我们介绍一种利用原子力显微镜（AFM）在细胞水平上研究关节软骨早期骨关节炎变化的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细胞和组织的生物力学特性不仅调控其形态和功能，而且对维持其活力至关重要。弹性变化可能传播或触发癌症或骨关节炎（OA）等重大疾病的发生。原子力显微镜（AFM）已成为一种强有力的工具，可在微观尺度上对特定生物靶结构的生物力学特性进行定性和定量表征，测量范围从小至皮牛顿到微牛顿的力。生物力学特性在承受高强度应变的肌肉骨骼组织中尤为重要。骨关节炎作为一种软骨退行性疾病，会导致软骨细胞周围基质（PCM）的破坏以及嵌入其细胞外基质（ECM）中的软骨细胞发生空间重排。PCM和ECM的破坏已与软骨生物力学特性的改变相关联。在本研究中，我们利用AFM量化这些变化，并将其与软骨细胞特定的空间模式变化相关联。随着每种模式的变化，PCM和ECM的弹性均出现显著改变。因此，测量局部弹性可直接推断OA中局部组织退变的程度。
引言
关节软骨是一种无血管、无神经的组织。软骨细胞稀疏地分布于其中，负责产生、组织并维持其自身所嵌入的大量细胞外基质（ECM）。作为ECM中独特且特化的部分，软骨细胞周围被一层薄而特化的基质所包绕，称为软骨细胞周基质（PCM）。PCM作为一种机械敏感性的细胞-基质界面1，可保护软骨细胞2，并调节其生物合成反应3。如先前所述4，在健康软骨中，软骨细胞按照特定且分明的空间模式排列，这种模式因组织层次和关节类型而异4,5，并依赖于关节特异性的机械负荷机制6。这些排列模式在健康软骨中表现为成对或串状结构，而在骨关节炎（OA）发生时转变为双串状结构。随着疾病进一步进展，软骨细胞形成小簇，并逐渐增大，最终在晚期OA中形成大簇。在OA终末期，可观察到组织结构的完全丧失以及细胞凋亡的诱导。因此，软骨细胞的排列方式可作为基于影像学的OA进展生物标志物4。
细胞和组织的生物力学特性不仅调控其形态和功能，而且对于维持其活力也至关重要。弹性变化可能传播或触发癌症或骨关节炎（OA）等重大疾病的发生。原子力显微....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
人软骨样本取自德国蒂宾根大学医院骨科和德国罗滕堡 a.N. Winhofer 医院因终末期膝骨关节炎接受全膝关节置换术的患者。研究开始前已获得相关部门、机构及当地伦理委员会的批准（项目编号 674/2016BO2）。所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。研究方法均严格遵循经批准的指导原则进行。
1. 样品制备
- 准备软骨以进行冷冻切片
- 为评估膝关节的退行性改变，从患者组织切除术后获得的股骨髁负重区采集关节软骨样本。
注意：待检测的样本应至少保留一层薄薄的软骨下骨，以便清晰识别组织相对于内表面和外表面的方向，从而实现对最表层软骨组织的标准化取材。软骨组织可在手术后24小时内用于原子力显微镜（AFM）检测。使用前，组织可保存在无血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，添加2%（v/v）青霉素-链霉素和1.2%（v/v）两性霉素B。然而，若样本保存超过24小时，可能因组织肿胀而在AFM检测中产生伪影。 - 用手术刀将关节软骨整体从软骨下骨分离，随后将软骨样本包埋于冷冻切片机旋钮上的水溶性包埋介质中，置于冷冻切片机内低温冷冻。
注意：冷冻介质可稳定其包裹的组织，同时使软骨样本与包埋介质一同冻结。从骨组织上切割软骨时，需注意追踪组织的方向。用于冷冻切片的组织包埋时必须确保软骨的顶层（即关节表面）朝向刀刃。注意组织必须完全被包埋介质覆盖。
<.... - 为评估膝关节的退行性改变，从患者组织切除术后获得的股骨髁负重区采集关节软骨样本。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在从单串、双串到小簇，最终到大簇的病理生理学模型中，细胞外基质（ECM）（图3A）和周细胞基质（PCM）（图3B）的弹性模量在每种模式转变之间均显著下降。唯一的例外是单串与双串之间ECM的差异（p = 0.072）。结果显示，ECM/PCM比值（图4B）未发生显著变化，而ECM与PCM之间弹性绝对差异则明显减小（图4A）。此外，结果未显示ECM/PCM比值与相关细胞空间变化之间存在显著关联（r = -0.099，p = 0.281）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
利用原子力显微镜（AFM）这一新颖而强大的技术，在纳米尺度上测量生物材料的生物力学特性，我们测定了人骨关节炎关节软骨中细胞外基质（ECM）和软骨细胞周基质（PCM）的弹性特性。根据软骨细胞空间排列的主要模式——作为局部组织退变的基于图像的生物标志物——选取软骨样本。正如预期，随着软骨细胞空间重排的进展，ECM和PCM的弹性值均显著下降。这些观察结果明确表明，软骨细胞空间排列的异常不仅与细胞微环境（PCM）弹性性质的变化相关，也与整个软骨组织（ECM）的改变密切相关。此外，尽管在骨关节炎（OA）过程中PCM和ECM的弹性模量发生了显著变化，ECM/PCM比值却未表现出明显改变。这些发现提示，ECM与PCM机械性能的变化是单向且同步发生的，这意味着PCM和ECM的进行性破坏本质可能相似。因此，OA的发生与发展会引发显著的PCM和ECM降解，并最终导致其破坏。这两种基质的丧失均伴随着关节软骨生物力学性能（如弹性）的显著下降，本研究已证实了这一点。这突显了软骨细胞空间排列在反映生物力学特性方面的功能相关性；反之，也使我们能够通过局部弹性测量来推断局部占主导地位的空间模式，从而评估软骨的局部组织退变程度。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢原始出版物的共同作者们提供的帮助与支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 两性霉素B | Merck | A2942 | |
| 原子力显微镜（AFM） | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM探头组件 | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| 生物相容性样品胶 | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| 悬臂梁 | 探针C，k ¼ 7.4 N/m，All-In-One-AleTl，Budget Sensors，Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| 倒置相差显微镜（与AFM集成） | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| 不含L-谷氨酰胺的勒博维茨L-15培养基 | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| 微球 | Polysciences | 07313-5 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333 | |
| 与AFM配套的培养皿加热装置 | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| 手术刀片 | Feather | 2023-01 | |
| 组织培养皿 | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| 组织基质包埋剂（Tissue-tek O.C.T. Compound） | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
参考文献
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
