我们介绍一种利用原子力显微镜（AFM）在细胞水平上研究关节软骨早期骨关节炎变化的方法。
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摘要
摘要
细胞和组织的生物力学特性不仅调控其形态和功能，而且对维持其活力至关重要。弹性变化可能传播或触发癌症或骨关节炎（OA）等重大疾病的发生。原子力显微镜（AFM）已成为一种强有力的工具，可在微观尺度上对特定生物靶结构的生物力学特性进行定性和定量表征，测量范围从小至皮牛顿到微牛顿的力。生物力学特性在承受高强度应变的肌肉骨骼组织中尤为重要。骨关节炎作为一种软骨退行性疾病，会导致软骨细胞周围基质（PCM）的破坏以及嵌入其细胞外基质（ECM）中的软骨细胞发生空间重排。PCM和ECM的破坏已与软骨生物力学特性的改变相关联。在本研究中，我们利用AFM量化这些变化，并将其与软骨细胞特定的空间模式变化相关联。随着每种模式的变化，PCM和ECM的弹性均出现显著改变。因此，测量局部弹性可直接推断OA中局部组织退变的程度。
引言
关节软骨是一种无血管、无神经的组织。软骨细胞稀疏地分布于其中，负责产生、组织并维持其自身所嵌入的大量细胞外基质（ECM）。作为ECM中独特且特化的部分，软骨细胞周围被一层薄而特化的基质所包绕，称为软骨细胞周基质（PCM）。PCM作为一种机械敏感性的细胞-基质界面1，可保护软骨细胞2，并调节其生物合成反应3。如先前所述4，在健康软骨中，软骨细胞按照特定且分明的空间模式排列，这种模式因组织层次和关节类型而异4,5，并依赖于关节特异性的机械负荷机制6。这些排列模式在健康软骨中表现为成对或串状结构，而在骨关节炎（OA）发生时转变为双串状结构。随着疾病进一步进展，软骨细胞形成小簇，并逐渐增大，最终在晚期OA中形成大簇。在OA终末期，可观察到组织结构的完全丧失以及细胞凋亡的诱导。因此，软骨细胞的排列方式可作为基于影像学的OA进展生物标志物4。
细胞和组织的生物力学特性不仅调控其形态和功能，而且对于维持其活力也至关重要。弹性变化可能传播或触发癌症或骨关节炎（OA）等重大疾病的发生。原子力显微镜（AFM）已成为一种强大的工具，可在微观尺度上对特定生物目标结构的生物力学特性进行定性和定量表征，测量范围涵盖从皮牛顿到微牛顿的广泛作用力。AFM 的主要应用是在亚纳米分辨率下测量样品的表面形貌和机械性能7。该测量装置由三个主要部分组成：1）AFM 探针，即安装在悬臂上的尖锐探针，用于与样品表面直接相互作用。当力施加到悬臂上时，悬臂会根据被测组织的特性发生形变。2）光学系统，将激光束投射到悬臂上，随后反射至检测单元。3）光电二极管检测器，用于接收来自悬臂反射的光信号，并将悬臂引起的激光偏转信息转换为可分析的力-距离曲线。
因此，原子力显微镜（AFM）的基本原理是检测AFM探针与样品目标结构之间相互作用力。所获得的力曲线可描述样品表面目标结构的机械特性，如弹性、电荷分布、磁化、屈服应力以及弹塑性变形动力学8。相较于其他成像技术，AFM的一个重要优势在于其能够在不损伤组织的前提下，直接在培养基或原生状态下对活细胞或组织的机械性能进行测量。AFM既可在液体环境中运行，也可在干燥条件下操作，且无需复杂的样品制备过程。AFM能够在接近生理条件的情况下，对样品进行成像并同时测定其机械性能。在本研究中，我们描述了一种通过测量天然关节软骨中软骨细胞周基质（PCM）和细胞外基质（ECM）弹性来评估骨关节炎（OA）进展的新方法。软骨细胞空间排列方式与局部组织退变程度之间的相关性，为OA的早期检测提供了全新的视角。然而，这些模式的功能意义迄今尚未得到评估。由于关节软骨的主要功能是在低摩擦条件下承受负荷，因此该组织必须具备良好的弹性特性。AFM不仅能够测量ECM的弹性，还能检测嵌入其PCM中的软骨细胞空间分布模式的弹性。所观察到的弹性与软骨细胞空间模式变化之间的相关性非常显著，仅通过测量弹性即可实现对局部组织退变程度的分层评估。
使用集成在倒置相衬显微镜中的原子力显微镜（AFM）系统，在35 µm厚的切片上评估了软骨细胞周围基质（PCM）和细胞外基质（ECM）的弹性模量，该系统可同时可视化软骨样本。本实验方案基于我们实验室已发表的研究9，具体描述了如何表征软骨细胞的空间排列，以及如何测量其周围基质（PCM）和细胞外基质（ECM）的弹性。随着软骨细胞排列模式的每一次变化，PCM和ECM的弹性均会出现显著改变，因此该技术可用于直接测量软骨退变的阶段。
这种经过验证的方法为在宏观组织降解实际出现之前早期评估骨关节炎（OA）的进展及治疗效果开辟了新途径。一致地进行原子力显微镜（AFM）测量是一个艰巨的过程。在以下方案中，我们描述了如何准备用于AFM测量的样品，如何从悬臂梁的准备开始进行实际的AFM测量，如何校准AFM，以及随后如何执行测量步骤。逐步说明提供了获取可靠数据的清晰而简洁的方法，并给出了数据处理与解释的基本策略。讨论部分还介绍了该严格方法中最常见的陷阱，并提供了有益的故障排除建议。
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方案
人软骨样本取自德国蒂宾根大学医院骨科和德国罗滕堡 a.N. Winhofer 医院因终末期膝骨关节炎接受全膝关节置换术的患者。研究开始前已获得相关部门、机构及当地伦理委员会的批准（项目编号 674/2016BO2）。所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。研究方法均严格遵循经批准的指导原则进行。
1. 样品制备
- 准备软骨以进行冷冻切片
- 为评估膝关节的退行性改变，从患者组织切除术后获得的股骨髁负重区采集关节软骨样本。
注意：待检测的样本应至少保留一层薄薄的软骨下骨，以便清晰识别组织相对于内表面和外表面的方向，从而实现对最表层软骨组织的标准化取材。软骨组织可在手术后24小时内用于原子力显微镜（AFM）检测。使用前，组织可保存在无血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，添加2%（v/v）青霉素-链霉素和1.2%（v/v）两性霉素B。然而，若样本保存超过24小时，可能因组织肿胀而在AFM检测中产生伪影。 - 用手术刀将关节软骨整体从软骨下骨分离，随后将软骨样本包埋于冷冻切片机旋钮上的水溶性包埋介质中，置于冷冻切片机内低温冷冻。
注意：冷冻介质可稳定其包裹的组织，同时使软骨样本与包埋介质一同冻结。从骨组织上切割软骨时，需注意追踪组织的方向。用于冷冻切片的组织包埋时必须确保软骨的顶层（即关节表面）朝向刀刃。注意组织必须完全被包埋介质覆盖。
- 为评估膝关节的退行性改变，从患者组织切除术后获得的股骨髁负重区采集关节软骨样本。
- 软骨的冷冻切片
- 使用标准冷冻切片机，从包埋于冷冻水溶性包埋介质中的关节软骨最表层（即关节面）开始，以35 µm厚度对组织进行切片。
注意：总共最多可切取并用于分析的组织切片厚度可达 300 µm（约对应 9 个切片）。建议的 300 µm 限制值对应于荧光显微镜在透明软骨（如关节软骨）中通常可达到的视觉穿透深度。因此，可根据局部主要的空间分布模式对软骨进行分类，并在相应的切片中测量这些模式。 - 将切片收集到载玻片上，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，以去除水溶性包埋介质。
- 使用标准冷冻切片机，从包埋于冷冻水溶性包埋介质中的关节软骨最表层（即关节面）开始，以35 µm厚度对组织进行切片。
- 将软骨切片粘附至与原子力显微镜兼容的培养皿上
注意：由于原子力显微镜（AFM）通过机械压痕方式对样品进行数据采集，因此需要将样品切片固定到位，以实现精确测量。- 将35 µm厚的切片用生物相容性样本胶轻轻粘附到与原子力显微镜（AFM）设备兼容的组织培养皿上。操作时，取2−3滴胶水，滴在组织培养皿上预定切片边缘所处的位置。随后将软骨切片置于胶水上，使其牢固粘附于组织培养皿表面。
注意：透明关节软骨的35 µm厚切片不易卷曲。然而，若在将样本从缓冲液中取出时发生卷曲，请确保尽可能减少液体附着在样本上。待多余水分干燥后，立即将组织平铺于细胞培养皿表面已点状分布的胶液区域，使其固定。胶液仅需薄薄地涂在样本边缘，不可覆盖整个切片区域。测量时仅选取远离黏胶区域的样本部分，以避免胶质对测量结果造成干扰。 - 在室温（RT）下孵育切片 2 分钟，以使胶水与组织充分结合。随后用不含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的 Leibovitz's L-15 培养基覆盖切片，确保完全浸没。
注意：固定过程中样本的突然移动或胶水涂抹不足是导致组织从培养皿上脱落的常见错误。此外，加入Leibowitz培养基时应轻柔操作，以免因液体冲击导致样本从表面脱落 "波浪" 由培养基产生 - 将带有粘附切片的培养皿置于37 °C的标准细胞培养孵育箱中，直至进行测量。
注意：进行每一步操作时应缓慢进行，以确保组织切片保持稳定，不会从培养皿表面脱落。
- 将35 µm厚的切片用生物相容性样本胶轻轻粘附到与原子力显微镜（AFM）设备兼容的组织培养皿上。操作时，取2−3滴胶水，滴在组织培养皿上预定切片边缘所处的位置。随后将软骨切片置于胶水上，使其牢固粘附于组织培养皿表面。
2. 悬臂梁制备（粘附微球）
- 准备原子力显微镜（AFM）设备并稀释微球
- 将悬臂放置在专用于空气测量的玻璃块上，用弹簧固定，并将玻璃块安装到AFM探头中。
- 将微球用100%乙醇稀释（100个微球/10 µL），超声处理10秒，以确保微球彼此分离，不发生团聚。
- 准备粘接装置
- 用70%乙醇清洁载玻片，并将其安装在AFM设备的样品台上。
注：清洁载玻片可防止灰尘颗粒附着在其表面，从而干扰后续的粘接过程。 - 在载玻片中央滴加2 µL微球悬浮液，在靠近微球悬浮液的位置滴加2 µL胶水。
注：建议将微球悬浮液与胶水放置得较近，以便悬臂在胶水和微球之间快速转移。若悬臂从胶水中蘸取后到接触微球的时间过长，胶水会逐渐硬化，从而失去粘附性能。 - 让微球悬浮液中的乙醇自然挥发干燥，使微球保留在原位。
- 用70%乙醇清洁载玻片，并将其安装在AFM设备的样品台上。
- 将微球粘接到悬臂尖端
- 借助步进电机以10 µm为步长，手动将悬臂浸入胶水中，直至尖端被胶水覆盖。此步骤需迅速完成，因为胶水干燥较快。
- 将悬臂回撤100 µm，移动至微球附近，并将悬臂尖端准确定位于单个微球正上方。
- 运行力谱测量程序，按照表1所示参数将悬臂尖端压向选定的微球。
注：通过该步骤，利用对微球表面的测量来确认悬臂尖端与微球之间的接触。如表1所示的相对较长的接触时间，可为胶水与微球之间提供充足的结合时间。此步骤中获得的力-距离曲线是将微球粘接到悬臂尖端过程中的副产品，不用于后续分析。 - 一旦微球成功附着于悬臂上，先将带有悬臂的玻璃块回撤，然后将AFM探头从显微镜上取下。最后，将玻璃块和悬臂从AFM探头上卸下。
- 将悬臂在65 °C下孵育2小时，随后在室温下过夜干燥，再开始后续测量。
注：对悬臂进行孵育可增强胶水的粘附性能，使悬臂-微球复合体更加稳定。
3. 准备用于测量的原子力显微镜设备
- 将专用于液体环境测量的玻璃块调整至原子力显微镜（AFM）支架上，使其上表面平整并与AFM支架平行。
- 使用镊子小心地将选定的悬臂固定在玻璃块表面，使带有微球的AFM针尖突出于抛光的光学平面之外。
注意：悬臂针尖必须突出于抛光平面，以便将AFM的激光反射至光电探测器。放置悬臂时需格外小心，避免划伤玻璃块的抛光光学表面。划伤玻璃块可能导致激光对准困难，并干扰后续测量。 - 由于悬臂将承受机械压力，因此需要将其固定。使用镊子将金属弹簧滑入玻璃块的凹槽中，并用弹簧夹紧悬臂顶部，以在玻璃块上稳定悬臂。
- 小心地将装有悬臂的玻璃块放置在AFM探头端，并使用集成锁定机构固定。确保弹簧朝向左侧，以便悬臂处于正确方向。然后将装有悬臂的AFM探头安装到AFM设备上。
4. 样品加载与悬臂梁的校准
注意：此处通过在装有Leibovitz培养基但无样本组织的培养皿清洁表面进行力曲线扫描来完成仪器校准。也可使用单独的对照原子力显微镜（AFM）培养皿进行校准，该培养皿仅含有AFM培养基而不含样本。
- 将样品安装到原子力显微镜（AFM）设备上
- 将步骤 1.3.3 中准备好的培养皿放置在 AFM 样品台上。
- 打开培养皿加热器，并将其设定为 37 °C，使组织培养皿达到最佳温度（即约 20 分钟）。
- 在悬臂组件底部覆盖保护膜，以防止培养基在 AFM 探头中冷凝。
- 设备校准
- 启动软件（材料表），随后打开激光对准窗口和显示接近参数设置的窗口。然后开启步进电机、激光光源和 CCD 相机。
- 使用显微镜上的 CCD 相机观察并识别悬臂。利用步进电机功能，以 100 µm 为步长降低悬臂，直至其完全浸入液体中。
注：通过 CCD 相机可直观观察悬臂是否进入液体。当悬臂尖端接触液面时，会在水中产生明显的环形反射。 - 使用调节螺丝将激光对准悬臂顶部。
注：切勿过度旋转螺丝，以免损坏激光对准机构。悬臂从下方观察，激光束来自上方。 - 激光定位到悬臂后，使用 AFM 设备上的螺丝调节激光束，使反射光束落在光电探测器的中心位置。同时使用激光对准功能持续监测激光束的位置。
注：探测器接收由悬臂反射的激光束的偏转，并将其转换为电信号。 - 完成激光与悬臂的对准后，总和信号应达到 1 V 或以上，而横向和纵向偏转应接近 0。若未达到该值，需调节光电探测器。
- 获取校准力曲线
- 为到达 AFM 培养皿表面并开始测量，使用 表 2 中给出的参数运行扫描器的 接近 程序。当到达组织培养皿底部时，将悬臂回撤 100 µm。
注：此时探针恰好位于组织培养皿底部上方 100 µm 处。 - 设置 运行 参数，并调整 表 3 中列出的参数。点击 运行 按钮开始测量，以获得校准力-距离曲线。
注：此处获得的力曲线如 图 1 所示。 - 在校准力-距离曲线上，选择软件中回撤曲线部分进行线性拟合的区域。
注：进行线性拟合是为了测量悬臂的灵敏度。一旦完成线性拟合，相关数值将由软件自动保存。随后软件将计算悬臂的弹簧常数或热噪声。 - 由于测量是在 37 °C 的培养基中进行的，应在软件中将温度变量设为 37 °C，以尽可能模拟生理条件。
注：校准完成后，纵向偏转将以力的单位牛顿（N）保存和显示，而非光电二极管探测器原始记录中的电压（V）单位。
- 为到达 AFM 培养皿表面并开始测量，使用 表 2 中给出的参数运行扫描器的 接近 程序。当到达组织培养皿底部时，将悬臂回撤 100 µm。
5. 通过原子力显微镜进行弹性测量对细胞外基质和软骨细胞周基质进行生物力学表征
- 识别软骨切片中的软骨细胞排列模式
- 在集成于原子力显微镜（AFM）系统中的相差显微镜下观察软骨切片，并识别来自骨关节炎膝关节关节软骨的特定细胞排列模式10：单串状（健康组织区域）、双串状（组织退变初期）、小簇状和大簇状（均为组织严重退变区域）。见图2A–D。
- 确定特定目标模式后，针对每种基质类型（PCM 或 ECM）中选定的每种模式测量两个位点，并在每个测量位点进行九次重复测量（图2E,F）。确保样本量足够大，以消除可能存在的测量误差。
注意：进行 PCM 测量时，将悬臂探针置于细胞附近（如图2E,F中的红色圆圈所示）。若需测量 ECM，则选择无细胞区域（如图2E,F中的蓝色区域所示），并按照步骤 5.2 所述进行压痕操作。
- 对目标位点进行压痕测试
- 执行Approach操作，随后回撤，使悬臂位于组织上方 100 µm 处，作为后续测量的起始位置。
- 聚焦于待测模式的 PCM 或 ECM 区域，并将计算机鼠标光标固定在该位置。
注意：鼠标光标将作为压痕目标位点的视觉标记。一旦焦点切换至探针尖端，组织结构将变得难以分辨或模糊不清。 - 现在切换至探针聚焦，移动探针尖端至先前由鼠标箭头标记的位置。随后使用悬臂校准所得的设定值参数，点击RUN开始测量。
注意：测量单串状结构 PCM 所得的典型力-距离曲线见补充图1。
6. 数据处理
注意：弹性模量的数据分析或测定采用此前所述的赫兹模型进行11,12。由于探针尖端使用了微球，压头形状为球形，且根据以往文献，泊松比保持为0.513,14,15。
- 打开与原子力显微镜（AFM）设备所获取数据兼容的数据处理软件（材料表）。
- 在软件中选择赫兹（Hertz）模型以处理力-距离曲线。将泊松比设为0.5，并选择探针形状为球形，探针半径为12.5 µm。
- 所有参数调整完毕后，软件将对结果进行拟合，并计算和显示杨氏模量。
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结果
在从单串、双串到小簇，最终到大簇的病理生理学模型中，细胞外基质（ECM）（图3A）和周细胞基质（PCM）（图3B）的弹性模量在每种模式转变之间均显著下降。唯一的例外是单串与双串之间ECM的差异（p = 0.072）。结果显示，ECM/PCM比值（图4B）未发生显著变化，而ECM与PCM之间弹性绝对差异则明显减小（图4A）。此外，结果未显示ECM/PCM比值与相关细胞空间变化之间存在显著关联（r = -0.099，p = 0.281）。
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讨论
利用原子力显微镜（AFM）这一新颖而强大的技术，在纳米尺度上测量生物材料的生物力学特性，我们测定了人骨关节炎关节软骨中细胞外基质（ECM）和软骨细胞周基质（PCM）的弹性特性。根据软骨细胞空间排列的主要模式——作为局部组织退变的基于图像的生物标志物——选取软骨样本。正如预期，随着软骨细胞空间重排的进展，ECM和PCM的弹性值均显著下降。这些观察结果明确表明，软骨细胞空间排列的异常不仅与细胞微环境（PCM）弹性性质的变化相关，也与整个软骨组织（ECM）的改变密切相关。此外，尽管在骨关节炎（OA）过程中PCM和ECM的弹性模量发生了显著变化，ECM/PCM比值却未表现出明显改变。这些发现提示，ECM与PCM机械性能的变化是单向且同步发生的，这意味着PCM和ECM的进行性破坏本质可能相似。因此，OA的发生与发展会引发显著的PCM和ECM降解，并最终导致其破坏。这两种基质的丧失均伴随着关节软骨生物力学性能（如弹性）的显著下降，本研究已证实了这一点。这突显了软骨细胞空间排列在反映生物力学特性方面的功能相关性；反之，也使我们能够通过局部弹性测量来推断局部占主导地位的空间模式，从而评估软骨的局部组织退变程度。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢原始出版物的共同作者们提供的帮助与支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 两性霉素B | Merck | A2942 | |
| 原子力显微镜（AFM） | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM探头组件 | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| 生物相容性样品胶 | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| 悬臂梁 | 探针C，k ¼ 7.4 N/m，All-In-One-AleTl，Budget Sensors，Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| 倒置相差显微镜（与AFM集成） | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| 不含L-谷氨酰胺的勒博维茨L-15培养基 | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| 微球 | Polysciences | 07313-5 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333 | |
| 与AFM配套的培养皿加热装置 | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| 手术刀片 | Feather | 2023-01 | |
| 组织培养皿 | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| 组织基质包埋剂（Tissue-tek O.C.T. Compound） | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
参考文献
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