利用大分子拥挤效应构建人皮肤增生性瘢痕的体外模型

摘要

本方案描述了利用大分子拥挤效应构建体外人增生性瘢痕组织模型的方法，该模型可模拟体内环境。在大分子拥挤的环境中培养时，人皮肤成纤维细胞会表现出类似于瘢痕组织的表型、生物化学特性、生理特征及功能特性。

摘要

研究表明，体内组织中存在大量蛋白质、核酸、核糖核蛋白、多糖等物质，环境高度拥挤。以下实验方案采用大分子拥挤（MMC）技术，通过向体外细胞培养体系中添加中性聚合物（拥挤剂），模拟这种生理性的拥挤环境。既往研究显示，使用Ficoll或葡聚糖作为拥挤剂时，WI38和WS-1细胞系中I型胶原和纤连蛋白的表达水平均显著增强。然而，该技术尚未在原代增生性瘢痕来源的人皮肤成纤维细胞（hHSFs）中得到验证。由于增生性瘢痕的形成源于胶原的过度沉积，本方案旨在将MMC技术应用于hHSFs，构建富含胶原的体外增生性瘢痕模型。研究表明，与传统的二维（2-D）细胞培养系统相比，该优化后的MMC模型与体内瘢痕组织具有更高的相似性。此外，该模型相较于动物模型更具成本效益、节省时间，且更符合伦理要求。因此，本文报道的优化模型为增生性瘢痕相关研究提供了一种先进的“类体内”研究平台。

引言

瘢痕组织代表了组织修复的最终阶段。然而，在许多个体中，尤其是遭受烧伤或创伤的患者¹，瘢痕可能过度形成，对愈合后皮肤的形态和功能产生不良影响。尽管病理性瘢痕（增生性瘢痕和瘢痕疙瘩）形成的精确机制尚未完全阐明，但已证实伤口愈合过程中胶原蛋白的过度沉积是其形成的关键因素之一²。

已有充分证据表明，转化生长因子β1（TGF-β1）和α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）在增生性瘢痕的形成过程中发挥关键作用。研究表明，升高的TGF-β1可通过调控SMAD信号通路，直接促进胶原蛋白的过度沉积³。此外，αSMA被发现可通过调节伤口愈合过程中的细胞收缩和再上皮化，参与增生性瘢痕的形成⁴。目前缺乏合适的体外和体内模型，是开发和评估瘢痕修复干预措施及疗法的主要障碍。本研究旨在利用现有的MMC技术，构建一种“类体内”增生性瘢痕模型，以适用于评估新型及新兴的瘢痕相关干预手段。

在体外复制活体组织一直是科学界多年来的目标。20世纪早期体外技术的发展在一定程度上实现了这一目标。目前的体外技术相较于Roux最初证明胚胎细胞可在温热的生理盐水中体外存活数天的实验已有轻微改进⁵。然而，现有的体外方法大多局限于在二维条件下培养单一细胞类型，无法准确模拟体内组织的真实情况。尽管这些方法在研究细胞生物化学、生理学和遗传学方面具有价值，但天然组织是三维结构，并包含多种细胞类型。简单的二维体外系统使哺乳动物细胞处于高度人工的环境中，导致天然组织特异性的结构丧失⁶。这反过来影响了细胞内和细胞外的各种事件，导致细胞形态、生理功能和行为出现异常⁷。

本方案的意义在于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的发病机制研究及其临床管理。尽管已明确真皮成纤维细胞是瘢痕组织中大量胶原蛋白生成的主要原因，但使用二维体外培养系统培养真皮成纤维细胞时，无法重现体内所观察到的胶原蛋白代谢过程⁸。目前的体外培养方法仍基本采用“温盐水”环境，这种环境与活体组织的实际环境完全不同。体内组织具有极高的分子拥挤度，蛋白质、核酸、核糖核蛋白和多糖等大分子物质占总体积的5%–40%。由于任意两个分子不能同时占据同一空间，因此可用的自由空间极少，几乎不存在游离水⁹。

MMC 技术施加的限制会影响细胞质和间质液体的热力学性质。分子相互作用、受体-配体信号复合物、酶以及细胞器均受到空间限制，无法自由相互作用⁹。细胞周围环境（即间质）中的相互作用也同样受到限制。最近的研究证据表明，拥挤溶液中高浓度的惰性大分子会干扰扩散、物理结合、黏度以及流体动力学性质¹⁰。

有趣的是，几种常用的拥挤剂（如Ficoll、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮[PVP]和聚苯乙烯磺酸钠[PSS]）在应用于不同细胞类型和不同实验条件时并不等效。在之前的一项研究中，Ficoll被报道对间充质干细胞的细胞毒性低于PVP。该结果被认为归因于Ficoll的中性电荷及其相对较小的流体动力学半径¹¹。相比之下，另一项研究发现，与Ficoll相比，葡聚糖在促进人肺成纤维细胞沉积I型胶原方面更为有效¹²。我们自己的研究数据表明，Ficoll可增强增生性瘢痕来源成纤维细胞的胶原沉积，而PVP对这些细胞具有毒性¹³。

已有研究表明，在高度拥挤的体内环境中，前胶原向胶原的转化速度更快¹⁴，而在稀释的二维培养体系中，生物反应速率则会延迟¹⁵。本文优化了体外实验方案，引入MMC（甲基纤维素基质），以展示真皮成纤维细胞的培养，从而构建更接近“体内状态”的皮肤纤维化及瘢痕形成模型。与常规的二维培养体系相比，采用MMC培养人瘢痕成纤维细胞（hHSFs）可显著促进胶原的生物合成与沉积¹³。值得注意的是，在该优化的MMC方案下，纤维化的其他特征（如基质金属蛋白酶[MMPs]和促炎性细胞因子的表达增加）也明显呈现¹³。使用该方法培养时，真皮细胞可重现体内所测得的生理、生化及功能参数。

优化的MMC体外实验方案已被用于评估从增生性瘢痕真皮及未受累邻近真皮分离的成纤维细胞表达胶原蛋白及其他细胞外基质蛋白的情况。当在体外MMC环境中培养时，观察到人增生性瘢痕成纤维细胞（hHSFs）表现出某些与体内增生性瘢痕组织相似的特征（如mRNA、生物化学、生理学和表型）。证据表明，在选择拥挤剂及优化体外培养MMC条件时，物理和化学性质是需要重点考虑的因素。

为验证原理，本研究应用体外微管聚集（MMC）实验方案，对紫草素及其类似物诱导细胞凋亡的能力进行定性和定量评估。这有助于评价这些源自中药的天然化合物在皮肤瘢痕管理中的潜在应用价值¹³。此外，该体外MMC实验方案具有操作简便、成本低廉和时效性高的优点，符合欧盟指令2010/63/EU以及美国环境保护署（EPA）关于减少哺乳动物实验的最新法规要求。

方案

1. 细胞培养

1. 在含有10%胎牛血清（FCS）和1%（v/v）青霉素/链霉素溶液（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37°C、5% CO₂/95%空气的培养箱中培养人硬皮病成纤维细胞（hHSFs）以及来源于非病理性组织的正常皮肤成纤维细胞（hNSFs）。
2. 从相应公司购买Ficoll 70、Ficoll 400和抗坏血酸。

2. MMC 增生性瘢痕模型的构建

1. 将 hHSFs 或 hNSFs（每孔 50,000 个）接种至 24 孔板中，每孔加入 1 mL 培养基。
2. 置于 37°C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养。
3. 制备 MMC 培养基。根据实验所需的总体积，通过混合 Ficoll 70（18.75 mg/mL）、Ficoll 400（12.5 mg/mL）和抗坏血酸（100 μM）配制含 10% FCS 的 DMEM 培养基。
4. 将混合液置于 37°C 水浴中 1 小时，使拥挤试剂充分溶解于溶液中，然后使用 0.2 μm 滤器对 MMC 培养基进行除菌过滤。
5. 吸除旧培养基，更换为新配制的 MMC 培养基。
6. 在 37°C、5% CO₂ 条件下继续培养细胞 6 天，每 3 天更换一次培养基。

3. 胶原蛋白总量的表达

1. 配制天狼星红溶液（0.1% w/v）。将 0.2 g 直接红 80 粉末溶于 200 mL 去离子蒸馏水（ddH₂O）中，并加入 1 mL 冰醋酸。
2. 吸除 MMC 培养基，每孔加入 300 μL 天狼星红溶液，于 37 °C 孵育 90 分钟。
3. 用自来水轻轻冲洗天狼星红溶液，将培养板置于空气中过夜晾干。
4. 每孔加入 200 μL 氢氧化钠溶液（0.1 M），以提取染色的天狼星红。将培养板置于摇床中振荡 5–10 分钟，充分提取天狼星红染料。
5. 取 100 μL 提取液转移至 96 孔透明板中，使用酶标仪在 620 nm 波长处测定吸光度。

4. 胶原蛋白I的表达（免疫染色）

1. 使用 200 μL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.35）洗涤各孔。
2. 加入甲醇（500 μL/孔），在 4 °C 下固定细胞 10 分钟。
3. 用 3% 牛血清白蛋白在室温（RT）下封闭非特异性结合位点，孵育 30 分钟。
4. 吸除封闭液，每孔加入 200 μL 抗胶原蛋白 I 抗体（10 μg/mL），在室温下孵育 90 分钟。
5. 吸除一抗溶液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
6. 每孔加入 200 μL 羊抗兔 FITC 标记二抗（1:400 稀释）和 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；1:2000 稀释），在室温下孵育 30 分钟。用铝箔包裹培养板以避光。
7. 弃去二抗和 DAPI 溶液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
8. 直接在显微镜下观察荧光染色结果。

5. 蛋白质印迹

1. 用 PBS 洗涤细胞 2 次。
2. 向每个孔中加入 40 μL 裂解缓冲液，并用移液器枪头刮取细胞层。裂解缓冲液包含 RIPA 缓冲液、蛋白酶抑制剂混合物（PIC）、2 mM 钒酸钠和 10 mM 氟化钠。
3. 将蛋白裂解物转移至微量离心管中，并按照制造商说明书使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度¹⁶。
4. 每组上样 10 μg 蛋白至 4%–12% Bis-Tris 蛋白凝胶的加样孔中。在 200 V 条件下进行 SDS-PAGE 电泳 30 分钟。
5. 通过湿转法在 90 V 条件下电转 90 分钟，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。避免凝胶与硝酸纤维素膜之间产生气泡。
6. 用 10 mL 封闭缓冲液封闭膜。
7. 在 4°C 下与一抗孵育过夜。所用一抗包括：抗胶原 I 抗体、抗胶原 III 抗体、抗胶原 IV 抗体、抗 αSMA 抗体、抗 MMP-1 抗体、抗 MMP-2 抗体、抗 MMP-9 抗体、抗 MMP-13 抗体以及抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体。
8. 用 0.1% TBS-Tween 20 洗涤膜（每次 5 分钟，共 5 次）。TBS/Tween 20（1 L）的配制如下：1 M Tris（pH = 7.4）50 mL、5 M 氯化钠 30 mL、Tween 20 1 mL 和 ddH₂O 920 mL。
9. 在室温下与对应种属的二抗孵育 1 小时。
10. 重复步骤 5.8，并使用成像系统检测荧光信号。

6. 逆转录 PCR

1. 使用RNA提取试剂盒中包含的与2-巯基乙醇混合的裂解缓冲液收集总RNA。
2. 按照制造商说明书进行RNA纯化¹⁷。
3. 使用微量分光光度计测定RNA浓度。
4. 按照cDNA合成试剂盒的制造商说明书进行第一链cDNA合成。
5. 定制的96孔板中已预先包被RT-PCR寡核苷酸引物。将100 ng的cDNA样品与10 μL SYBR Green预混液混合加入定制板中。
6. 用ddH₂O将每孔总体积补至20 μL。
7. 按照制造商说明书使用热循环仪运行RT-PCR：98°C变性15秒，60°C退火/延伸60秒，共40个循环。RT-PCR检测的基因包括：COL1A1、COL3A1、ACTA2、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD7、IL1A、IL1B、IL6、IL8、MMP1、MMP2、MMP3、TGFB1和VEGF。

结果

每个实验均设置三份重复样本，并使用来自三位不同患者的细胞重复实验三次。数据以对照组的百分比表示。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）及 Tukey 事后检验分析统计学差异（*p ˂ 0.05）。

使用9%体积占有率（FVO）Ficoll进行MMC可增强人眼小梁细胞（hHSF）中总胶原及胶原蛋白I的沉积量¹³如图所示 图1A与使用PVP的对照组和MMC相比，hHSFs在9%和18% FVO条件下经Ficoll培养后细胞密度显著增加。 图1B，C 表明，在9% FVO条件下，Ficoll显著增强了胶原蛋白（包括I型胶原）的沉积，优于其他MMC配方。定量分析（图1D，E进一步证明，Ficoll（终体积分数为9%）在促进胶原沉积方面效果最为显著。

讨论

本方案旨在优化并验证一种改进的体外“疤痕培养皿”模型，用于人皮肤瘢痕组织的研究。既往研究已报道将大分子拥挤技术（MMC）应用于人肺成纤维细胞¹²、人骨髓间充质干细胞²³以及人真皮成纤维细胞²³，所用拥挤剂包括葡聚糖¹²、菲可尔（Ficoll）¹²和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）²³。在本研究中，采用菲可尔（Ficoll）或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为拥挤剂，对先前发表的来源于增生性瘢痕的人皮肤成纤维细胞培养方案进行了优化。

大分子拥挤剂的选择及其浓度是关键参数，因为不同拥挤剂不会产生等效的结果。先前有研究报道，PVP40（18% FVO）和 PVP360（54% FVO）可显著促进真皮成纤维细胞中胶原蛋白的沉积和细胞增殖²³（FVO 超过>54% 时...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 μm 滤膜	Sartorius	16534
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Thermo Fisher Scientific	P36962
Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific	A-21076
Alexa Fluor 800	Thermo Fisher Scientific	A-11371
α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）一抗	Abcam	ab5694
Applied Biosystems 7500 快速实时荧光定量 PCR 系统（PCR 仪）	Thermo Fisher Scientific	4351106
抗坏血酸	Wako	#013-12061
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	#A2153
Bradford 蛋白检测试剂盒	Bio-Rad	500-0006
I 型胶原一抗（用于免疫染色）	Abcam	6308
I 型胶原一抗（用于 Western blot）	Abcam	ab21286
III 型胶原一抗	Abcm	ab7778
IV 型胶原一抗	Abcam	ab6586
直接红 80	Sigma-Aldrich	2610108
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies	11996-065
胎牛血清（FCS）	Life Technologies	6000-044
Ficoll 400	GE HealthCare	#17-0300-10
Ficoll 70	GE HealthCare	#17-0310-10
GAPDH 一抗	Sigma-Aldrich	G8795
山羊抗兔二抗	Abcam	ab97050
人增生性瘢痕/正常成纤维细胞（hHSF/hNSF）	Cell Research Corporation	106, 107, 108
iScript cDNA 合成试剂盒	Bio-Rad	#1708890
MMP-1 一抗	Abcam	ab38929
MMP-13 一抗	Abcam	ab39012
MMP-2 一抗	Abcam	ab37150
MMP-9 一抗	Abcam	ab38898
NanoDrop 微量分光光度计	Thermo Fisher Scientific	N/A
硝酸纤维素膜	Bio-Rad	10484060
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX
Odyssey 封闭缓冲液	LI-COR Biosciences	927–40000
Odyssey Fc 成像系统	LI-COR Biosciences	N/A
Olympus IX-81 高内涵筛选显微镜（用于免疫染色）	Olympus	N/A
青霉素/链霉素溶液（P/S）	Life Technologies	15140-122
PrimePCR 检测试剂	Bio-Rad		根据需求定制引物，预包被于 96 孔板
蛋白酶抑制剂混合物（PIC）	Sigma-Aldrich	11697498001
PVP 360	Sigma	#PVP360
PVP 40	Sigma	#PVP40
RIPA 裂解缓冲液	Merck	R0278
RNeasy Plus Mini 试剂盒	QIAGEN	#74134
钒酸钠	Sigma-Aldrich	450022
钒酸钠	Sigma-Aldrich	450243
SpectraMax M5 多功能微孔板读数仪	Molecular Devices	N/A
SsoAdvanced 通用 SYBR Green 超级混合液	Bio-Rad	#172-5270
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416