一种简化的反向遗传学方法用于拯救表达报告蛋白的重组轮状病毒

摘要

通过质粒DNA拯救重组轮状病毒，为研究轮状病毒的复制机制、致病过程以及开发轮状病毒表达载体和疫苗提供了重要工具。本文介绍一种简化的反向遗传学方法，用于生成重组轮状病毒，包括表达荧光报告蛋白的病毒株。

摘要

轮状病毒是一类庞大且不断进化的分段双链RNA病毒，可导致多种哺乳动物和禽类宿主（包括人类）幼体发生严重胃肠炎。随着轮状病毒反向遗传学系统的近期建立，现已能够利用定向诱变技术研究轮状病毒生物学特性，改进和优化现有的轮状病毒疫苗，并开发多靶点轮状病毒疫苗载体。本报告中，我们描述了一种简化的反向遗传学系统，可高效、可靠地拯救重组轮状病毒。该系统基于将表达全长轮状病毒(+)RNA的T7转录载体与编码RNA加帽酶的CMV载体共同转染至稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK细胞（BHK-T7）。通过在转染后的BHK-T7细胞中过量接种MA104细胞（一种对病毒增殖高度敏感的猴肾细胞系），可实现重组轮状病毒的扩增。本报告还介绍了一种通过在基因组第7节段（NSP3）中插入2A翻译终止-重启元件，使重组轮状病毒表达独立荧光报告蛋白的方法。该方法无需删除或修改任何病毒开放阅读框，因而可在表达荧光蛋白的同时，保持所有病毒蛋白的完整功能。

引言

轮状病毒是导致婴幼儿以及许多其他哺乳动物和禽类幼体严重胃肠炎的主要原因¹。作为呼肠孤病毒科（Reoviridae）的成员，轮状病毒具有分段的双链RNA（dsRNA）基因组。这些基因组片段被包裹在无包膜的二十面体病毒颗粒中，该病毒颗粒由三层同心的蛋白质结构组成²。根据基因组片段的测序和系统发育分析，目前已定义了九种轮状病毒物种（A−D、F−J）³。其中，轮状病毒A种的毒株导致了绝大多数人类感染病例⁴。在过去十年中，随着轮状病毒疫苗被纳入儿童免疫规划，轮状病毒相关的死亡率和发病率显著下降。尤为显著的是，与轮状病毒相关的儿童死亡人数已从2000年的约528,000例减少至2016年的128,500例^4,5。轮状病毒疫苗由减毒活病毒株制成，通常在婴儿6月龄前接种2至3剂。由于在人类及其他哺乳动物中传播的轮状病毒存在大量遗传多样性，并且该病毒可通过突变和基因重配迅速进化，可能导致感染儿童的轮状病毒类型发生抗原性改变^6,7,8。此类变化可能削弱现有疫苗的有效性，因而需要对疫苗进行更新或改良。

仅在最近才实现了基于完全质粒的反向遗传学系统，该系统能够对轮状病毒11个基因组片段中的任意一个进行操作⁹。随着这些系统的出现，现已有可能揭示轮状病毒复制和致病机制的分子细节，开发更高效的高通量抗轮状病毒化合物筛选方法，并研制出新型且可能更有效的轮状病毒疫苗。在轮状病毒复制过程中，带有帽子结构的病毒（+）RNA不仅指导病毒蛋白的合成，还作为子代双链RNA基因组片段合成的模板^10,11。迄今为止报道的所有轮状病毒反向遗传学系统均依赖于将T7转录载体转染到哺乳动物细胞系中，以提供用于拯救重组病毒的cDNA来源的（+）RNA^9,12,13。在这些转录载体中，全长病毒cDNA被置于上游T7启动子和下游乙型肝炎delta病毒（HDV）核酶之间，使得T7 RNA聚合酶合成的病毒（+）RNA具有真实的5’和3’末端（图1A）。在第一代反向遗传学系统中，通过将11个T7（pT7）转录载体以及三个由CMV启动子驱动的表达质粒共转染至表达T7 RNA聚合酶的幼仓鼠肾细胞（BHK-T7）中来构建重组病毒；这三个表达质粒分别编码禽类呼肠孤病毒p10FAST融合蛋白，以及痘苗病毒D1R-D12L加帽酶复合物的两个亚基⁹。在转染的BHK-T7细胞中生成的重组SA11病毒随后通过接种MA104细胞进行扩增，该细胞系支持轮状病毒的生长。已有研究报道了一种改进的第一代反向遗传学系统，不再使用辅助质粒¹²。该改进系统仅通过将11个SA11 T7转录载体转染BHK-T7细胞即可成功生成重组轮状病毒，但需注意的是，编码病毒工厂（即病毒质，viroplasm）结构组分（非结构蛋白NSP2和NSP5）的载体用量需比其他载体高出3倍^14,15。此外，还已开发出支持拯救人源轮状病毒KU株和Odelia株的反向遗传学系统的改良版本^16,17。轮状病毒基因组在反向遗传学操作中表现出极高的可塑性，迄今已成功构建出在VP4¹⁸、NSP1⁹、NSP2¹⁹、NSP3^20,21以及NSP5^22,23中引入突变的重组病毒。迄今为止构建的最有用的病毒之一是经基因工程改造后可表达荧光报告蛋白（FPs）的病毒^{9,12,21,24,25}。

在本出版物中，我们提供了在实验室中用于生成 SA11 轮状病毒重组毒株的反向遗传学系统操作方案。本方案的关键步骤是将 11 个 pT7 转录载体（经修饰，其中 pT7/NSP2SA11 和 pT7/NSP5SA11 载体的用量为其他载体的 3 倍）与一个编码非洲猪瘟病毒（ASFV）NP868R 加帽酶的 CMV 表达载体共同转染至 BHK-T7 细胞中²¹ (图2）。在我们实验中，NP868R 质粒的存在可使转染的 BHK-T7 细胞产生更高滴度的重组病毒。本文还提供了一种修饰 pT7/NSP3SA11 质粒的方案，使得所生成的重组病毒不仅表达第 7 节段蛋白产物 NSP3，还能同时表达一个独立的荧光蛋白（FP）。该方法通过重新设计 pT7/NSP3SA11 质粒中的 NSP3 开放阅读框（ORF），在其下游插入一个 2A 翻译终止-重启元件，随后连接一个 FP 的开放阅读框（ORF）来实现图1B)^24,26通过该方法，我们已成功构建出表达多种荧光蛋白的重组轮状病毒：UnaG（绿色）、mKate（远红）、mRuby（红色）、TagBFP（蓝色）、CFP（青色）和YFP（黄色）。^24,27,28这些表达荧光蛋白的轮状病毒在构建时未删除 NSP3 ORF，因此产生的病毒预计可编码一套完整的功能性病毒蛋白。

方案

1. 培养基制备与细胞培养维护

1. 获取稳定表达T7 RNA聚合酶的幼年仓鼠肾细胞（BHK-T7）以及非洲绿猴肾MA104细胞。
   注意：BHK-T7（或BSR-T7）细胞未商业化供应，但为使用反向遗传学研究RNA病毒生物学的实验室中常用的细胞系。本方案所用的BHK-T7细胞系由美国国立卫生研究院（美国马里兰州贝塞斯达，Ursula J. Buchholz博士）提供，该博士是最初表达T7 RNA聚合酶的BHK细胞系的共同开发者²⁹。MA104细胞可从欧洲认证细胞库（ECACC）和美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得。
2. 在无菌环境中（最好在II级生物安全柜中）配制以下培养基。将培养基避光保存于4 °C，并在使用前立即升温至37 °C。
   注意：培养基成分的来源见材料表。
   1. 配制不完全DMEM培养基：将500 mL含4.5 g/L葡萄糖和1%谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔最低必需培养基（MEM）与5 mL 100倍青霉素-链霉素溶液（100x pen-strep）混合。
   2. 配制完全DMEM培养基：将500 mL不完全DMEM培养基与25 mL胎牛血清（FBS）混合。
   3. 配制不完全GMEM培养基：将500 mL格拉斯哥最低必需培养基、5 mL 100倍谷氨酰胺、50 mL胰蛋白胨磷酸盐肉汤（TPB）、5 mL 100倍非必需氨基酸（NEAA）和5 mL 100倍青霉素-链霉素溶液混合。
   4. 配制完全GMEM培养基：将500 mL不完全GMEM培养基与25 mL热灭活胎牛血清（FBS）混合。
   5. 配制GMEM+G完全培养基：向500 mL完全GMEM培养基中加入10 mL浓度为50 mg/mL的遗传霉素（G418）。
   6. 配制不完全SMEM培养基：将500 mL乔克力克改良伊格尔MEM、5 mL 100倍谷氨酰胺、50 mL TPB、5 mL 100倍非必需氨基酸（NEAA）和5 mL 100倍青霉素-链霉素溶液混合。
3. 将MA104细胞培养于分别含有12 mL或25 mL完全DMEM培养基的T75或T175培养瓶中。当MA104细胞达到100%汇合时，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞单层2次，用含0.05%胰蛋白酶和0.1% EDTA的溶液消化，并用5 mL（T75培养瓶）或10 mL（T175培养瓶）不完全DMEM培养基重悬细胞。
   1. 取0.5−1.0 mL重悬细胞接种至新的培养瓶中，并添加完全DMEM培养基至适当终体积。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。
4. 将BHK-T7细胞在T75培养瓶中传代培养，每次传代交替使用完全GMEM和GMEM+G完全培养基。当BHK-T7细胞达到100%汇合时，用PBS冲洗细胞单层2次，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化，并用5 mL培养基重悬细胞。 
   1. 在新的T75培养瓶中加入15 mL完全GMEM或GMEM+G培养基，然后加入四滴重悬的BHK-T7细胞。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。

2. 质粒制备

1. 从 Addgene 获取以下表达轮状病毒 SA11 正链 RNA 的质粒：pT7/VP1SA11、pT7/VP2SA11、pT7/VP3SA11、pT7/VP4SA11、pT7/VP6SA11、pT7/VP7SA11、pT7/NSP1SA11、pT7/NSP2SA11、pT7/NSP3SA11、pT7/NSP4SA11 和 pT7/NSP5SA11。从作者处获取表达非洲猪瘟病毒（ASFV）加帽酶的质粒（pCMV/NP868R）²¹。
   注意：经改造后可通过 2A 翻译元件活性表达荧光蛋白（FP）的 pT7/NSP3SA11 质粒（pT7/NSP3-2A-3xFL-FP）也可向作者索取^24,26。目前可提供的 pT7/NSP3-2A-3xFL-FP 质粒所表达的荧光蛋白包括：UnaG（绿色）、mKate（远红）、mRuby（红色）、TagBFP（蓝色）、CFP（青色）和 YFP（黄色）²⁴。
2. 将质粒转化至感受态 E. coli DH5α 中，并将菌液涂布于含相应抗生素的 LB 琼脂平板上。挑取单克隆菌落进行培养，按照制造商说明书使用离心柱式质粒小提纯化试剂盒（材料表）提取少量质粒（20 µg）。使用中提和大提纯化试剂盒（材料表）从大量菌液中提取较大量的质粒 DNA。
   注意：适用于反向遗传系统的质粒也可使用其他质粒纯化试剂盒制备。无需使用专门设计用于制备无内毒素质粒的试剂盒。
3. 用无核酸酶分子生物学级水将纯化后的质粒浓度调整至 1 mg/mL。使用分光光度计检测质粒纯度，确认其 A260/A280 吸光度比值约为 1.8。同时，通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳验证质粒主要以超螺旋形式存在。
4. 将纯化的质粒分装至 0.5 mL 无菌微量离心管中，每管含 10 µL。于 -80 °C 保存质粒。

3. 重组病毒的制备

注意：人类和动物轮状病毒的研究，包括重组轮状病毒株的构建与鉴定，必须在生物安全二级（BSL-2）条件下进行，并需事先获得机构生物安全委员会（IBC）的批准。适当的BSL-2实验室条件在下文中有详细描述 微生物学和生物医学实验室生物安全 （由美国疾病控制与预防中心（CDC）发布的《生物安全微生物和生物医学实验室指南》（BMBL））³⁰.

1. 第1天：将BHK-T7细胞接种至12孔板
   1. 用 PBS 冲洗 T75 培养瓶中新鲜汇合的 BHK-T7 细胞单层 2 次。用胰蛋白酶-EDTA 溶液消化细胞单层，并将细胞重悬于 5 mL GMEM 完全培养基中。
   2. 使用自动细胞计数仪和台盼蓝溶液测定培养基中BHK-T7细胞的活细胞浓度。将细胞接种至12孔细胞培养板中，每孔接种量为2 × 10⁵个细胞。⁵ 1 mL GMEM（不含G418）完全培养基中，37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 培养箱中培养。细胞应在第2天达到80−90%汇合度。
2. 第2天：用质粒混合物转染BHK-T7细胞
   1. 准备质粒混合物时，在一个0.5 mL微量离心管中加入以下组分（质粒储备液浓度调整为1 mg/mL）：SA11 pT7质粒VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7、NSP1、NSP3和NSP4各0.8 µL，SA11 pT7质粒NSP2和NSP5各2.4 µL，以及pCMV/NP868R 0.8 µL。轻轻敲击管壁混匀质粒，并通过瞬时离心收集管壁液体。为制备表达荧光蛋白（FP）的重组病毒，需用相应的pT7/NSP3-2A-3xFL-FP质粒替换pT7/NSP3SA11质粒。
      注意：质粒混合物应置于冰上保存，直至使用。每次转染应准备单独的离心管。
   2. 为制备质粒/低血清培养基/转染试剂混合物：加入110 µL预热（37 °C）的低血清培养基（材料表) 加入每种质粒混合物中，轻轻吹打混匀。随后，加入 32 µL 转染试剂（材料表将转染试剂各 2.5 µL 加入每份质粒/低血清培养基混合物中，使混合物中转染试剂的终浓度为每微克质粒 2.5 µL。轻轻涡旋混匀，室温孵育 20 分钟。
   3. 在20分钟孵育期间，用2 mL不完全GMEM培养基将12孔板中的BHK-T7细胞（第1天制备）洗涤一次。随后，向每孔加入1 mL不完全SMEM培养基，并将培养板放回培养箱中。
   4. 孵育20分钟后，使用200 µL移液器将质粒/减血清培养基/转染混合物逐滴加入12孔板的每孔中。轻轻摇动培养板，然后放回37 °C、5% CO₂培养箱中₂ 培养箱
3. 第4天：用MA104细胞重铺转染的BHK-T7细胞
   1. 用 PBS 冲洗 T75 培养瓶中新鲜汇合的 MA104 细胞单层 2 次。使用胰蛋白酶-EDTA 溶液消化细胞单层，并将细胞重悬于 5 mL 完全 DMEM 培养基中。
   2. 使用自动细胞计数仪和台盼蓝溶液，测定培养基中MA104活细胞的浓度。将细胞浓度调整至8 × 10⁵ 个/mL⁵ MA104 细胞/mL 的 DMEM 不完全培养基中，加入 0.25 mL 悬浮细胞（2 × 10⁵）⁵ 将细胞逐滴加入含有转染的BHK-T7细胞的孔中。
   3. 将0.8 µL浓度为1 mg/mL的胰蛋白酶（猪胰腺型IX）储备液加入每孔，使培养基中胰蛋白酶终浓度调整至约0.5 µg/mL。
      注意：胰蛋白酶储备液应使用 PBS 配制，分装后于 -20 °C 保存。
   4. 使用剩余的MA104细胞制备6孔板，用于第7天扩增重组病毒。接种6孔板时，将重悬的MA104细胞稀释至浓度为1.5 × 10⁵个/mL。⁵ 细胞/mL 的完全 DMEM 培养基，每孔加入 2 mL。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中₂ 培养箱
4. 第7天：从转染细胞中回收并扩增重组病毒
   1. 将12孔板中的BHK-T7/MA104细胞在无菌条件下进行三次冻融循环，将培养板在-20 °C冰箱与室温台面之间转移。将裂解液转移至1.5 mL离心管后，于500 x g离心10分钟 g (4 °C) 离心以沉淀较大的细胞碎片。收集上清液，置于 4 °C 短期保存或 -20 °C 长期保存。
   2. 用 PBS 将 6 孔板中的 MA104 单层细胞（第 4 天制备）洗涤 2 次。每孔加入含 0.5 µg/mL 胰蛋白酶的 2 mL DMEM 不完全培养基。向各孔中加入 300 µL 从 BHK-T7/MA104 细胞裂解物中回收的上清液，将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中₂ 培养箱
   3. 将培养板孵育 7 天，或直至观察到完全的细胞病变效应（CPE）。通过三次冻融循环裂解 6 孔板中的 MA104 细胞，然后将裂解液转移至 1.5 mL 微量离心管中。以 500 × g 离心 10 分钟，沉淀较大的细胞碎片。 g （4 °C）。将澄清的细胞裂解物转移至1.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存。

4. 重组病毒的蚀斑分离

1. 在100 µL澄清的细胞裂解液中加入胰蛋白酶，使其终浓度为10 µg/mL，于37 °C孵育1小时以激活病毒。用不完全DMEM培养基将样品进行10倍系列稀释，稀释梯度从10^-1至10^-7（每管1 mL）。
2. 用2 mL PBS将6孔板中的MA104单层细胞清洗2次，再用不完全DMEM培养基清洗1次。每孔加入400 µL裂解液稀释液，设两个重复。将6孔板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育1小时，每隔10–15分钟轻轻摇动一次，使液体均匀覆盖单层细胞。
3. 通过将等体积的2倍浓度Eagle最小必需培养基（EMEM；预热至37 °C）与1.5%琼脂糖（经微波炉融化并预冷至45 °C的水中制备）混合，配制琼脂糖-MEM覆盖液。将覆盖液置于42 °C水浴中保温，并在加样前立即调整其中胰蛋白酶的终浓度为0.5 µg/mL。
4. 从6孔板中吸除裂解液稀释液，然后用2 mL不完全DMEM培养基轻柔清洗细胞一次。每孔轻柔加入3 mL琼脂糖-MEM覆盖液，覆盖细胞单层。室温下静置使琼脂糖凝固，随后将6孔板放回培养箱继续培养。
5. 三天后，按照步骤4.3的方法配制新的琼脂糖-MEM覆盖液，并将其预热至42 °C。使用前立即向覆盖液中加入中性红，使其终浓度为50 µg/mL（材料表）。
6. 向6孔板中已有的琼脂糖层上方加入2 mL上述覆盖液。待新加入的琼脂糖层凝固后，将6孔板放回培养箱。注意避免含中性红的溶液和培养板暴露于光照条件下。
7. 在接下来的6小时内，借助透射光源观察6孔板中的轮状病毒蚀斑。使用一次性移液器挑取边界清晰的蚀斑，回收贯穿至细胞层的完整琼脂糖小柱。
8. 将琼脂糖小柱排入含有0.5 mL不完全DMEM培养基的1.5 mL离心管中，涡旋振荡30秒。通过在含不完全DMEM培养基和0.5 µg/mL胰蛋白酶的6孔板或T25培养瓶中的MA104单层细胞上连续传代，扩增从蚀斑中洗脱到培养基中的病毒。
   注意：有关通过蚀斑法分离和滴定轮状病毒的更多详细信息，请参见Arnold等人的研究³¹。

5. 病毒双链RNA的凝胶电泳

1. 取600 µL澄清的感染细胞裂解液和400 µL硫氰酸胍，加入1.5 mL微量离心管中，涡旋振荡30秒，室温孵育5分钟。加入200 µL氯仿，涡旋振荡30秒，孵育3分钟。在13,000 x g（4 °C）下离心5分钟后，将约550 µL上层水相转移至新的离心管中。
2. 向水相中加入2倍体积（约900 µL）预冷的异丙醇，翻转离心管4–6次，以回收病毒双链RNA。室温孵育10分钟后，在13,000 x g（4 °C）下离心10分钟。弃去上清液，保留RNA沉淀。
3. 向沉淀中加入1 mL 75%乙醇洗涤，翻转一次，然后在7,500 x g（4 °C）下离心5分钟。用移液器小心吸除乙醇洗涤液后，将RNA沉淀在实验台上静置风干5–10分钟。用15 µL无核酸酶的分子生物学级水溶解RNA沉淀，并于-20 °C保存。
4. 将10 µL溶解的RNA样品与2 µL 6x DNA上样缓冲液混合，上样至预制的10%聚丙烯酰胺微型凝胶（或等效手工制备凝胶），在Tris-甘氨酸电泳缓冲液中以恒定电流（16 mA）进行电泳分离，持续2小时。将凝胶浸入含约1 µg/mL溴化乙锭的水中5–10分钟，使用紫外透射仪检测轮状病毒基因组片段。

6. 病毒双链RNA的回收与测序

1. 在聚丙烯酰胺凝胶上定位病毒双链RNA（dsRNA）条带，最好使用低强度长波长紫外光，以避免产生核酸交联。使用新的剃须刀片切下含有dsRNA条带的凝胶片段，并转移至1.5 mL微量离心管中。
2. 加入10−20 µL无RNase的水后，使用适配1.5 mL微量离心管的无RNase一次性研磨杵将每块凝胶碎片研碎，或通过18号针头反复抽吸使其破碎。将破碎后的凝胶片段在4 °C孵育过夜。
3. 从含有破碎凝胶片段的离心管中回收3 µL液体。使用一步法反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒（材料表）及适当的寡核苷酸引物，对病毒dsRNA进行cDNA合成。
   注意：PCR产物使用PCR纯化试剂盒（材料表）进行凝胶纯化后，连同引物一并送至商业DNA测序服务机构进行加急测序。

7. 病毒蛋白的免疫印迹分析

1. 在6孔板中接种MA104细胞，每孔加入3 × 10⁵个细胞，总体积为2 mL完全DMEM培养基。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中，培养至细胞形成融合单层（3−5天）。
   注意：融合单层的孔板中约含有1.2 × 10⁶个细胞。
2. 将澄清的上清液与10 µg/mL胰蛋白酶在37 °C孵育1小时，以激活其中含有的重组轮状病毒颗粒。
3. 用2 mL PBS对6孔板中的MA104单层细胞冲洗2次。每孔加入200 µL接种物，接种物中含有经胰蛋白酶激活的轮状病毒，病毒量为每细胞3−5个空斑形成单位（PFU），溶于不完全DMEM培养基中。将培养板放回培养箱。
4. 每隔10分钟取出培养板，轻轻摇动以使接种物在细胞单层上均匀分布。1小时后，弃去接种物，每孔加入2 mL不完全DMEM培养基。
5. 感染后8小时，用PBS对6孔板中的细胞冲洗2次。将细胞用750 µL PBS刮下，转移至1.5 mL微量离心管中。再用750 µL PBS冲洗培养板一次，将洗液与前次收集的750 µL样本合并。
6. 在4 °C下以5,000 × g离心10分钟，沉淀细胞。弃去上清液后，将细胞沉淀在−80 °C保存，待后续处理。
7. 配制细胞裂解缓冲液：含300 mM NaCl、100 mM Tris-HCl（pH 7.4）、2% Triton X-100和1×无EDTA的完全蛋白酶抑制剂。向冻存的细胞沉淀中加入300 µL裂解缓冲液，短暂涡旋混匀后，冰上孵育10分钟。
8. 重复涡旋并冰上孵育操作3次。随后在4 °C下以15,000 × g离心10分钟，收集上清液并保存于−80 °C。
9. 取20 µL上清液样本，使用预制的线性8−16%聚丙烯酰胺微型凝胶进行电泳分离，并转印至硝酸纤维素膜。用含5%脱脂奶粉的PBS-Tween 20（0.02%）溶液封闭膜。
10. 将膜与一种或多种一抗孵育（例如：豚鼠抗NSP3或多抗VP6抗血清、小鼠单克隆抗Flag M2抗体或兔单克隆抗PCNA抗体）。使用辣根过氧化物酶标记的二抗（如马抗小鼠IgG、抗豚鼠IgG或山羊抗兔IgG）孵育膜以检测一抗，随后加入增强型化学发光（ECL）底物。使用凝胶成像系统（材料表）或X射线胶片检测发光信号。

8. 表达荧光蛋白病毒的感染细胞的活细胞成像

1. 在6孔板中每孔接种3 × 10⁵个MA104细胞，加入总量为2 mL的完全DMEM培养基。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中，培养至细胞形成融合单层（3−5天）。
   注意：形成融合单层的孔中细胞数量约为1.2 × 10⁶个。
2. 将已知滴度的轮状病毒样本在37 °C下用10 µg/mL胰蛋白酶孵育1小时，以进行活化。
3. 用2 mL PBS对含有MA104单层细胞的6孔板清洗2次。每孔加入200 µL接种液，其中含有经胰蛋白酶活化的轮状病毒，感染复数为3−5 PFU/细胞，接种液使用无血清DMEM培养基配制。将培养板放回培养箱，并每隔10分钟轻轻摇动培养板，使接种液均匀覆盖细胞单层。
   注意：应设置对照孔，加入不含病毒的无血清DMEM接种液进行假感染。
4. 病毒吸附1小时后，用PBS清洗单层细胞2次，每孔更换0.5 mL无血清DMEM培养基。感染后7.5小时，更换为低自发荧光背景的DMEM培养基（材料表）。感染后8小时，使用活细胞成像仪在20倍放大下观察细胞中绿色、红色或蓝色荧光信号。

结果

本文所述的反向遗传学实验方案包含多个独立步骤：（1）将轮状病毒pT7转录载体和pCMV/NP868R表达质粒共转染至BHK-T7细胞；（2）用MA104细胞过量接种转染后的BHK-T7细胞；（3）利用MA104细胞扩增存在于BHK-T7/MA104细胞裂解液中的重组病毒；（4）使用MA104细胞进行重组病毒的空斑分离（图2）。据我们经验，该方案效率较高，在BHK-T7/MA104细胞裂解液中可获得约10⁴ PFU/mL的重组野生型SA11病毒（rSA11/wt）滴度，在扩增后的MA104细胞裂解液中滴度可达>1 × 10⁷ PFU/mL。通过反向遗传学方法，使用表达荧光蛋白（FP）的修饰型pT7/NSP3SA11质粒（例如rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG）所生成的SA11重组病毒，其滴度约为rSA11/wt的1/4。

根据反向遗传学实验方案，我们成功构建了重组SA11病毒，这些病毒可在MA104细胞上通过空斑实验轻松识别，从而实现空斑分离（

讨论

在我们的实验室中，我们常规依赖本文所述的反向遗传学方案来制备重组SA11轮状病毒。采用该方法，即使缺乏分子生物学技术或轮状病毒操作经验的研究人员，也能在首次尝试时成功获得重组病毒。我们已根据该方案成功构建了近100种重组病毒，其中包括基因组经过重新改造以表达外源蛋白（例如荧光蛋白，FPs）的病毒，以及含有序列插入、缺失和点突变的病毒。

本方案中提供的条件和孵育时间适用于生长良好的重组病毒株的回收。若尝试回收由于基因改造可能导致生长不良的SA11病毒，则应考虑进行调整。特别是，由于此类病毒在转染的BHK-T7/MA014细胞裂解物中的滴度可能较低，我们通常会将后续扩增步骤中用作接种物的裂解物体积加倍。此外，在扩增步骤中，生长缓慢的病毒可能需要更长的孵育时间，才能达到足以收获细胞的细胞病变效应（CPE）水平。实际上，对于这类病毒，我们可能会让感染持续10−14天，甚至更长时间，然后再收获细胞。最后，生长不良的病毒在MA104细胞上可能形成较小且生长缓慢的蚀斑。因此，为了对这些病毒进行蚀斑分离，可能需要在感染后6−10天待蚀斑充分发育后，再用中性红染色细胞并挑取蚀斑。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
幼仓鼠肾-T7 RNA依赖性RNA聚合酶（BHK-T7）细胞			联系人：ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺迷你凝胶	Bio-Rad	45608105
Cellometer AutoT4 活细胞计数仪	Nexcelom
ChemiDoc MP 凝胶成像系统	Bio-Rad
氯仿	MP	194002
Clarity Western 增强型化学发光（ECL）底物	Bio-Rad	170-5060
感受态大肠杆菌DH5α菌株	Lucigen	60602-2
完全蛋白酶抑制剂	Pierce	A32965
一次性移液管，超细延长尖端	MTC Bio	P4113-11
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Lonza	12-604F
伊格尔最低必需培养基，2倍浓度（2xEMEM）	Quality Biological	115-073-101
乙醇，无水（200 proof）	Fisher Bioreagents	BP2818-500
溴化乙锭溶液（10 mg/ml）	Invitrogen	15585-011
胎牛血清（FBS）	Corning	35-010-CV
胎牛血清（FBS），热灭活	Corning	35-011-CV
Flag M2 抗体，小鼠单克隆	Sigma-Aldrich	F1804
GenEluate HP 质粒中量提取试剂盒	Sigma	NA0200-1KT
遗传霉素（G-418）	Invitrogen	10131-027
Gibco FluroBrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	低背景荧光的DMEM
格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）	Gibco	11710-035
山羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶（HRP）标记	Cell-Signaling Technology	7074S
豚鼠抗NSP3抗血清	Patton 实验室	批号 55068
豚鼠抗VP6抗血清	Patton 实验室	批号 53963
马抗豚鼠IgG，辣根过氧化物酶（HRP）标记	KPL	5220-0366
马抗小鼠IgG，辣根过氧化物酶（HRP）标记	Cell-Signaling Technology	7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco 支原体PCR检测试剂盒	JH Science	25235
异丙醇	Macron	3032-02
L-谷氨酰胺溶液（100倍浓度）	Gibco	25030-081
LB琼脂粉（Miller's LB Agar）	RPI 研究产品	L24020-2000.0
199号培养基（M199）培养液	Hyclone	Sh30253.01
最低必需培养基 - 伊格尔Joklik配方（SMEM）	Lonza	04-719Q
猴肾（MA104）细胞	ATCC	ATCC CRL-2378.1
NanoDrop One 分光光度计	ThermoScientific
中性红溶液（0.33%）	Sigma-Aldrich	N2889-100ml
非必需氨基酸溶液（100倍浓度）	Gibco	11140-050
Novex 10% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺迷你凝胶	Invitrogen	XP00102BOX
无核酸酶分子生物学级水	Invitrogen	10977-015
NucleoSpin 凝胶与PCR产物纯化试剂盒	Takara	740609.25
Opti-MEM 减血清培养基	Gibco	31985-070
研磨杵（无RNase，一次性）	Fisher	12-141-368
青霉素-链霉素溶液（100倍浓度，penn-strep）	Corning	30-002-Cl
磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓度	Fisher Bioreagents	BP399-20
猪胰蛋白酶，IX-S型	Sigma-Aldrich	T0303
PureYield 质粒微量提取系统	Promega	A1223
Qiagen 质粒大量提取试剂盒	Qiagen	12162
Qiagen 质粒中量提取试剂盒	Qiagen	12143
QIAprep 离心柱式微量提取试剂盒	Qiagen	27104
SA11 pT7 转录载体	Addgene	89162-89172
表达荧光蛋白的SA11 pT7/NSP3转录载体			联系人：jtpatton@iu.edu
SeaKem LE 琼脂糖	Lonza	50000	用于凝胶电泳
SeaPlaque 琼脂糖	Lonza	50100	用于蚀斑试验
Superscript III 一步法RT-PCR试剂盒	Invitrogen	12574-035
Trans-Blot Turbo 硝酸纤维素转移试剂盒	Bio-Rad	170-4270
Trans-Blot Turbo 转膜系统	Bio-Rad
TransIT-LTI 转染试剂	Mirus	MIR2306
Tris-甘氨酸-SDS凝胶电泳缓冲液（10倍浓度）	Bio-Rad	161-0772
吐温X-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Trizol RNA提取试剂	Ambion	15596026
台盼蓝	Corning	25-900-CI
胰蛋白酶（0.05%）-EDTA（0.1%）细胞解离液	Quality Biological	118-087-721
胰蛋白胨磷酸盐肉汤	Gibco	18050-039
吐温-20	VWR	0777-1L
Vertrel VF 溶剂	Zoro	G0707178
Zoe 荧光活细胞成像仪	Bio-Rad