一种通过图像引导经心尖二尖瓣叶穿刺建立大鼠二尖瓣反流致容量负荷过重的可控模型

摘要

本文报道了一种由二尖瓣反流引起的左心容量超负荷的啮齿动物模型。在超声引导下，将特定尺寸的针插入正在跳动的心脏的二尖瓣前叶，从而诱导出可控严重程度的二尖瓣反流。 

摘要

二尖瓣反流（MR）是一种常见的心脏瓣膜病变，可导致心脏重构并引发充血性心力衰竭。尽管未纠正的MR及其不良预后的风险已被认识，但心脏功能、结构及重构的纵向变化仍不完全清楚。这一知识空白限制了我们对MR纠正最佳时机的理解，以及早期与晚期纠正MR对左心室可能带来的益处的认识。为了研究MR背景下左心室重构的分子机制，需要借助动物模型。传统上，动静脉瘘模型被用于诱导容量超负荷，但这与临床上相关的病变（如MR）存在差异。MR属于低压性容量超负荷血流动力学刺激，因此需要能够模拟这一状况的动物模型。本文中，我们描述了一种重度MR的啮齿类动物模型：在超声心动图影像引导下，使用23G针头穿刺大鼠二尖瓣前叶，于跳动的心脏上完成造模。通过超声心动图评估并确认MR的严重程度，并报告该模型的可重复性。

引言

二尖瓣反流（MR）是一种常见的心脏瓣膜病变，在美国普通人群中的发病率为1.7%，在65岁以上老年人群中则高达9%¹。在这种心脏瓣膜病变中，由于二尖瓣瓣叶在收缩期无法正常闭合，导致血液从左心室反流至左心房。MR可由多种病因引起，但与继发性MR相比，原发性二尖瓣病变（原发性MR）的诊断和治疗更为常见²。孤立性原发性MR通常由二尖瓣的黏液样变性引起，导致瓣叶或腱索延长，或部分腱索断裂，这些因素均会导致瓣膜在收缩期失去正常的对合功能。

此类瓣膜病变引起的二尖瓣反流（MR）会增加每搏左心室的充盈血量，从而升高舒张末期心室壁应力，并提供一种血流动力学刺激，引发心脏适应性改变和心室重构。该病变所致的心脏重构通常表现为心腔显著扩大^3,4、轻度心室壁肥厚，并在较长时间内保持收缩功能正常。由于射血分数通常得以保留，因此通过外科或经导管手段纠正二尖瓣反流往往被延迟，直至出现呼吸困难、心力衰竭和心律失常等症状。然而，未纠正的二尖瓣反流与心脏不良事件的高风险相关，但目前关于这些事件背后超微结构改变的认识仍不明确。

二尖瓣反流（MR）的动物模型为研究心脏中此类超微结构变化以及疾病的纵向进展提供了有价值的模型。以往，研究人员已在猪、狗和绵羊等大型动物中通过建立外部心室-心房分流道⁵、心内腱索断裂⁶或瓣叶穿孔⁷来诱导MR。尽管在大型动物中进行手术操作较为容易，但由于在这些动物中开展研究的成本高昂，相关研究通常仅限于小样本量的短期随访。此外，由于针对这些模型的物种特异性抗体和可用于序列比对的注释基因组数据库有限，对其组织进行分子分析往往具有挑战性。

二尖瓣反流（MR）的小型动物模型可为研究这种瓣膜病变及其对心脏重构的影响提供合适的替代方法。历史上，曾采用大鼠主动脉-下腔静脉瘘（ACF）模型来模拟心脏容量负荷过载。该模型最早由 Stumpe 等人于 1973 年首次描述⁸，通过外科手术建立动静脉瘘，将高压的降主动脉血流直接导入低压的下腔静脉。瘘道内的高流量会导致心脏双侧显著的容量超负荷，从而在建立 ACF 后数天内即引发明显的左右心室肥厚与功能障碍⁹。尽管该模型已取得一定成功，但其并不能模拟二尖瓣反流特有的血流动力学特征——即低压性容量超负荷，这种状态会升高前负荷，同时降低后负荷。鉴于 ACF 模型存在上述局限性，我们致力于开发并表征一种更贴近低压性容量超负荷状态的 MR 动物模型。

本文描述了一种建立大鼠二尖瓣瓣叶穿孔以产生重度二尖瓣反流（MR）的模型方案^10,11。将一根皮下注射针插入搏动的大鼠心脏，并在实时经胸超声心动图引导下推进至前叶二尖瓣瓣叶。该技术具有高度可重复性，是一种相对理想的、可模拟临床患者中所见二尖瓣反流的动物模型。MR 的严重程度可通过用于穿孔二尖瓣瓣叶的针头尺寸进行控制，并可通过经食管超声心动图（TEE）评估 MR 的严重程度。

方案

实验程序已获得埃默里大学动物护理与使用项目批准，方案编号为EM63Rr，批准日期为2017年6月6日。

1. 术前准备

1. 手术前对所有手术器械进行蒸汽灭菌。
2. 手术当天，将大鼠从饲养区转移至手术室，并称重。
3. 根据体重抽取术前和术后用药：卡洛芬（Carprofen）两剂（每剂 2.5 mg/kg），庆大霉素（Gentamycin）一剂（6 mg/kg），以及布托啡诺（Buprenorphine）一剂（0.02 mg/kg）。
4. 确保气体混合器中有足够的异氟烷，并备有充足的氧气供应。通常一个满装氧气罐（24 ft³）已足够使用。

2. 动物准备

注意：本研究使用体重为 350–400 g 的成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠。如有需要，该手术技术也可适用于体型稍小或稍大的动物。

1. 将大鼠置于诱导室中，使用5%异氟烷与1 LPM（每分钟1升）纯氧混合气体进行麻醉。通过视觉观察呼吸频率减慢，以及轻捏大鼠脚趾无抽搐反应，判断麻醉深度是否足够。
2. 使用已改装为气管插管的16 G套管针为大鼠进行气管插管。
   1. 使用耳镜观察气管和声带，并用棉签清除咽部分泌物。
   2. 将带有0.034英寸导丝的气管插管经声带插入。当导管正确进入气管后，将导管进一步推入，随后撤出导丝（图1）。
3. 将大鼠置于维持在37 °C的加热手术垫上，并将气管插管连接至机械呼吸机。将大鼠体重输入呼吸机控制软件，软件将自动计算通气频率和潮气量。本研究中采用每分钟66次呼吸，潮气量为1 mL/100 g体重（图1D）。
   1. 使用100%氧气（1 LPM）混合2–2.5%异氟烷作为吸入麻醉剂，并通过下颌张力消失及脚趾夹捏无反应来确认麻醉深度。
   2. 注意：若插管正确，胸部运动应与呼吸机同步。
   3. 若插管不当，胸部运动将无法与呼吸机同步。为检测插管是否错误，可压迫大鼠腹部，从而在呼吸机上产生反向压力，触发高压报警。此时应轻柔回撤套管针，将大鼠重新放回含5%异氟烷的诱导室中数分钟，确保其充分麻醉后，重新进行插管。
   4. 确认正确插管后，使用4-0丝线将气管插管近端缝合固定于大鼠颊部，以防术中脱管。
4. 插入直肠温度探头以监测体温，并连接四电极心电图导联，在整个操作过程中持续监测心电图（ECG）。
   1. 若手术台加热不足以维持体温，可使用头顶加热灯；当体温超过37 °C时，应关闭加热灯。
   2. 目视评估心电图是否存在心律失常或心肌缺血征象。如无异常，记录基线心电图。
5. 进行经胸超声心动图（TTE）检查以评估基线心脏功能（图2A）。
   1. 将大鼠转为仰卧位，剃除左侧胸壁毛发。为获得清晰的超声图像，使用脱毛膏彻底清除残留毛发。
   2. 使用具备足够频率的超声系统以适应高心率成像。本研究采用Visualsonics 2100系统配备21 MHz探头，适用于大鼠心脏成像。
   3. 在胸骨旁长轴切面获取B型图像，用于计算左心室容积；在同一平面获取M型图像，测量室壁厚度。
   4. 将探头旋转90°，在乳头肌中部水平获取胸骨旁短轴切面的B型和M型图像，以测量心室横截面室壁厚度。
6. 进行经食管超声心动图（TEE）检查以获取基线图像（图2B）。
   1. 将大鼠置于右侧卧位，将8 Fr心内超声探头（8 MHz）涂少量凝胶后插入大鼠食管。该心内超声（ICE）探头频率足以在每个心动周期获取4–6帧图像，足以清晰显示瓣膜运动。
      注：可使用GE Vivid I或Siemens SC2000 prime系统进行ICE成像。
   2. 获取高位食管切面，获得心脏左侧的两腔心视图。该切面可理想显示左心房、二尖瓣和左心室。调整探头位置，使前叶和后叶清晰可见且对合居中。此角度亦可用于多普勒测量二尖瓣血流，无需角度校正。
   3. 在此切面测量左心房面积及二尖瓣环尺寸。
   4. 进行彩色多普勒成像，确认瓣膜功能正常且基线无二尖瓣反流。进行脉冲波和连续波多普勒成像，量化二尖瓣流入血流，并确认无反流信号。
   5. 对主动脉进行B型和脉冲波多普勒成像，测量主动脉根部直径并计算主动脉血流量。
   6. 对肺静脉进行脉冲波多普勒成像，测量肺静脉血流。
7. 皮下注射单次剂量卡洛芬（2.5 mg/kg，SQ，非甾体类抗炎药）、庆大霉素（6 mg/kg，SQ，抗生素）及无菌生理盐水（1 mL，SQ），以预先补偿术中可能的失血。
8. 根据需要剃除左侧胸壁残余毛发，手术区域应从颈部下部至剑突，以及从左上肢至胸骨中线，确保术野无毛发，降低手术部位污染风险。
9. 使用浸有聚维酮碘的纱布擦拭手术区域，随后使用浸有70%乙醇的纱布进行脱碘。擦拭时应以环形方式在皮肤上操作，避免纱布接触已擦拭区域。
10. 重复此步骤三次，以达到手术所需的足够无菌环境。
11. 用无菌手术巾覆盖动物体表，仅暴露手术区域窗口以供操作。

3. 左侧开胸术

1. 使用无菌技术进行整个手术操作，维持异氟烷浓度为2-2.5%，氧气流速为1 LPM。将所有器械放置于无菌托盘中，每次使用后立即放回托盘。
2. 术者在整个手术过程中应佩戴无菌手套、口罩和手术帽。可选择性穿戴无菌手术衣，除非预期可能发生污染，否则非必需。
3. 使用带有#15刀片的外科手术刀，在胸壁左侧距剑突约1 cm处做皮肤切口。用钝头解剖剪分离皮肤层与肌肉层，并做纵行切口。
4. 以相同方式逐层分离肌肉层，直至暴露肋骨。
5. 在第五肋间做2-3 cm的纵行切口，切口大小应足以插入牵开器并暴露心脏。
6. 用尖头镊子轻轻提起心包膜，使用显微剪刀切除心脏心尖周围区域的心包膜。此步骤有助于避免术后心脏与胸壁及膈肌之间形成粘连。
   注意：应避免在胸骨附近做手术切口，以减少出血。若切断沿胸骨走行的胸廓内动脉，可能导致大量出血。如遇此类出血，应识别出血点并予以电灼止血。

4. 超声心动图引导的MR手术（图3 和 图4）

1. 使用6-0 Prolene缝线和显微持针器，在左心室心尖部放置荷包缝线。如有需要，可使用显微镊子固定心脏。
2. 轻轻牵拉心尖部缝线以稳定心尖，并将一根已用生理盐水冲洗、远端带有三通阀的23 G针头穿过荷包缝线中央，插入左心室腔内。
3. 一只手稳定地握住并引导针头，另一只手同时操作经食管超声探头，以获得最佳超声图像来显示针头位置，具体方法如前所述。
4. 在实时超声引导下，将针头向前推进至前瓣叶的室侧。一旦在超声图像上确认针头位置，即以一次精细动作将针头穿过瓣叶。若遇到阻力，可在推进过程中轻轻旋转针头以穿透瓣叶。
   注意：针头进入左心房过深可能导致左心房穿孔，引起大量出血和动物死亡。超声应始终能够清晰显示针头位置。
5. 将针头回撤至左心室腔内，远离二尖瓣，然后开启彩色多普勒成像以确认二尖瓣反流（MR）。
6. 若彩色多普勒成像未见反流信号，重复步骤4.4和4.5。必要时调整超声探头位置以获得更佳视野。经过数只大鼠的练习后，通常可一次完成瓣叶穿刺，形成与针头外径大小相当的孔洞。此结果已在大鼠心脏尸检中得到证实。
7. 确认出现二尖瓣反流后，将针头完全退出左心室腔，并轻轻结扎荷包缝线。
8. 使用无菌纱布吸干心尖部及胸腔内的血液。
   注意：手术手套接触超声探头可能导致无菌环境被污染。应使用70%乙醇喷洒手套或更换新的无菌手套。

5. 动物恢复与术后护理

1. 在心脏功能稳定（正常心电图和心率）5-10分钟后，用4-0薇乔线逐层关闭开胸切口，同时逐步降低异氟烷浓度。
2. 使用间断缝合闭合肋骨，异氟烷维持在2%。将胸腔引流管插入第六肋间，并将其固定于无菌手术单上，以防止引流管意外进入胸腔。
3. 使用连续缝合方式闭合肌肉层，异氟烷维持在1.5%。
4. 使用连续缝合方式闭合皮肤层，异氟烷维持在1%。
5. 将一支带有10 mL鲁尔锁阀的注射器连接至胸腔引流管，从胸腔内抽出10-12 mL空气，随后拔除胸腔引流管。
6. 给予最后一次卡洛芬注射（2.5 mg/kg，皮下），然后关闭异氟烷。
7. 在大鼠从麻醉中逐渐苏醒期间继续机械通气，监测生命体征（SpO₂和心率）。当自主呼吸开始时，关闭呼吸机以测试大鼠维持自主呼吸及良好SpO₂水平的能力。
8. 如果SpO₂水平开始低于90%，立即重新启动呼吸机。一旦大鼠能够在无通气支持下维持稳定的SpO₂水平，即可剪断气管插管的固定缝线，准备拔管。
9. 当大鼠出现清醒迹象（包括胡须或眼球运动）时，进行拔管。
10. 使用鼻罩提供100%氧气，直至大鼠能够自主活动。
11. 将大鼠转移至清洁笼具中，垫料尽量减少，并使用手持式SpO₂监测仪（置于大鼠足部或尾部）持续监测生命体征，直至大鼠能够自主活动。
    注：若观察到手术相关的不良反应，动物恢复时间可能更长，维持高SpO₂水平所需时间也可能延长。若发生此情况，可继续使用含100%氧气的鼻罩，直至SpO₂水平稳定。
12. 为降低手术部位受伤风险并避免感染，术后应将大鼠单独饲养。
13. 在大鼠清醒并具备足够活动能力后3小时内给予布托啡诺。由于布托啡诺在围手术期恢复早期使用可能引起呼吸困难，因此应延迟给药，直至大鼠呼吸顺畅。
14. 术后所有动物均接受以下药物治疗：庆大霉素（6 mg/kg，皮下，每日一次，术后第1-3天）和瑞马迪尔（5 mg/kg，皮下，每日一次，术后第1-3天）。所有动物在术后5天内每日观察一次切口情况，并在术后前两周内每日进行一次疼痛评估。

6. 使用超声心动图验证二尖瓣反流程度（图5）

1. 术后两周重复经食管超声心动图（TEE）检查，采用第2.7节中规定的相同步骤。术后两周足以使血流动力学趋于稳定。
2. 使用经食管超声成像获取左心室和左心房的两腔心切面彩色多普勒图像，测量左心房面积和二尖瓣反流（MR）射流面积。通过以下公式计算MR射流面积分数：
   (1)
   重度MR定义为MR射流面积 ≥ 30%。
3. 通过计算23 G针头的横截面积来估算反流口面积，使用针头的外径进行计算。该公式假设反流口面积等于23G针头的横截面积。
   (2)
4. 将多普勒取样门置于反流束开口处，获取连续波多普勒图像。描记波形以计算反流束的流速-时间积分（VTI）。可使用以下公式估算MR容积：
   (3)
   重度MR定义为MR容积 ≥ 95 µL。
5. 通过将超声探头向外侧顺时针旋转，获取肺静脉的脉冲波多普勒图像。测量收缩期和舒张期波形速度，并使用以下公式计算比值：
   (4)
   负的肺静脉血流比值提示重度MR。

7. 假手术

1. 按照所述执行第1-3节。
2. 修改第4节，将23 G针头经左心室心尖部的荷包缝线插入左心室腔内，但不向前推进至二尖瓣以造成二尖瓣反流。将针头插入左心室腔后立即撤出，随后收紧并闭合心尖部。
3. 按照所述执行第5节。
4. 按照第6节所述进行二尖瓣评估。然而，所有动物均不应存在二尖瓣反流，因此无需进行所述的量化分析。

结果

可行性与可重复性
本研究所提出的MR模型具有高度可重复性，在所有用于本研究的大鼠中，均成功在二尖瓣叶上制备出明确的孔洞。图6A展示了穿刺针插入二尖瓣时的方向。图6B展示了一只代表性大鼠在手术后2周处死取出的二尖瓣叶上的孔洞。

生存率与不良事件
采用所述方法诱导16只大鼠建立二尖瓣反流（MR）。所有大鼠均成功建立重度二尖瓣反流。其中1只大鼠在建立二尖瓣反流后1小时内因急性呼吸衰竭死亡。因此，建立二尖瓣反流后2周的总体生存率为93.75%。在为期两周的观察期间，未观察到任何动物发生死亡或主要心脏不良事件，如出血、心律失常或卒中。

讨论

本研究报道了一种可重复的重度二尖瓣反流（MR）啮齿类动物模型，术后生存率良好（术后生存率为93.75%），且无明显术后并发症。经食管超声心动图实时成像以及将针头插入跳动的心脏以穿刺二尖瓣瓣叶的操作是可行的，且可进行教学培训。本研究中使用23 G针头成功诱导了重度MR，但可根据需要选用更小或更大的针头以调节反流程度。该模型所诱发的MR对左心室造成低压性容量负荷，更接近临床观察到的二尖瓣病变情况。在MR发生后两周内，该模型即出现明显的左心房和左心室扩张，但射血分数测定显示收缩功能未受影响。这种情况类似于原发性MR患者，尽管其左侧心脏腔室进行性扩张，但在很长一段时间内仍无症状，且不出现心力衰竭。

这种二尖瓣反流（MR）的容量超负荷模型在多个方面与广泛使用的主动脉-下腔静脉瘘（ACF）容量超负荷模型不同。ACF操作简便，仅需进行简单的开腹手术，无需气管插管和机械通气，因此受到科学界的青睐¹²。尽管其操作优势明显，但动静脉瘘会将大量血液分流至下腔静脉，导致静脉系统容量超负荷，并累及右心室。静脉充血引起的中心静脉压升高可能导致肝充血以及肾小球滤过...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
23G 针头	Mckesson	16-N231
25G 针头，5/8 英寸	McKesson	1031797
4-0 缝合线（Vicryl）	Ethicon	J496H
6-0 缝合线（Prolene）	Ethicon	8307H
70% 乙醇	McKesson	350600
ACE 光源	Schott	A20500
ACUSON AcuNav 超声探头	Biosense Webster	10135936	8Fr 心腔内超声探头
ACUSON PRIME 超声系统	Siemens	SC2000
聚维酮碘（Betadine）	McKesson	1073829
钝头显微解剖剪	Roboz	RS5990
布托啡诺（Buprenorphine）	Patterson Veterinary	99628
卡洛芬（Carprofen）	Patterson Veterinary	7847425
胸腔引流管（16G 安全导管）	Terumo	SR-OX1651CA
一次性手术铺巾	Med-Vet	SMS40
电动剃毛器	Oster	78400-XXX
庆大霉素（Gentamycin）	Patterson Veterinary	78057791
带桌夹的加热灯	Braintree Scientific	HL-1 120V
止血钳，弯型	Roboz	RS7341
止血钳，直型	Roboz	RS7110
诱导麻醉舱	Braintree Scientific	EZ-1785
注射塞，帽，鲁尔锁	Exel	26539
异氟烷（Isoflurane）	Patterson Veterinary	6679401725
机械呼吸机	Harvard Apparatus	Inspira ASV
显微解剖镊	Roboz	RS5135
显微解剖弹簧剪	Roboz	RS5603
持针器	Roboz	RS6417
15 号手术刀片	McKesson	1642
无纺布海绵	McKesson	446036
耳镜	Welch Allyn	23862
氧气	Airgas Healthcare	UN1072
脉搏血氧仪	Nonin Medical	2500A VET
钝性牵开器，4x4	Roboz	RS6524
啮齿类动物手术监护仪	Indus Instruments	113970	集成平台可用于生命体征监测和术中保温
电子天平	Salter Brecknell	LPS 150
手术刀柄	Roboz	RS9843
丝线缝合线 3-0	McKesson	220263
小动物麻醉系统	Ohio Medical	AKDL03882
无菌生理盐水（0.9%）	Baxter	281322
外科口罩	McKesson	188696
手术帽	McKesson	852952
外科手套	McKesson	854486
10 mL 注射器	McKesson	1031801
1 mL 注射器	McKesson	1031817
超高频探头	Fujifilm Visualsonics	MS250
超声耦合剂	McKesson	150690
VEVO 超声系统	Fujifilm Visualsonics	VEVO 2100