为丁香油的替代品。
2. 使用无菌的梅氏剪刀和镊子切开死亡后的罗非鱼腹部，切除约 30–50 mg 的肝组织；或使用显微镜盖玻片，通过纵向刮取鱼体表皮层（从头部至尾部方向），收集 100 µL 黏液至 1.5 mL 微量离心管中。
3. 立即进行 RNA 提取步骤，或将采集的样品保存在 −80 °C 直至实验。由于完整的 RNA 比 DNA 更敏感，因此在 RNA 提取过程中应使用无 RNase 的材料和试剂。

2. RNA 提取

1. 为从肝脏组织中提取RNA，取30–50 mg罗非鱼组织加入含有600–1,000 µL胍酸酚提取试剂（材料表）的1.5 mL微量离心管中，使用手持式组织匀浆器将样品研磨至均匀。组织样品所需胍酸酚提取试剂的体积约为组织质量的10%。对于黏液样品，仅使用300 µL胍酸酚提取试剂（比例为3:1）。
   注意：胍酸酚提取试剂具有毒性，操作时必须小心。必须佩戴防护装备，如护目镜、实验服和防护手套。
2. 将匀浆后的样品在室温下以10,000 x g 离心30秒，然后将上清液转移至新的无菌1.5 mL微量离心管中。
3. 向管中加入等体积的95%乙醇，并充分混匀。
4. 将溶液转移至置于收集管中的离心柱（材料表）中，在室温下以10,000 x g 离心30秒。弃去穿流液，并将离心柱转移至新的收集管中。
5. 向柱中加入400 µL RNA预洗液（材料表），在室温下以10,000 x g 离心30秒后弃去穿流液。重复此步骤一次。
   注：配制RNA预洗液时，将10 mL 95%乙醇加入40 mL RNA预洗浓缩液中。
6. 向柱中加入700 µL RNA洗涤缓冲液（材料表），在室温下以10,000 x g 离心2分钟。将离心柱转移至无菌1.5 mL微量离心管中。
   注：配制RNA洗涤缓冲液时，将52 mL 95%乙醇加入12 mL RNA洗涤缓冲液浓缩液中。
7. 用100 µL无核酸酶水洗脱吸附在离心柱基质中的RNA样品，并在室温下以10,000 x g 离心30秒。
8. 使用微量分光光度计测定提取RNA的浓度，并用无核酸酶水将RNA稀释至所需浓度。
   注：合格的OD260/OD280吸光度值范围为1.6至1.9，表明RNA纯度符合RT-LAMP检测要求。
9. 立即进行下一步操作，或将样品保存于−80 °C直至使用。

3. 引物设计

1. 使用 Primer Explorer 版本 4 设计用于 RT-LAMP 的特异性引物。访问网站 https://primerexplorer.jp/e/，然后点击 PrimerExplorer V4 按钮。
2. 选择包含 TiLV 第 3 节段序列的 FASTA 格式文件，然后点击 Primer Design 按钮。
   注：从 GenBank 登录号 KX631923 获取 FASTA 格式的序列，该序列代表罗非鱼湖病毒 TV1 第 3 节段¹。
3. 设计引物时，输入以下基本参数：
   -   GC 含量为 40%–60%
   -   扩增子长度 ≥280 个碱基对 (bp)
   -   各引物之间的熔解温度 (Tm) 应相近，最大差异不超过 5 °C
   注：引物之间不得互补
   1. 避免选择易于形成二级结构的序列区域。
   2. 进行二聚体引物分析时，为获得最优设计，应选择 ΔG 值最小不低于 −3.5 的组合；对于末端设计，为获得较小的 ΔG 值，应选择 ΔG 值最大不超过 −4 的组合。
4. 点击 Generate 按钮。
   注：软件完成输入数据处理后，将显示引物设计结果（图 1）。

4. RT-LAMP 检测

1. 配制RT-LAMP主反应混合液，每反应包含2.5 µL 1x SD II反应缓冲液、3 µL 6 mM MgSO₄、1.4 µL 1.4 mM dNTP混合物、4 µL 0.8 M甜菜碱、1.3 µL 0.052 mM钙黄绿素混合液、1 µL 1.6 µM TiLV-F3引物、1 µL 1.6 µM TiLV-B3引物、1 µL 0.2 µM TiLV-BIP引物、1 µL 0.2 µM TiLV-FIP引物、1 µL 0.3 U Bst DNA聚合酶、1 µL 0.1 U AMV逆转录酶以及3.8 µL无核酸酶水。
   注意：应额外配制至少比总反应体积多10%的主反应混合液。
2. 将22 µL RT-LAMP主反应混合液分装至无菌的1.5 mL微量离心管中。
3. 向反应管中加入3 µL提取的RNA，并通过涡旋振荡混匀样品。阴性对照使用蒸馏水代替RNA样本。
4. 将反应体系在65 °C孵育60分钟，随后在80 °C孵育10分钟以终止反应。
5. 孵育结束后，用肉眼直接观察显色变化。阳性结果呈现荧光绿色。

5. 琼脂糖凝胶电泳

1. 通过将 0.6 g 琼脂糖粉末悬浮于 40 mL 1x TAE 缓冲液中，制备 1.5% w/v 琼脂糖凝胶。在微波炉中加热 3–5 分钟使混合物融化，直至琼脂糖完全溶解，并轻轻旋转混匀。
2. 让琼脂糖冷却至温度降至 65 °C。将 40 mL 琼脂糖溶液倒入凝胶模具中，并插入梳子。
3. 让琼脂糖凝胶在室温下静置 20–30 分钟，直至完全凝固。然后移去梳子，将凝胶放入电泳槽中。
4. 加入电泳缓冲液，使液面覆盖电泳槽中的凝胶表面。
5. 向每个加样孔中加入 10 µL RT-LAMP 样品和 2 µL 6x 上样缓冲液。在参考泳道中加入 5 µL 1 kb DNA 标准分子量标记物。
6. 将连接阴极和阳极的盖子插好，并接通电源。打开电源，设定为恒定 100 V，电泳运行 40 分钟。
7. 完成凝胶电泳分离后，从凝胶模具中取出凝胶。然后用溴化乙锭（EtBr）染色，浓度为 10 mg/mL ，染色 7 分钟，再用蒸馏水漂洗染色 5 分钟。
   注意：EtBr 具有毒性，且被认为是一种致癌物，因此使用时需格外小心。
8. 使用凝胶成像系统在紫外光下观察凝胶，条带显现后拍摄凝胶图像。

6. 互补DNA（cDNA）合成

1. 按每反应体系配制cDNA合成预混液：包含2 µL 5x RT缓冲液、0.5 µL引物混合液、0.5 µL RT酶和2 µL无核酸酶水。
   注意：为避免移液过程中的损失，应额外多配制1倍反应量的预混液。
2. 将5 µL预混液分装至无菌的1.5 mL微量离心管中。
3. 向反应管中加入100 ng稀释后的提取RNA（来自步骤2.8），混匀后离心，使全部混合物沉降至管底。
4. 将反应体系置于PCR仪中，42 °C孵育60分钟，随后98 °C孵育5分钟。反应完成后，将cDNA储存于−20 °C备用。

7. RT-qPCR

1. 配制TiLV qPCR反应主混合液，每反应包含0.3 µL的10 µM反向引物、0.3 µL的10 µM 正向引物、5 µL的2× SYBR Green DNA聚合酶以及0.4 µL无核酸酶水。使用以下引物和对照：
   正向引物（TiLV-112F）： 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3'
   反向引物（TiLV-112R）： 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3'
2. 将6 µL TiLV qPCR主混合液分别加入与实时荧光定量PCR仪兼容的qPCR条板的每个孔中。
3. 向各孔中加入4 µL cDNA模板、阴性对照（无核酸酶水）、阳性对照（10 pg/µL）以及pTiLV（质粒）¹⁰或系列稀释的TiLV质粒，通过轻弹混匀各样本。每个样本设三个重复。
4. 将qPCR反应体系放入已编程的实时荧光定量PCR仪中。设置qPCR程序：95 °C孵育3 min，随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性10 s、60 °C退火延伸30 s，最后进行熔解曲线分析，温度从65 °C以0.5 °C/5 s的增幅升至95 °C。
5. 通过分析扩增曲线和熔解曲线进行数据处理，并利用系列稀释质粒所得标准曲线计算TiLV拷贝数。

结果

本研究建立了一种RT-LAMP检测方法，用于检测罗非鱼中的TiLV感染。所检测的样本于2015年至2016年间采集自泰国各地的14个养殖场。感染鱼与未感染鱼主要依据临床诊断及TiLVD症状表现进行初步分组。在样本采集后，通过RT-PCR进一步确认TiLV感染情况。琼脂糖凝胶电泳及荧光绿色的观察被选为LAMP扩增产物的评估方法（图2）。感染与未感染罗非鱼的肝脏和黏液样本均根据TiLV疾病的临床症状进行表征，包括皮肤糜烂、皮肤发红、眼球突出和腹部肿胀。既往研究已证实肝脏样本可用于分子诊断检测以确定TiLV的存在³⁵。此外，使用黏液样本可能具有优势，因其有助于避免杀死动物。结果显示，在感染鱼的肝脏和黏液样本中观察到梯状DNA条带及荧光绿色（图2），而在未感染动物组织的RT-LAMP反应体系中未观察到DNA条带，仅见钙黄绿素的黄色（图2）。有趣的是，一份来自马来西亚某养殖场的TiLV感染罗非鱼样本也通过该RT-LAMP检...

讨论

水产养殖业持续受到病毒性感染的威胁，导致巨大的经济损失^9,23,28。例如，新出现的泰拉诺鱼病毒（TiLV）对全球许多地区的罗非鱼生产国构成了重大威胁^1,6,9。迄今为止，尚无特异性的治疗方法可用于预防TiLV病（TiLVD）。尽管疫苗的研发正在进行中，但一种高效的疫苗仍需较长时间才能投入商业使用。鉴于上述情况，在养鱼场实施严格的生物安全措施（如使用消毒剂）对于防止TiLVD传播十分必要^29,30。目前，减少TiLV传播最有效的控制措施之一是对幼鱼和成鱼进行TiLV存在与否的筛查³¹。为实现筛查目的，诊断...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织采集：
丁香油	Better Pharma	N/A
三卡因甲磺酸盐（Tricaine methanesulfonate）	Sigma-Aldrich	E10521	丁香油的替代选择
RNA提取：
基于酸性胍-苯酚的试剂（TRIzol试剂）	ThermoFisher Scientific Corp.	15596026
基于酸性胍-苯酚的试剂（GENEzol试剂）	Geneaid	GZR100
Direct-zol RNA试剂盒：	Zymo Research	R2071
- Direct-zol RNA预洗液
- RNA洗涤缓冲液
- 无DNase/RNase水
- Zymo-spin IIICG离心柱
- 收集管
RT-LAMP：
1x SD II反应缓冲液	Biotechrabbit	BR1101301
硫酸镁（MgSO4）	Sigma-Aldrich	7487-88-9
dNTP混合物	Bioline	BIO-39053
甜菜碱	Sigma-Aldrich	B2629
钙黄绿素混合物	Merck	1461-15-0
Bst DNA聚合酶	Biotechrabbit	BR1101301
AMV逆转录酶	Promega	M510A
无核酸酶水	Invitrogen	10320995
Elite干浴恒温器，单体	Major Science	EL-01-220
凝胶电泳：
琼脂糖	Vivantis Technologies	PC0701-500G
Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液	Sigma-Aldrich	SRE0062
Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液：
- Tris	Vivantis Technologies	PR0612-1KG
- 冰乙酸（EMSURE级）	Merck Millipore	1000632500
- 乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA，Vetec级）	Sigma-Aldrich	V800170-500G
Neogreen	NeoScience Co., Ltd.	GR107
DNA凝胶上样染料（6X）	ThermoFisher Scientific Corp.	R0611
DNA分子量标准及标记物	Vivantis Technologies	PC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT（水平电泳系统）	Bio-Rad	1704487
PowerPac HC电源	Bio-Rad	1645052
Gel Doc EZ成像系统	Bio-Rad	1708270
紫外样品托盘	Bio-Rad	1708271
NαBI成像仪	Neogene Science
cDNA合成：
ReverTra Ace qPCR RT试剂盒	Toyobo	FSQ-101
Viva cDNA合成试剂盒	Vivantis Technologies	cDSK01	cDNA合成的替代选择
NanoDrop2000（微量分光光度计）	ThermoFisher Scientific Corp.	ND-2000
T100梯度PCR仪	Bio-Rad	1861096
RT-qPCR：
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725120
无核酸酶水，无菌水	MultiCell	809-115-CL
8联管PCR管条（白色）	Bio-Rad	TLS0851
平盖光学PCR八联管盖条	Bio-Rad	TCS0803
CFX96 Touch梯度PCR仪	Bio-Rad	1855196
通用设备与材料：
梅奥剪刀		N/A
镊子		N/A
Vortex Genie 2（涡旋混合器）	Scientific Industries
LM-60微型离心机	LioFuge	CM610
Corning LSE迷你微型离心机	Corning	6765
移液器	Rainin	Pipete-Lite XLS
QSP滤芯移液器吸头	Quality Scientific Plastics	TF系列
Corning Isotip滤芯吸头	Merck	CLS系列
无核酸酶1.5 mL微量离心管，NEST品牌	无锡耐思生物科技有限公司	615601