利用大分子拥挤效应构建人皮肤增生性瘢痕的体外模型

摘要

本方案描述了利用大分子拥挤效应构建体外人增生性瘢痕组织模型的方法，该模型可模拟体内环境。在大分子拥挤的环境中培养时，人皮肤成纤维细胞会表现出类似于瘢痕组织的表型、生物化学特性、生理特征及功能特性。

摘要

研究表明，体内组织中存在大量蛋白质、核酸、核糖核蛋白、多糖等物质，环境高度拥挤。以下实验方案采用大分子拥挤（MMC）技术，通过向体外细胞培养体系中添加中性聚合物（拥挤剂），模拟这种生理性的拥挤环境。既往研究显示，使用Ficoll或葡聚糖作为拥挤剂时，WI38和WS-1细胞系中I型胶原和纤连蛋白的表达水平均显著增强。然而，该技术尚未在原代增生性瘢痕来源的人皮肤成纤维细胞（hHSFs）中得到验证。由于增生性瘢痕的形成源于胶原的过度沉积，本方案旨在将MMC技术应用于hHSFs，构建富含胶原的体外增生性瘢痕模型。研究表明，与传统的二维（2-D）细胞培养系统相比，该优化后的MMC模型与体内瘢痕组织具有更高的相似性。此外，该模型相较于动物模型更具成本效益、节省时间，且更符合伦理要求。因此，本文报道的优化模型为增生性瘢痕相关研究提供了一种先进的“类体内”研究平台。

引言

瘢痕组织代表了组织修复的最终阶段。然而，在许多个体中，尤其是遭受烧伤或创伤的患者¹，瘢痕可能过度形成，对愈合后皮肤的形态和功能产生不良影响。尽管病理性瘢痕（增生性瘢痕和瘢痕疙瘩）形成的精确机制尚未完全阐明，但已证实伤口愈合过程中胶原蛋白的过度沉积是其形成的关键因素之一²。

已有充分证据表明，转化生长因子β1（TGF-β1）和α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）在增生性瘢痕的形成过程中发挥关键作用。研究表明，升高的TGF-β1可通过调控SMAD信号通路，直接促进胶原蛋白的过度沉积³。此外，αSMA被发现可通过调节伤口愈合过程中的细胞收缩和再上皮化，参与增生性瘢痕的形成⁴。目前缺乏合适的体外和体内模型，是开发和评估瘢痕修复干预措施及疗法的主要障碍。本研究旨在利用现有的MMC技术，构建一种“类体内”增生性瘢痕模型，以适用于评估新型及新兴的瘢痕相关干预手段。

在体外复制活体组织一直是科学界多年来的目标。20世纪早期体外技术的发展在一定程度上实现了这一目标。目前的体外技术相较于Roux最初证明胚胎细胞可在温热的生理盐水中体外存活数天的实验已有轻微改进⁵。然而，现有的体外方法大多局限于在二维条件下培养单....

方案

1. 细胞培养

1. 在含有10%胎牛血清（FCS）和1%（v/v）青霉素/链霉素溶液（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37°C、5% CO₂/95%空气的培养箱中培养人硬皮病成纤维细胞（hHSFs）以及来源于非病理性组织的正常皮肤成纤维细胞（hNSFs）。
2. 从相应公司购买Ficoll 70、Ficoll 400和抗坏血酸。

2. MMC 增生性瘢痕模型的构建

1. 将 hHSFs 或 hNSFs（每孔 50,000 个）接种至 24 孔板中，每孔加入 1 mL 培养基。
2. 置于 37°C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养。
3. 制备 MMC 培养基。根据实验所需的总体积，通过混合 Ficoll 70（18.75 mg/mL）、Ficoll 400（12.5 mg/mL）和抗坏血酸（100 μM）配制含 10% FCS 的 DMEM 培养基。
4. 将混合液置于 37°C 水浴中 1 小时，使拥挤试剂充分溶解于溶液中，然后使用 0.2 μm 滤器对 MMC 培养基进行除菌过滤。
5. 吸除旧培养基，更换为新配制的 MMC 培养基。
6. 在 37°C、5% CO₂ 条件下继续培养细胞 6 天，每 3 天更换一次培养基。

结果

每个实验均设置三份重复样本，并使用来自三位不同患者的细胞重复实验三次。数据以对照组的百分比表示。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）及 Tukey 事后检验分析统计学差异（*p ˂ 0.05）。

使用9%体积占有率（FVO）Ficoll进行MMC可增强人眼小梁网细胞中总胶原蛋白及胶原蛋白I的沉积量¹³如图所示 图1A与使用PVP的对照组和MMC相比，hHSFs在9%和18% FVO条件下经Ficoll培养后细胞密度显著增加。 图1B，C 表明，在9% FVO条件下，Ficoll显著增强了胶原蛋白（包括I型胶原）的沉积，优于其他MMC配方。定量分析（图1D，E进一步证明，Ficoll（终体积分数为9%）在促进胶原沉积方面效果最为显著。

讨论

本方案旨在优化并验证一种改进的体外“疤痕培养皿”模型，用于人皮肤瘢痕组织的研究。既往研究已报道将大分子拥挤技术（MMC）应用于人肺成纤维细胞¹²、人骨髓间充质干细胞²³以及人真皮成纤维细胞²³，所用拥挤剂包括葡聚糖¹²、菲可尔（Ficoll）¹²和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）²³。在本研究中，采用菲可尔（Ficoll）或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为拥挤剂，对先前发表的来源于增生性瘢痕的人皮肤成纤维细胞培养方案进行了优化。

大分子拥挤剂的选择及其浓度是关键参数，因为不同拥挤剂不会产生等效的结果。先前有研究报道，PVP40（18% FVO）和 PVP360（54% FVO）可显著促进真皮成纤维细胞中胶原蛋白的沉积和细胞增殖²³（FVO 超过>54% 时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 μm 滤膜	Sartorius	16534
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Thermo Fisher Scientific	P36962
Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific	A-21076
Alexa Fluor 800	Thermo Fisher Scientific	A-11371
α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）一抗	Abcam	ab5694
Applied Biosystems 7500 快速实时荧光定量 PCR 系统（PCR 仪）	Thermo Fisher Scientific	4351106
抗坏血酸	Wako	#013-12061
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	#A2153
Bradford 蛋白检测试剂盒	Bio-Rad	500-0006
I 型胶原一抗（用于免疫染色）	Abcam	6308
I 型胶原一抗（用于 Western blot）	Abcam	ab21286
III 型胶原一抗	Abcm	ab7778
IV 型胶原一抗	Abcam	ab6586
直接红 80	Sigma-Aldrich	2610108
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies	11996-065
胎牛血清（FCS）	Life Technologies	6000-044
Ficoll 400	GE HealthCare	#17-0300-10
Ficoll 70	GE HealthCare	#17-0310-10
GAPDH 一抗	Sigma-Aldrich	G8795
山羊抗兔二抗	Abcam	ab97050
人增生性瘢痕/正常成纤维细胞（hHSF/hNSF）	Cell Research Corporation	106, 107, 108
iScript cDNA 合成试剂盒	Bio-Rad	#1708890
MMP-1 一抗	Abcam	ab38929
MMP-13 一抗	Abcam	ab39012
MMP-2 一抗	Abcam	ab37150
MMP-9 一抗	Abcam	ab38898
NanoDrop 微量分光光度计	Thermo Fisher Scientific	N/A
硝酸纤维素膜	Bio-Rad	10484060
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX
Odyssey 封闭缓冲液	LI-COR Biosciences	927–40000
Odyssey Fc 成像系统	LI-COR Biosciences	N/A
Olympus IX-81 高内涵筛选显微镜（用于免疫染色）	Olympus	N/A
青霉素/链霉素溶液（P/S）	Life Technologies	15140-122
PrimePCR 检测试剂	Bio-Rad		根据需求定制引物，预包被于 96 孔板
蛋白酶抑制剂混合物（PIC）	Sigma-Aldrich	11697498001
PVP 360	Sigma	#PVP360
PVP 40	Sigma	#PVP40
RIPA 裂解缓冲液	Merck	R0278
RNeasy Plus Mini 试剂盒	QIAGEN	#74134
钒酸钠	Sigma-Aldrich	450022
钒酸钠	Sigma-Aldrich	450243
SpectraMax M5 多功能微孔板读数仪	Molecular Devices	N/A
SsoAdvanced 通用 SYBR Green 超级混合液	Bio-Rad	#172-5270
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416